Wir danken Orija Vardi für die Unterstützung in Zahlen zu erzeugen. Die Arbeit in der IS-Gruppe wurde von der Israel Science Foundation (Zuschuss Nr 567/10) und des European Research Council Starting Grant (# 281306) unterstützt.

Hinweis: ToR kann nur auf das Wachstum, unsynchronisierten Zellen gemessen werden. 2 x 10 6 schnell wachsende Zellen, die in der Regel in ~ 1 x 10 5 Zellen in der S - Phase (die Rate limitierende Schritt) führt - Das Verfahren sollte mit mindestens 1 beginnen. Es wird empfohlen, jedes Experiment unter Verwendung von zwei oder drei Wiederholungen durchzuführen. Der gesamte Prozess der CNR-TOR kann innerhalb einer Woche abgeschlossen werden - 2 Tage sollten für die anfängliche Datenanalyse notwendig, bis zu Bibliotheks Vorbereitung, ein bis zwei Tage benötigt werden für die Sequenzierung und einen zusätzlichen Tag, um alle Schritte gewidmet. 1. Sammlung von Zellen, die aus Kultur HINWEIS: Das Protokoll für die Zellen geschrieben wird in Kultur in 10 cm - Platten (die etwa 2 bis 5 x 10 6 Zellen) wachsen, kann aber leicht auf andere Plattformen angepasst werden. <ol><li> Für Zellen, die in Suspension gezüchtet wurden, gehen Sie zu einer Fixierung (Abschnitt 2). </li><li> Für anhaftenden Zellen, absaugen und waschen die plaß mit 3 ml PBS ohne Ca 2+ und Mg 2+. </li><li> Entsorgen Sie die PBS und Inkubation der Zellen für 5 min bei 37 ° C mit 1 ml kommerzielle Trypsin-EDTA, bis die Zellen zu lösen. HINWEIS: Die Dauer der Trypsin-Behandlung sollte auf jeden Zelltyp eingestellt werden. </li><li> 3 ml Kulturmedium um das Trypsin zu neutralisieren und zu sammeln Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen oder eine 5 ml Polystyrolröhrchen. Halten Sie sich auf dem Eis. </li></ol> 2. Fixation HINWEIS: Für diesen Teil sollten alle Schritte bei 4 ° C durchgeführt werden. <ol><li> Zentrifugieren der Zellen bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Absaugen und waschen zweimal Zellen mit 1 ml kaltem PBS. </li><li> Die Zellen in 250 &amp; mgr; l (gesamt) kaltem PBS. </li><li> Während sanft das Röhrchen verwirbelt, langsam tropfenweise 800 &amp; mgr; l von -20 ° C 100% Ethanol hinzu. Dies führt zu einer endgültigen Ethanolkonzentration von 70-80%. HINWEIS: Hohe Reinheit Ethanol wird bei diesem Schritt empfohlen. </li><li> Inkubieren Zellen auf Eis for 30 min. HINWEIS: In dieser Phase-Zellen können für ein paar Tage bei 4 ° C oder für ein paar Monate bei -20 ° C aufbewahrt werden. </li></ol> 3. PI-Färbung <ol><li> Zentrifugieren der Zellen bei 500 xg für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Saugen Sie den Überstand vorsichtig und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1 ml kaltem PBS. </li><li> Aspirieren und resuspendieren jede Probe mit folgender Mischung: 1 ml PBS, 5 ul 10 mg / ml RNase A, 50 &amp; mgr; l 1 mg / ml Propidiumjodid (PI; mischen Flasche vor Gebrauch). Einstellen Konzentration von bis zu ~ 2 x 10 6 Zellen / ml). HINWEIS: Halten Sie aus Licht - PI Licht empfindlich ist. </li><li> Filter durch 35 &amp; mgr; m-Mesh zu einem 5 ml Polystyrolröhrchen, und in der Nähe mit Parafilm. </li><li> Inkubieren bei RT im Dunkeln für 15 - 30 min. HINWEIS: Die Zellen sind nun bereit für die FACS-Analyse. Falls erforderlich, können die gefärbten Zellen für