Zu Beginn werden HEK293T Zellen mit 22 Millilitern supplementiertem Nährmedium in 10 behandelte Kulturschalen mit einem Durchmesser von 15 Zentimetern galvanisiert. Inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang, um eine Konfluenz von 70 bis 80 % zu erreichen. Für die Zelltransfektion wird eine Mischung hergestellt, indem die Reagenzien in einem Mikrozentrifugenröhrchen kombiniert und durch Klopfen gemischt werden.
Das Transfektionsgemisch mit 4,56 Millilitern unsupplementiertem DMEM in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geben und durch Klopfen mischen. Geben Sie dann Tropfen für Tropfen 1,37 Milliliter sterile Polyethyleniminlösung hinzu. Durch Klopfen mischen und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um DNA-Polyethylenimin-Komplexe zu bilden.
Geben Sie diese Mischung in 231 Milliliter vorgewärmtes ergänztes DMEM. Ersetzen Sie das Nährmedium in jeder Kulturschale durch 22 Milliliter dieser Transfektionsmischung und inkubieren Sie die Zellen 48 Stunden lang. Wenn das PITR einen fluoreszierenden Reporter kodiert, beobachten Sie die transfizierten Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop.
Sammeln Sie als Nächstes das Medium von jeder Schale. 10 Minuten bei 800 g zentrifugieren und den Überstand entfernen. Geben Sie dann 10 Milliliter vorgewärmtes PBS auf die Platte und verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen zu entfernen.
Sammeln Sie die Zellsuspension in den Zentrifugenröhrchen, die das Zellpellet enthalten. Stellen Sie sicher, dass alle Zellen gesammelt werden, indem Sie jeweils fünf Teller mit 10 Millilitern PBS spülen. Zentrifugieren Sie erneut, um die Zellen zu pelletieren.
Für die rAAV-Extraktion tauen Sie die transfizierten Zellpellets auf und resuspendieren Sie sie in 100 Millilitern sterilem Puffer und Pipette, um eine homogene Suspension zu gewährleisten. Fügen Sie dann 12,5 Milliliter einer frisch zubereiteten, sterilen 10%igen Natriumdesoxycholatlösung hinzu, um die Zelllyse zu induzieren, und mischen Sie durch Pipettieren. Fügen Sie 27 Mikroliter Benzonase-Nuklease hinzu und mischen Sie gründlich, bis die Mischung nicht mehr viskos ist.
Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und wirbeln Sie eine Stunde lang alle 10 Minuten. Zentrifugieren Sie bei 3.000 g für 60 Minuten bei 25 Grad Celsius. Filtrieren Sie den Überstand mit einem 0,45-Mikron-PVDF-Spritzenvorsatzfilter in einen neuen sterilen Behälter.
