Geben Sie zunächst 500 Mikroliter proteinfreien Bildpuffer in Kanal 3 der Durchflusszelle. Mischen Sie zwei Nanomolare von Saccharomyces cerevisiae NAP1 und zwei bis fünf Nanomolare von LD655-markiertem H4-Histon-Oktamer mit 500 Mikrolitern 1X HR-Puffer. Geben Sie dieses Gemisch in Kanal 4 der Durchflusszelle.
Lassen Sie alle Kanäle 30 Sekunden lang mit 1,0 bar fließen, um sie mit Proben zu spülen. Stellen Sie den Durchfluss auf 0,2 bar ein und bewegen Sie die optischen Fallen auf Kanal 1, um ein geeignetes Paar Streptavidin-beschichteter Kügelchen aufzufangen. Verschieben Sie als Nächstes die optischen Traps auf Kanal 3.
Schalten Sie den Durchfluss aus, und führen Sie eine erzwungene Kalibrierung für das Perlenpaar durch. Schalten Sie den roten konfokalen Laser ein und kalibrieren Sie den Bildgebungsbereich. Nachdem Sie den Durchfluss auf 0,2 bar eingestellt haben, bewegen Sie die optischen Fallen auf Kanal 2, um biotinylierte DNA aufzufangen.
Bewegen Sie dann die optischen Fallen auf Kanal 3 und stoppen Sie den Durchfluss. Vergrößern Sie den Abstand zwischen den optischen Fallen, um die DNA zu dehnen, und überwachen Sie die zugehörige erzwungene Abstandskurve, um das Vorhandensein eines einzelnen DNA-Haltegurts zu bestätigen. Passen Sie den Abstand zwischen den optischen Fallen so an, dass die DNA-Spannung etwa einen Piconewton anzeigt.
Schalten Sie die Zeilenabtastung ein, um mit eingeschaltetem roten Laser einen Kymographen zu erfassen. Bewegen Sie dann die optischen Fallen bei ausgeschaltetem Fluss zu Kanal 4, um Nukleosomen entlang des DNA-Haltegurts zu bilden. Zum Auspacken der Nukleosomen verschieben Sie die optischen Fallen auf Kanal 3.
Durch Einstellen des Kraftmesswerts auf 0 und der Geschwindigkeit auf 0,1 Mikrometer pro Sekunde wird die optische Falle 1 von der optischen Falle 2 wegbewegt. Mischen Sie 10 Nanomolare Cy3-markiertes Linker-Histon H1.4 mit 500 Mikrolitern Bildpuffer und geben Sie es in Kanal 5. Nachdem Sie einen DNA-Tether gebildet haben, der Nukleosomen enthält, schalten Sie zusätzlich zum roten Laser den grünen Laser ein und verschieben Sie die optischen Fallen auf Kanal 5, um die Bindung von H1 an das Chromatin in Echtzeit abzubilden.
Die Nukleosomenbildung entlang des DNA-Tethers wurde als stationäre rot fluoreszierende Herde auf einem 2D-Scan und Kymographen visualisiert. Die Photobleaching-Analyse zeigte ein- oder zweistufige Photobleichereignisse, was auf das Vorhandensein von Mononukleosomen hinweist. In Abwesenheit von NAP1 banden Histon-Oktamere DNA, blieben aber meist unverpackt, was sich an der ständigen Spannung zeigt.
Mit Cy3-markiertem H2A wurden ähnliche Ergebnisse bei der Nukleosomenassemblierung erzielt wie mit LD655-markiertem H4. Das Auswickeln von Nukleosomen vergrößerte den Tether-Abstand im Laufe der Zeit, der auf dem Kymographen sichtbar war, und erzeugte erzwungene Abstandskurven mit charakteristischen Rissen, die das Auswickeln einzelner Nukleosomen anzeigen. Die Bindung des Linker-Histons H1 an das Chromatin wurde durch grün fluoreszierende Foki mit zweifarbigen stationären Trajektorien angezeigt, die die Bindung von H1 an Nukleosomen darstellen, und grün gezackten Trajektorien, die diffuse H1-Trajektorien darstellen.
