Reinigen Sie zunächst alle Bereiche des Inkubators und der Schlauchpumpe gründlich mit Desinfektionsmittel, um eine quasi-sterile Umgebung zu gewährleisten. Spülen Sie dann jeden Schlauch mit 700 Mikrolitern PBS mit Magnesium und Kalzium, gefolgt von 500 Mikrolitern C2 oder EC-konditioniertem Medium. Verwenden Sie den Schlauch mit dem kurzen Abstand vom Köderverschluss zum Schlauchpumpenstopfen für die linke Kavität und den Schlauch mit der anderen Symmetrie für die rechte Kavität.
Nachdem Sie den Biochip mit HUVEC- und C2BBe1-Zellen aus dem Inkubator entnommen haben, führen Sie einen Medienaustausch mit 350 Mikrolitern für jede Kammer durch. Verschieben Sie dann die Stecker von der unteren zur oberen Seite. Geben Sie 350 Mikroliter des frischen Mediums in die untere Kammer des Biochips.
Entfernen Sie danach alle Stecker und füllen Sie alle Anschlüsse bis ganz nach oben. Beginnen Sie am linken Hohlraum und führen Sie den Lockadapter in den Anschluss des Biochips ein, um den ersten Schlauch mit dem rechten Anschluss der oberen Kammer zu verbinden. Verbinden Sie dann den zweiten Schlauch mit dem linken Anschluss der unteren Kammer.
Nehmen Sie als Nächstes ein Reservoir und geben Sie einen kleinen Tropfen Zellkulturmedium auf den Boden des Reservoirs. Setzen Sie dann das Reservoir auf die gegenüberliegende Seite des ersten Schlauchs ein und wiederholen Sie den Vorgang für die andere Kammer. Sobald alle Anschlüsse mit einem Schlauch oder Reservoir verbunden sind, füllen Sie die Reservoirs mit 3,5 Millilitern Zellkulturmedium.
Legen Sie dann die lose Seite des Schlauchs, an der der Deckel befestigt ist, auf die Oberseite des Reservoirs, um das mikrofluidische System jeder Kammer zu schließen. Transportieren Sie den Biochip zur Schlauchpumpe. Verbinden Sie mit den Stopfen der Schlauchpumpe jeden Schlauch mit der Schlauchpumpe, so dass das Medium aus dem Reservoir in den Hohlraum und über die Pumpe zurück fließt.
Dann perfundierte jede Kammer mit einer Durchflussrate von 50 Mikrolitern pro Minute. Sobald die Vorprofusion abgeschlossen ist, stoppen Sie die Schlauchpumpe. Entfernen Sie den Deckel, der mit dem Schlauch jedes Reservoirs verbunden ist, und legen Sie ihn auf ein steriles Tuch neben der Pumpe.
Nachdem Sie das gesamte Medium entfernt haben, füllen Sie die Behälter mit 2 Millilitern frisch zubereitetem Medium. Verbinden Sie den Schlauch und den Deckel wieder und setzen Sie die zirkuläre Perfusion mit einer Durchflussrate von 50 Mikrolitern pro Minute für weitere 24 Stunden fort. Sobald die Schlauchpumpe gestoppt ist, öffnen Sie die Behälter aller Hohlräume.
Leeren Sie die Reservoirs und trennen Sie die Schläuche und Reservoirs vom Biochip. Waschen Sie die mikrofluidischen Hohlräume zweimal pro Kammer mit 500 Mikrolitern kaltem PBS mit Magnesium und Calcium. Geben Sie 500 Mikroliter eiskaltes Methanol in alle Hohlräume.
Schneiden Sie nach dem Öffnen des Chips die Klebefolie des Biochips ab bzw. entfernen Sie sie. Schneiden Sie das Gewebe mit der PET-Membran in zwei Hälften, um es parallel mit verschiedenen Immunpanels zu färben. Übertragen Sie jedes Membranstück mit einer Präzisionspinzette in eine separate Vertiefung in einer 24-Well-Platte mit einer blockierenden und permeabilisierenden Lösung.
Übertragen Sie dann die Membranstücke auf einen sauberen Objektträger in einer Feuchtkammer. Geben Sie 50 Mikroliter des vorbereiteten Primärantikörpers und der Färbelösung auf jedes Membranstück. Sobald die Proben auf eine 24-Well-Platte übertragen wurden, waschen Sie die Membranen zweimal für 5 Minuten mit Waschlösung, dann mit PBS mit Magnesium und Kalzium.
Montieren Sie die Membranstücke mit einem Fluoreszenz-Eindeckmedium und einem Deckglas auf einen sauberen Objektträger und lagern Sie sie bei 4 Grad Celsius bis zur mikroskopischen Bildgebung. Nach fünf Tagen der Profusion zeigte die mit DAPI gefärbte Kern-DNA vollständig differenzierte Monozyten-abgeleitete Makrophagen, die CD68 exprimierten und sich über das gesamte Gefäßgewebe ausbreiteten. HUVECs erzeugten eine konfluente Schicht, die die Integrität des Gewebes durch die Bildung von Adhärenzverbindungen wie VE-Cadherin zeigte.
Darüber hinaus wird der von-Willebrand-Faktor in hohem Maße durch HUVECs exprimiert. Nach fünf Tagen der Fülle bildeten C2BBe1-Zellen polarisierte Epithelzellschichten, die die Verbindungsproteine E-Cadherin und ZO-1 exprimieren. Das dreidimensionale Wachstum von zottenartigen und kryptenartigen Strukturen des Epithels kann in den x- und y-Abschnitten des Z-Stapels nach sechstägiger Perfusion nachgewiesen werden.
