Differenzierung von embryonalen Stammzellen <ol><li> Sammle in der Nähe konfluenten Flasche von embryonalen Stammzellen (ESC) über die Behandlung mit ESC Trypsin. </li><li> Die Zellen in 5 ml Differenzierung Medien und Übertragung auf einen Nicht-Gelatine beschichteten T25. Bei 37 ° C für 45 Minuten. Abrufen Überstand sammeln und Zellen über Zentrifugation. Hinweis: Maus embryonale Fibroblasten (MEFs) aus dem ESC Kulturen legen leicht zu den Nicht-Gelatine beschichteten T25 und damit aus der Kultur während dieser Beschichtung Schritt erschöpft. Wenn Sie nicht Ihre Kultivierung ESC auf MEFs sind, können Sie überspringen die pre-Platte. </li><li> Resuspendieren MEF-abgereicherten ESC in Abgrenzung Medien bei 333.333 Zellen/50 mL. Diese Konzentration führt in 100 mL ESC/15. </li><li> Einsatz von Multi-Kanal-Pipette, Platte ESC bei 100 cells/15 mL Tropfen auf 15 cm 2 Petrischalen. Mit einer 8-Kanal Pipette, sollte es möglich sein, über 18-22 Reihen von Tropfen pro Platte (ca. 5 ml pro Platte) passen. Hinweis: Für dieses Protokoll, 2-5 15 cm 2 Gerichte der Tropfen wird mehr als ausreichend und sollte 2-5 x 10 6 Tag sechs EB-abgeleiteten Zellen zu erhalten. </li><li> Gently Flip Platten Tropfen umzukehren. Bei 37 ° C 5% CO 2 für 48 Stunden. </li><li> Pool fällt durch vorsichtiges Schwenken Platten und Transfer bis 15 mL konischen Rohr. Spülen Platten mit 4-6 ml PBS und fügen gleichzeitig 15 mL konisch. Hinweis: Sie können Pools bis zu fünf hängenden Tropfen Platten. Die EBs wird wachsen, da sie zu differenzieren und weiter, wenn sie zu konzentriert sind sie neigen dazu, große Klumpen bilden. </li><li> Lassen Sie gebündelt EBs durch die Schwerkraft (ca. 10 Minuten) zu begleichen. Saugen Sie den Überstand ohne störende EBs. Vorsichtig in 10 mL Differenzierung Medien und Transfer bis 10 cm nicht haftende Petrischale resuspendieren. </li><li> Legen Sie Petrischale auf einem Schüttler bei 50 rpm und bei 37 ° C 5% CO 2. </li><li> 24 Stunden später (Tag vier der Differenzierung), zu wirbeln Platten EBs in der Mitte der Petrischale zu konzentrieren. Sorgfältig Austausch 50% der Medien (5 ml) mit 5 ml frisch Differenzierung Media. Zurück Platte Inkubator für zwei weitere Tage. </li></ol> EB Dissoziation und Infektion mit MSCV-HOXB4-IRES-GFP <ol><li> Am sechsten Tag der Differenzierung, der Transfer EBs bis 15 mL konischen Rohr. Lassen Sie die durch die Schwerkraft zu begleichen. </li><li> Absaugen Medien und resuspendieren in 10 ml PBS. Lassen EBs durch die Schwerkraft anzusiedeln. Absaugen PBS. </li><li> Add 250 ml Dissoziation Enzym-Mix und 1 ml PBS. Inkubieren in 37 ° C Wasserbad für 20 Minuten, gelegentlich wirbelnden Rohr Enzyme und EBs mischen. </li><li> 8 ml Enzym-free Dissoziationspuffer. </li><li> Man reibt Mischung mit 5 ml Pipette bis EBs vollständig dissoziiert sind (etwa 10-mal, übermäßiges Pipettieren wird der Tod innerhalb der EB-derived Zellpräparation erhöhen). <ol><li> Mischung wird trüb mit Zellen als EBs distanzieren. </li><li> Platzieren Pipettenspitze gegen Ende des konischen Rohres während Verreibung wird eine Querkraft, die erheblich erleichtern wird Dissoziation. </li></ol></li><li> Sammeln Zellen über Zentrifugation. </li><li> Die Zellen in 5 ml 10% IMDM EB-derived und zählen mit Trypanblau-Ausschluss Hinweis: Zwischen Tag vier und Tag sechs der Differenzierung, der EBs kavitieren die Ergebnisse in einer großen Menge von Apoptose und Zell death.Thus am sechsten Tag, nach oben von 30% des EB-abgeleiteten Zellen können mit Trypanblau gefärbt. </li><li> Resuspendieren EB-abgeleiteten Zellen bei 100.000 Zellen / 2 ml 10% IMDM + virale Überstand, so dass eine MOI von 5-10 ist Protaminsulfat, um eine endgültige Konzentration von 8 mg / mL achieved.Add. Hinweis: Bereiten Sie genug EB / virale Überstand Mix-to-Plate vier 6-Well-Platten (vorausgesetzt, 2 ml / well). </li><li> Plate 2 mL EB / virale Überstand Mischung pro Vertiefung vier 6-Well-Platten vor vergoldet mit OP9 Stromazellen (siehe unten). </li><li> Centrifuge Platten bei 2500 rpm bei Raumtemperatur für 90 Minuten. Transfer-Platten bei 37 ° C 5% CO 2. </li><li> 4-6 Stunden später Ernte Überstand aus Platten sammeln und mögliche verbleibenden Zellen in Suspension durch Zentrifugation. </li><li> Pellet (mag klein sein) in 48 mL 10% IMDM + Zytokine. Dispense 2 mL / Vertiefung Resuspension zur ursprünglichen vier 6-Well-Platten, in denen Infektionen durchgeführt und war Überstand wurde gesammelt. Hinweis: Immer vorbereiten 10% IMDM + Zytokine frisch zum Zeitpunkt der Nutzung. </li><li> Die Platten bei 37 ° C 5% CO 2 für sieben Tage. Kolonien sollten durch Tag vier nach der Infektion und groß und von Tag sieben wohlgeformt erkennbar. Eine robuste Expansion sollte 40-60 Kolonien / well am siebten Tag erhalten. </li><li> Am Tag sieben nach der Infektion, zu sammeln und Pool alle Zellen (einschließlich OP9 Stroma) aus allen Vertiefungen durch Behandlung mit Trypsin. Hinweis: NICHT Überstand verwerfen oder PBS Waschungen während Trypsin treatment.At dieser Stelle in die Kultur eingesetzt wird, kann einige Kolonien werden nur lose anhaftenden und es gibt viele Zellen schwimting in suspension.Collect und Pool alle wäscht und Überstand, um sicherzustellen, dass keine potentiell wertvolle Zellen verworfen werden. </li><li> Die Zellen in 8 ml frisches 10% IMDM + Zytokine. Verteilen Sie 2 ml / Kolben in vier T75-Kolben. Hinzufügen eines zusätzlichen 13 ml 10% IMDM + Zytokine zu jeder Flasche. Bei 37 ° C 5% CO 2 für 3 Tage (insgesamt 10 Tage nach der Infektion). </li></ol> Kultur und Beschichtung von OP9 Stroma <ol><li> Pflegen Sie OP9 Stroma nach Standardprotokollen in 20% a-MEM. OP9 Zellen Eigenschaften ändern, wenn bis zur Konfluenz gewachsen. Immer bei 80% Konfluenz bei nicht mehr als 1:3 Split. </li><li> 24 Stunden vor der Infektion von Tag sechs EB-abgeleiteten Zellen mit MSCV-HOXB4-IRES-GFP, Platte 25.000 OP9 Zellen / Well von vier 6-well Platten in 20% a-MEM. </li></ol> Collection, Fraktionierung und Transplantation <ol><li> Sammeln Zellen auf OP9 Stroma für 10 Tage durch die Behandlung mit Trypsin erweitert. Zählen von Zellen. Hinweis: NICHT Überstand verwerfen oder PBS Waschungen während Trypsin-Behandlung eingesetzt werden. An diesem Punkt in der Kultur, können einige Kolonien werden nur lose anhaftenden und es gibt viele schwimmende Zellen in suspension.Collect und Pool alle wäscht und Überstand, um sicherzustellen, dass keine potentiell wertvolle Zellen verworfen werden. Hinweis: Eine gute Erweiterung sollte zwischen 40-50 x 10 6 Zellen / original 6-Well-Platte infiziert ergeben, insgesamt von 160-200 x 10 6 Zellen. </li><li> Zellen können fraktioniert werden über Magnetic-Bead-Auswahl oder FACS nach Standardverfahren an dieser Stelle in das Protokoll. </li><li> Für die Transplantation, liefern Zellen über retroorbitalen oder Schwanzvene Injektion Rag-2/gc mangelhaft Empfänger (mit einem Gewicht zwischen 15-22 Gramm) unterzogen, um eine Spaltung Dosis von 9,25 Gy Bestrahlung 2,5 Stunden. auseinander. Hinweis: Es ist wichtig, dass das Gewicht der Tiere zwischen 15-22 Gramm zum Zeitpunkt der Bestrahlung fallen. Wenn sie größer als 22 Gramm sind, werden 9,25 Gy nicht eine ausreichende Dosis der Bestrahlung werden die entsprechenden Ablation sicher und Zellen können nicht vermitteln Rettung aus tödlicher Bestrahlung und / oder einprägen des blutbildenden Fach. Wenn die Transplantation größerer Tiere, müssen die entsprechenden Bestrahlungsdosis experimentell bestimmt werden. </li><li> Eine minimale Dosis von 2-5 x 10 6 Zellen / Tier ist erforderlich, um Rettung aus tödlicher Bestrahlung zu gewährleisten. Wenn Fraktionierung Zellen injizieren 2-5 x 10 6 Zellen-Äquivalente (zB wenn der Bevölkerung von Interesse 10% der mit unfraktioniertem Pool von Zellen darstellt, spritzen 2-5 x 10 5 Zellen / Tier). Hinweis: Sollte das Spritzen&gt; 2 x 10 6 Zellen, immer über Schwanzvene zu injizieren, um Teratom-Bildung in der Umlaufbahn, die entstehen, wenn eine hohe Zahl von Zellen retroorbital geliefert werden können, zu vermeiden. </li><li> Pflegen Sie Rag-2 - / - / gc - / - defizienten Empfängern in autoklaviert Käfigen. Abhängig von der &quot;Sauberkeit&quot; des Tieres Anlage kann nach der Transplantation Tiere Verwaltung von angesäuertem Wasser oder Trimethiprim-Sulfasoxazole (Septra) für die 5 Wochen nach der tödlichen Strahlung benötigen. </li><li> Expect&gt; 90% GFP + ES-derived Leukozyten im peripheren Blut bei 3 Wochen nach der Transplantation. Engraftment sollte multi-lineage, obwohl Lymphozyten bekannt sind, retrovirale HOXB4-IRES-GFP Stille. </li></ol>

