mOrange-Nano-Rekrutierung an disiLID funktionalisierte unterstützte Lipiddoppelschichten (SLBs) zur Generierung von Proteinmustern

Nehmen Sie zunächst eine 18-Well-Glasbodenkammer mit Mikroobjektträger, geben Sie 150 Mikroliter Natriumhydroxid in jede Vertiefung der Kammer und inkubieren Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie dann die Natronlauge und waschen Sie die Vertiefungen drei- bis fünfmal mit entionisiertem Wasser, gefolgt von drei Wäschen mit Puffer, der 10 Millimolar Calciumchlorid enthält. Geben Sie anschließend 15 Mikroliter frisch zubereitete SUVs in die Vertiefungen, die 150 Mikroliter Puffer mit 10 Millimolar Calciumchlorid enthalten.

Nach 30 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur waschen Sie die SLBs mindestens siebenmal mit einem Puffer, der kein Calciumchlorid enthält. Für die Funktionalisierung der biotinylierten SLBs mit Streptavidin wird eine Lösung von Streptavidin zugegeben. Waschen Sie dann die SLBs mindestens fünfmal mit Puffer, um überschüssiges Streptavidin zu entfernen.

Geben Sie anschließend b-disiLID in einer Endkonzentration von einem Mikromolaren in die Vertiefung. Nach 30 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur waschen Sie das überschüssige Protein mindestens fünfmal mit Puffer. Geben Sie dann mOrange-Nano bis zu einer Endkonzentration von 200 Nanomolaren hinzu.

Decken Sie die Probe mit Alufolie ab und bewahren Sie sie im Dunkeln auf. Legen Sie den Objektträger anschließend unter das Fluoreszenzmikroskop. Stellen Sie den 552-Nanometer-Laser so ein, dass er mOrange-Nano visualisiert.

Die Fluoreszenzmikroskopie zeigte mOrange-Nano, das auf den mit b-disiLID funktionalisierten SLBs strukturiert ist. Nach der Photoaktivierung kommt es zu einem raschen Anstieg des Fluoreszenzsignals im orangefarbenen Kanal innerhalb des interessierenden Bereichs. Die Fluoreszenz von mOrange-Nano nimmt nach jeder Photoaktivierung zu, die in 120 Sekunden gesättigt ist, und sinkt dann in den folgenden 120 Sekunden auf das Hintergrundniveau.