Diese Protokolle dienen als Best-Practice-Richtlinien für die Knochenpulvererzeugung für die Verwendung in der nachgeschalteten DNA-Extraktion über eine Reihe von Skelettelementen. Es gibt einige veröffentlichte alte DNA-Probenahmeprotokolle für andere Orte als das Dentin und die Petrouspyramide. Heute zeigen wir die detaillierten Stichprobenmethoden für drei Alternativen.
Diese Methoden zeigen auch ein großes Potenzial für den Einsatz bei degradierten forensischen Überresten, aber auch als Grundlage für die Entwicklung ähnlicher Techniken mit nicht-menschlichen Proben. Führen Sie alle Probenahmen in einem speziellen Reinraum unter einer mit UV-Licht ausgestatteten PCR-Haube oder einer Biosicherheitswerkbank durch. Schalten Sie den Luftstrom aus und verteilen Sie sterile Aluminiumfolie auf der Tischplatte, um verirrtes Knochenpulver oder -fragmente aufzufangen.
Legen Sie ein Blatt Wiegepapier in eine sterile Waagale. Halten Sie den dekontaminierten Backenzahn mit der Wurzel nach unten über einer Wiegeschale mit einer Handklemme am Zahnschmelz. Statten Sie einen Dentalbohrer mit einem diamantumrandeten Kreisschneidrad aus.
Wenn der Bohrer auf eine mittlere Geschwindigkeitseinstellung eingestellt ist, berühren Sie leicht die Kante des Bohrers zur Wurzel in einem Winkel von etwa 20 Grad. Schaben Sie die Probe nach unten in die Schale, um das gelbe, äußerste Material von der Wurzel zu sammeln. Stoppen Sie die Entnahme, sobald das leichtere Material des Dentins sichtbar wird.
Das Pulver wird in ein Zwei-Milliliter-LoBind Safe-Lock-Röhrchen überführt und diese gesammelte Pulvermasse mit einer beiliegenden Waage mit einer Genauigkeit von mindestens 0,01 Milligramm aufgezeichnet. Das Pulver aus dem Wägepapier zur Extraktion in ein zwei Milliliter LoBind Safe-Lock Röhrchen geben. Lagern Sie diese Tube bei 20 Grad Celsius.
Stellen Sie sicher, dass Sie alle Knochenfragmente und so viel Pulver wie möglich wiederherstellen. Wechseln Sie die Folie zwischen den einzelnen Probenahmen und entsorgen Sie die gebrauchte Folie in einem autoklavierbaren Biogefahrenbeutel. Dekontamination des Arbeitsbereichs und verteilen Sie jedes Mal sterile Aluminiumfolie über die Tischplatte, bevor Sie zum nächsten Knochen wechseln.
Legen Sie ein kleines Blatt Wägepapier in eine Standardwägeablage. Entfernen und entsorgen Sie die äußerste Schicht des kortikalen Knochens des oberen Wirbelbogens mit einem Zahnbohrer. Dann befestigen Sie die Wirbel in einer Handklemme, wobei der Dornfortsatz nach außen und der obere Aspekt nach unten gerichtet ist.
Während Sie den Wirbel halten, bohren Sie nach oben in die Mitte der V-förmigen Kerbe, die durch die Verschmelzung des Dornfortsatzes mit den Lamellen mit niedriger Geschwindigkeit und hohem Drehmoment gebildet wird. Beenden Sie das Bohren, wenn der Widerstand merklich abfällt. Ändern Sie die Bohrposition leicht und wiederholen Sie den Vorgang, bis 50 bis 100 Milligramm Knochenpulver gesammelt sind.
Das Knochenpulver aus dem Wiegepapier zur Extraktion in ein Zwei-Milliliter-LoBind-Röhrchen überführen und bei 20 Grad Celsius lagern. Stellen Sie sicher, dass alle Knochenfragmente und so viel Pulver wie möglich wiederhergestellt sind, bevor Sie eine Folie entsorgen. Dekontaminieren Sie den Arbeitsbereich und bereiten Sie sich auf die Probenentnahme vor, wie zuvor beschrieben.
Legen Sie ein kleines Blatt Wiegepapier in eine Standardwägeablage. Halten Sie die Taluskuppel nach oben und die mediale Oberfläche in Richtung des Kollektors über die Waagale. Kratzen Sie kortikalen Knochen bis zu einer Tiefe von etwa einem Millimeter vom Hals des Talus mit einem Zahnbohrer mit einem niedrigen Meißel ab, der auf niedrige Geschwindigkeit und hohes Drehmoment eingestellt ist.
Ändern Sie die Bohrposition und wiederholen Sie dies, bis etwa 50 bis 100 Milligramm Knochenpulver gesammelt sind. Übertragen Sie dieses Knochenpulver aus dem Wiegepapier zur Extraktion in ein Zwei-Milliliter-LoBind-Röhrchen. Lagern Sie das Pulver auf unbestimmte Zeit bei 20 Grad Celsius.
Lagern Sie den restlichen Knochen und überschüssiges Pulver in einer trockenen, temperaturkontrollierten sterilen Umgebung bei 25 Grad Celsius. Entsorgen Sie alle Abfälle in Autoklaven-Biogefahrenbeuteln oder -behältern. Sterilisieren oder dekontaminieren Sie alle wiederverwendbaren Geräte und setzen Sie sie zwischen jeder Probenahme UV-Strahlung aus.
Die Pars petrosa lieferte eine höhere endogene DNA als die anderen 23 untersuchten anatomischen Probenahmestellen. Die sieben zusätzlichen anatomischen Probenahmestellen, die in diesem Protokoll vorgestellt wurden, lieferten die nächsthöheren Erträge. Die alternativen Standorte produzierten konsistent DNA-Ausbeuten, die für standardmäßige populationsgenetische Analysen ausreichen.
Die Duplikationsraten in Bibliotheken, die sich aus allen anatomischen Probenahmeorten ergaben, waren gering, was auf eine hohe Komplexität hindeutet. Die Zähne sowie die Brustwirbel zeigten eine ausreichende molekulare Erholung. Einer der schwierigsten Aspekte der Knochenprobenahme ist der Bohrprozess, z. B. wie man einen Bohrer hält, wo gebohrt und wann das Bohren beendet werden soll.