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice</td>
<td>Animal</td>
<td>Taconic Farm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plate shaker</td>
<td>Tool</td>
<td>VWR</td>
<td>33998-360</td>
<td>Orbital Shaker by Ikaworks</td>
</tr>
<tr>
<td>Multi-channel pipettor</td>
<td>Tool</td>
<td>VWR</td>
<td>15000-174</td>
<td>ePet by BioHit</td>
</tr>
<tr>
<td>ES trypsin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15090-046</td>
<td>0.25% Trypsin in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Standard trypsin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invtrogen</td>
<td>25300-062</td>
<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Buffer</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>20012-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Enzyme-free dissociation buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>13151-014</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissociation enzyme mix</td>
<td>Buffer</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17104-019</td>
<td>500 mg Collagenase IV</td>
</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>H2126</td>
<td>freeze in 500 uL aliquots and avoid repeated freezing and thawing.</td>
</tr>
<tr>
<td>DNAse</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D4527</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10-017CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protamine sulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P3369</td>
<td>8 ug/mL</td>
</tr>
<tr>
<td>EB differentiation media</td>
<td>medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Please view recipe on attached Protocol.doc</td>
</tr>
<tr>
<td>10% IMDM</td>
<td>medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Please view recipe on attached Protocol.doc</td>
</tr>
<tr>
<td>10% IMDM+cytokines</td>
<td>medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Please view recipe on attached Protocol.doc</td>
</tr>
<tr>
<td>20% anti-MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Please view recipe on attached Protocol.doc</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

