Legen Sie zunächst die für die Herstellung der Gelelektrophorese erforderlichen Reagenzien auf eine Arbeitsplattform. Geben Sie Tris/Borat/EDTA oder FSME zu Agarose und erhitzen Sie die Lösung in der Mikrowelle. Gießen Sie dann die 0,4-0,5%ige Agarose in eine Gießschale, um ein Agarosegel der ersten Dimension herzustellen, und lassen Sie es eine Stunde lang erstarren.
Laden Sie die Leiter nach dem Erstarren innerhalb der ersten 3 Zentimeter relativ zum linken Rand des Gels. Laden Sie dann die mit Restriktionsenzymen verdauten DNA-Proben, wobei Sie einen Abstand von 3 Zentimetern zwischen jedem Paar sicherstellen. Lassen Sie das Gel 19-24 Stunden lang bei 0,85 Volt pro Zentimeter in FSME laufen, um die Zwischenprodukte nach Größe zu trennen.
Entfernen Sie am nächsten Tag das Gel aus dem Puffer. Schneiden Sie die ersten 3 Zentimeter des Gels mit der Leiter heraus. Färben Sie das Gelsegment in FSME mit 0,3 Mikrogramm pro Milliliter Ethidiumbromid für 10-15 Minuten.
Visualisieren Sie dann die Leiter mit Hilfe eines Gel-Dokumentationssystems. Addieren Sie auf dem Agarose-Gel 1,3 Zentimeter zu der geschätzten Stelle, was einen Wert von A ergibt.Subtrahieren Sie dann 7,5 Zentimeter von Wert A, was den Wert B ergibt.Richten Sie das Lineal gegen das Gel der ersten Dimension aus und schneiden Sie horizontal bei den Werten A und B durch.Schneiden Sie dann den für jede Probe reservierten Abstand von 3 Zentimetern vertikal ab. Drehen Sie die Segmente in einer neuen Gießschale im Uhrzeigersinn und platzieren Sie sie an der Position der Probenvertiefungen.
Bereiten Sie das zweitdimensionale Agarosegel in einer Konzentration von 1-1,3% in FSME mit 0,3 Mikrogramm pro Milliliter Ethidiumbromid vor. Erhitzen Sie das Gel und gießen Sie es nach dem Abkühlen auf etwa 55 Grad Celsius über die gedrehten Segmente der ersten Dimension. Lassen Sie das Gel eine Stunde lang fest werden.
Nach der Erstarrung wird das Gel in eine Kammer mit FSME in einer Menge von 0,3 Mikrogramm pro Milliliter Ethidiumbromid überführt und 30 Minuten lang äquilibriert. Decken Sie das Gel ab und lassen Sie es 9-10 Stunden lang bei 4,23 Volt pro Zentimeter bei 4 Grad Celsius laufen. Nehmen Sie das zweitdimensionale Gel aus der Kammer und reinigen Sie die DNA-Fragmente 10 Minuten lang in einer 0,24-molaren Salzsäurelösung unter leichtem Schaukeln.
Spülen Sie das Gel mit entionisiertem Wasser ab und weichen Sie es 10-15 Minuten lang in 0,4 molar Natriumhydroxid ein. Falten Sie dann zwei lange Blätter Chromatographiepapier senkrecht über die Glasscheibe und ragen Sie in den Behälter hinein. Um den Southern Blot zusammenzusetzen, füllen Sie einen Behälter mit 1 Liter 0,4 molar Natriumhydroxid.
Richten Sie eine lange Glasscheibe quer über den Behälter aus. Befeuchten Sie die Oberseite des Papiers mit Natriumhydroxid und entfernen Sie vorsichtig alle Luftblasen unter der Oberfläche. Tränken Sie drei Blatt Chromatographiepapier mit Natriumhydroxid und legen Sie sie auf das Ordnerpapier.
Entfernen Sie alle Luftblasen. Drehen Sie das Gel der zweiten Dimension auf den Kopf und legen Sie es über die Chromatographiepapiere. Befeuchten Sie eine positiv geladene Nylonmembran mit deionisiertem Wasser und legen Sie sie über das Gel.
Legen Sie dann drei mit deionisiertem Wasser befeuchtete Chromatographieblätter über die Membran. Decken Sie freiliegendes Natriumhydroxid im Behälter mit Plastikfolie ab, um eine Verdunstung zu verhindern. Lege einen 0,3 bis 0,5 Meter hohen Stapel Servietten oder Papiertücher über den Klecks.
Komprimieren Sie den gesamten Blot mit einem Gewicht, um eine enge Kapillarwirkung zu ermöglichen, und lassen Sie ihn zwei Tage lang für den DNA-Transfer zur Membran.
