Nehmen Sie zu Beginn eine 70 bis 90%ige konfluente Kultur von humanen Uterusfibroblasten. Das Medium wird aus den Kolben abgesaugt. Waschen Sie die Zellen mit fünf Millilitern warmem kalzium- und magnesiumfreiem DPBS.
Nach dem Aspirieren des DPBS werden vier Milliliter warmes Trypsin-EDTA in jeden Kolben pipettiert. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für drei bis fünf Minuten, bis sich die Zellen lösen. Geben Sie dann sechs Milliliter Tropfen und Neutralisationslösung in jeden Kolben.
Übertragen Sie dann die Zellsuspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Verwenden Sie eine Pipette, um die Suspension gut zu mischen, und nehmen Sie ein 10-Mikroliter-Aliquot für die Zellzählung. Mischen Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension mit 10 Mikrolitern Trypanblau.
Übertragen Sie die gefärbte Zellsuspension zur Zellzählung auf ein Hämozytometer. Anschließend wird die Zellsuspension bei 300 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nach dem Aspirieren des Überstands wird das Pellet in warmem Fibroblastenmedium resuspendiert.
Waschen Sie nun den Basalkanal eines mikrofluidischen Organchips mit 200 Mikrolitern Fibroblastenmedium. Waschen Sie dann den apikalen Kanal mit 200 Mikrolitern erwärmtem Vaginalepithelmedium. Geben Sie 200 Mikroliter vollständiges vaginales Epithelmedium in den apikalen Kanaleinlass, während Sie den Auslass mit einer Pipettenspitze verstopfen.
Geben Sie das Medium so lange ab, bis das Volumen der Einlass- und Auslassspitze gleich ist. Lösen Sie dann die Pipettenspitze von der Pipette und lassen Sie die Spitze im Einlass. Pipettieren Sie langsam 50 Mikroliter der Suspension der menschlichen Uterusfibroblastenzellen in den Einlass des Basalkanals, während Sie gleichzeitig aus dem Auslass aspirieren.
Entfernen Sie die Pipettenspitze aus dem Einlass, wenn etwa zwei Mikroliter der Zellsuspension in der Pipettenspitze verbleiben. Drehen Sie die Steckerchips auf einem 15-Milliliter-Röhrchengestell auf den Kopf. Überprüfen Sie die Chips nach der Inkubation auf Zellanhaftung.
Verschließen Sie als Nächstes den Ausgang des Basalkanals mit einer Pipettenspitze. Geben Sie dann 200 Mikroliter Fibroblastenmedium in den Basalkanaleinlass, ohne den Pipettenkolben nach unten zu drücken. Lösen Sie die Spitze von der Pipette, damit das Medium durch die Schwerkraft frei durch den Kanal zur Auslasspipettenspitze fließen kann.
Inkubieren Sie die mit Fibroblasten gesäten Chips über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxidzusatz.