derivation of hematopoietic stem cells from murine embryonic stem cells

Eine Stammzelle ist eine Zelle mit der Fähigkeit, definiert sowohl selbst erneuern und erzeugen mehrere differenzierte Nachkommenschaft. Embryonale Stammzellen (ESC) werden aus der Blastozyste des frühen Embryos abgeleitet und sind in differenzierenden Fähigkeit pluripotent. Ihre große Differenzierungspotential hat sie im Mittelpunkt der Forschung am abzuleiten, wie man sie überreden, um klinisch nützliche Zelltypen erzeugen zentriert. Die erfolgreiche Gewinnung von hämatopoetischen Stammzellen (HSC) aus Maus ESC wurde kürzlich durchgeführt und kann in diesem Video-Protokoll visualisiert werden. HSC, die wohl klinisch genutzt Zellpopulation, werden verwendet, um eine Vielzahl von hämatopoetischen Malignomen und Störungen zu behandeln. Allerdings mangelt es vielen Patienten, die von HSC-Therapie profitieren könnten den Zugang zu geeigneten Spendern. ESC könnte eine alternative Quelle von HSC für diese Patienten. Das folgende Protokoll stellt eine Grundlinie, aus dem ESC-HSC studiert und kann zu informieren Anstrengungen zur HSC aus menschlichem ESC zu isolieren. In diesem Protokoll werden ESC als Embryoidkörpern (EVG) für 6 Tage in kommerziell erhältlichen Serum sorgfältig geprüften optimale hämatopoetische Differenzierung unterschieden. EBs werden dann dissoziiert und infiziert mit retroviralen HOXB4. Mäuse und Co-Kultivierung in Gegenwart von Hämatopoese Zytokine für 10 Tage - Infected EB-abgeleiteten Zellen sind auf OP9 Stroma, eine Knochenmark-Zelllinie, die aus der Schädeldecke des M-CSF-/ abgeleitet überzogen. Während dieser Co-Kultur, die infizierten Zellen stark zu erweitern, was in der Erzeugung einer heterogenen Pool von 100s von Millionen von Zellen. Diese Zellen können dann zu retten und zu rekonstruieren letal bestrahlten Mäusen verwendet werden.

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Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Dieses Protokoll beschreibt die Herleitung der transplantierbaren hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus (ESC) und deren anschließende Injektion in letal bestrahlten Mäusen Empfänger. Kurz gesagt, ESC als Embryoidkörpern, die dann mit retroviralen HOXB4 und co-kultiviert mit OP9 Stromazellen und hämatopoetischen Zytokinen infiziert sind differenziert.

Ableitung von hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

derivation-hematopoietic-stem-cells-from-murine-embryonic-stem

Research

JoVE Journal

Biology

13.2K Aufrufe.  Harvard Medical School. Dieses Protokoll beschreibt die Herleitung der transplantierbaren hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus (ESC) und deren anschließende Injektion in letal bestrahlten Mäusen Empfänger. Kurz gesagt, ESC als Embryoidkörpern, die dann mit retroviralen HOXB4 und co-kultiviert mit OP9 Stromazellen und hämatopoetischen Zytokinen infiziert sind differenziert.

Serie: Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Vermehrung von humanen embryonalen Stammzellen (ES-Zellen)

Forschung

Biologie

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolierung und Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen (HSZ)

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Gewinnung menschlicher embryonaler Stammzellen durch Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

Isolierung und Analyse von hämatopoetischen Stammzellen aus der Plazenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Chromatin Immunopräzipitation von humanen embryonalen Stammzellen

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These regions are crucial in establishing the blood system in the embryos and leads to the eventual movement of stem cells into the fetal liver and then development of adult stem cells in the bonemarrow. Early hematopoietic stem cells can be isolated from these organs through microdissection of the embryo followed by flow cytometric sorting to obtain a more pure population. It remains unclear how these stem cell populations contribute to the fetal and adult stem cell pool.   Also, our lab investigates how early stem cells functionally differ from fetal and adult hematopoietic stem cells. Furthermore, our lab sorts different populations of hematopoietic stem cells and test their functional role in the context of a variety of genetic models. In this video, we demonstrate the micro-dissection procedure we commonly use and also show the results of a typical FACS plotfter isolating these rare populations, it is possible to perform a variety of functional assays including: colony assays and bone marrow transplants. 



This video shows how to micro-dissect the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region from embryos and use flow cytometry to sort hematopoietic stem cells.

Isolierung von Anfang hämatopoetischen Stammzellen aus Murine Dottersack und AGM

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

Isolation und Ableitung von embryonalen Maus-Keimzellen

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

Ableitung der Maus Trophoblast Stammzellen aus Blastozysten

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...