Bereiten Sie zunächst das FPLC-System für die Reinigung vor. Spülen Sie den Strömungsweg der Flüssigkeit gründlich mit sterilem Reinstwasser nach manuellen Anweisungen oder einer benutzerdefinierten Methode. Schließen Sie eine vorgepackte Heparinsäule von einem Milliliter an.
Stellen Sie den Druckalarm ein. Und waschen Sie mit fünf Säulenvolumina Reinstwasser bei einer Durchflussrate von einem Milliliter pro Minute. Schalten Sie dann die Lösungen für Systempumpen um, um sie für die Probenanwendung vorzubereiten.
Waschen Sie die Systempumpe B mit Puffer B und füllen Sie den Rest des Flüssigkeitsflusswegs mit Puffer A.Führen Sie den Probenschlauch der Probenpumpe in das Viruspräparat ein. Alternativ kannst du auch einen Superloop für das Sample verwenden. Setzen Sie den Auslassschlauch in einen neuen Behälter ein.
Wenn Sie die Aufreinigung zum ersten Mal durchführen, definieren Sie eine benutzerdefinierte Methode für die automatische Reinigung. Nach dem Aktivieren der allgemeinen Aufreinigungseinstellungen bereitet die Methode den Durchflussweg vom Probeneinlass S1 zum Injektionsventil mit der Probenlösung vor. Äquilibrieren Sie dann die Säule mit insgesamt fünf Säulenvolumina unter Verwendung von 12,5 % Puffer B mit einer Geschwindigkeit von einem Milliliter pro Minute.
Geben Sie die Probe mit 0,5 Millilitern pro Minute auf die Säule und sammeln Sie den Durchfluss über die Auslassöffnung. Waschen Sie die Säule mit 20 Säulenvolumina Puffer A bei einem Milliliter pro Minute. Dann eluieren Sie die Probe mit diesem Schema mit einem Milliliter pro Minute.
Wählen Sie diese Option, um die eluierte Probe in Ein-Milliliter-Fraktionen mit einem Fraktionssammler zu sammeln. Dann wird die Säule mit einem Milliliter pro Minute mit 12,5 % Puffer B für fünf Säulenvolumina wieder ausgeglichen. Öffnen Sie die erstellte Methode und warten Sie auf den Elutionsschritt.
Sammeln Sie die Fraktionen mit einem Fraktionssammler. Sammeln Sie außerdem ein Aliquot des Durchflusses und lagern Sie die Fraktionen bei minus 20 Grad Celsius. Werten Sie das automatisch gespeicherte Chromatogramm aller Aufreinigungsschritte aus.
Einschließlich des Elutionsprofils. Stellen Sie nach Abschluss der Behandlung die Einlässe von den Pufferlösungen auf Reinstwasser um und waschen Sie die Säule mit einem Milliliter pro Minute für fünf Säulenvolumen. Stellen Sie die Säule wieder her, schalten Sie die Einlässe von Reinstwasser auf 20 % Ethanol um und waschen Sie die Säule für fünf Säulenvolumen.
Um rAAVs zu konzentrieren, laden Sie die gewünschten FPLC-Fraktionen in eine 15-Milliliter-Zentrifugalfiltereinheit mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 100 Kilodalton. Bei 2.000 g für zwei Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren, um ein konzentriertes Volumen von etwa 500 Mikrolitern zu erreichen. Fahren Sie mit dem Pufferwechsel fort, indem Sie der Zentrifugalfiltereinheit einen Milliliter steriles PBS hinzufügen.
Waschen Sie den Filter durch Pipettieren. Und zentrifugieren Sie im Minutentakt, bis Sie ein Volumen von 500 Mikrolitern erreichen. Die rAAVs werden weiter konzentriert, indem diese 500-Mikroliter-Probe in eine 0,5-Milliliter-Zentrifugalfiltereinheit mit einem Cutoff-Gehalt von 100 Kilodalton überführt wird.
Und zentrifugieren Sie bei 6.000 g für einminütige Intervalle, bis das Volumen weniger als 100 Mikroliter beträgt. Das konzentrierte rAAV wird zurückgewonnen, indem die Filtervorrichtung in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen umgedreht und zentrifugiert wird, um die rAAVs in das Röhrchen zu übertragen. Aliquotieren Sie die rAAVs in Mikrozentrifugenröhrchen mit niedriger Retention und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius.
Die Reinheit von rAAV-Präparaten wurde anhand der SDS-Seite analysiert, wobei unterschiedliche Kapsidproteinbanden nachgewiesen wurden. Die Visualisierung von Viruspartikeln mittels TEM zeigte leere Teilchen mit einem elektronendichten Zentrum und volle Teilchen. Die Bewertung der physikalischen Verunreinigungseigenschaften von rAAVs mit der Stunner-Plattform ergab intakte Kapsidpartikel um 30 Nanometer, einen Gesamtkapsidtiter, freies und aggregiertes Protein sowie einzelsträngige DNA.
Infektiositätsassays in Neuro-2a-Zellen zeigten eine hohe Infektiosität. Primäre neuronale Kulturen, die mit den Viruspräparaten infiziert waren, wurden nachgewiesen. erhaltene Gentransfereigenschaften.
Die in vivo Transduktion des Kleinhirns von Mäusen mit rAAV-Vektoren führte zu einer verlängerten GFP-Expression. Dies deutet auf eine erfolgreiche Transgenexpression im Gehirn von Säugetieren hin.
