In-situ-Nukleosomenassemblierung für die Einzelmolekül-Korrelativkraft- und Fluoreszenzmikroskopie

Einzelmolekültechniken sind leistungsfähige Werkzeuge, um die Mechanik, Koordination und Zusammensetzung von Chromatinsystemen zu untersuchen. Und deshalb sind Forscher immer auf der Suche nach besseren Methoden, um Nukleosomensubstrate zu erzeugen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Bildung von Nukleosomen quer durch DNA in C2 in einem Einzelmolekül-Korrelativkraft- und Fluoreszenzmikroskop.

Typischerweise werden Nukleosomensubstrate durch Assemblieren von Nukleosomen auf DNA hergestellt, die starke Positionierungssequenzen durch Salzdialyse enthalten. Das hat zwar Vorteile, erzeugt aber künstlich stabile Nukleosomen und geht mit Reagenzien hart um. Unser Protokoll bereitet Nukleosomensubstrate für die Einzelmolekül-korrelierte Kraft- und Fluoreszenzmikroskopie ohne spezifische DNA-Sequenzen und mit viel weniger Reagenzien vor, und das alles innerhalb von Minuten.

Dieses Protokoll ermöglicht die Assemblierung von Nukleosomen auf nativen DNA-Sequenzen, eine einfache Anpassung der Nukleosomendichte sowie eine geringere Vorbereitungszeit und den Einsatz von Reagenzien. Darüber hinaus ermöglicht die Bildung von nukleosomalen DNA-Fesseln in C2 einen einfacheren experimentellen Arbeitsablauf und den Komfort der integrierten Visualisierung und Manipulation einzelner Moleküle. Wenn eine gleichmäßige und spezifische Positionierung der Nukleosomen kein wesentlicher Bestandteil des Experiments ist, können unsere Ergebnisse den Wissenschaftlern helfen, das Chromatin und seine Bergbauproteine auf der Ebene einzelner Moleküle effizienter zu untersuchen.

Mit der eingesparten Zeit und den eingesparten Ressourcen können mehr Experimente durchgeführt werden, um zusätzliche Variablen und Bedingungen weiter zu untersuchen. Zu den anwendbaren Forschungsbereichen, über die wir derzeit nachdenken, gehören die Chromatinmechanik, die durch Histonvarianten reguliert wird, und andere posttranslationale Modifikationen. Wir denken auch über die biophysikalischen Eingriffe und die Kinetik anderer Chromatin-bindender Proteine nach.

Und schließlich denken wir auch über die nukleosomengesteuerten Assemblierungsprozesse höherer Ordnung nach, wie z. B. die biomolekulare Kondensation.