mindestens 24 h bei 4 ° C im Dunkeln gelagert werden. </li></ol> 4. Sortieren <ol><li> Sortieren Zellen eine FACS-Maschine. Unse die 561-nm-Laser-Zellen auf ihre PI Intensität zu unterscheiden basiert. Andere Laser in der Nähe des 535 nm Anregungsmaximum wie 488 nm oder 532 kann in Abhängigkeit von der FACS Maschinenkonfiguration verwendet werden. </li><li> Für optimale Ergebnisse verwenden Sie die kleinste Düse für die spezifische Zellgröße empfohlen (für die meisten Zellen 85 &amp; mgr; m). Priorisieren Reinheit Modi gegenüber der Ausbeute. Verwenden Sie einen stetigen langsamen Fluss, in der Regel bis zu 300 bis 500 Veranstaltungen / s, mit einem Mantel Druck von 45 psi. </li><li> Mit Gating diskriminieren toten Zellen und subzellulärer Schutt (niedrige FCS und hohe SSC) durch Plotten FCS vs SSC. Von den lebenden Zellen unterscheiden Dubletten durch Auftragen SSC-Breite (W) vs SSC-Höhe (H) , gefolgt von einem FSC-W vs FSC-H Grundstück und durch PI- W vs PI-H (Dubletten die gleiche H-Wert haben aber größer W-Wert). Für die tragfähige einzelnen Zellen zeichnen ein Histogramm des PI-Bereich (A) Intensität, die den DNA-Gehalt der Zellen darstellt. </li><li> Sortier Zellen in G1 und S - Phasen, wie in Figur 1 gezeigt. Gating für S sollte breit sein und dringen in die G1 und G2-Phase, während G1 Gating schmal sein sollte und so weit von S wie möglich. </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55157/55157fig1.jpg" /> Abbildung 1. Die Zellzyklusphasenbestimmung auf Basis von PI Intensität. Histogramm zeigt die Verteilung der zellulären DNA-Gehalt (gemessen durch PI-Area) von embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) Bevölkerung zeigt. Der DNA - Gehalt wird verwendet , um die Bevölkerung in zwei Subpopulationen i) G1 - Zellen (2N DNA - Gehalt) und ii) S - Phasen - Zellen (2N zu sortieren - 4N DNA - Gehalt), die markierten Regionen mit. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55157/55157fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55157/55157fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> HINWEIS: Der Zweck der Sammlung von G1-Zellen ist für Verzerrungen in der Sequenzierungseffizienz zwischen verschiedenen genomischen Regionen zu berücksichtigen. Eine alternative AppRotauge ist auf G1 arretierten Zellen aus dem gleichen Zelltyp verwenden. Dieser Ansatz gibt sauberere Ergebnisse (da es die S-Phase Kontamination minimiert), aber es kann Verzerrungen einführen von genetischen Unterschieden zwischen den arretierten Zellen und den gemessenen Zellen stammen. <ol start="5"><li> Sortieren in der Kälte und sortierten Zellen in 1,5 / 2 ml-Röhrchen zu sammeln. Halten Sie Röhrchen auf Eis nach Art. ANMERKUNG: Um DNA - Gewinnung zu verbessern, ist es besser , niedrige Bindungsrohre zu verwenden oder Röhren mit 4 beschichtet zu verwenden - 5% BSA für 1 - 3 Stunden bei 4 ° C 18. </li></ol> 5. DNA Purification <ol><li> Für jede Probe (G1 und S) reinigen DNA, die eine DNA-Reinigung-Kit. HINWEIS: Bei der kommerziellen Kits, eluiere mit 400 &amp; mgr; L Elutionspuffer in eine 2 ml-Röhrchen für hohe Ausbeute, wie vom Hersteller empfohlen. </li><li> Überprüfen DNA-Konzentration Fluorometer verwendet wird. HINWEIS: Von 100.000 Säugetieren durch die FACS gesammelten Zellen, sollte man ~ 1 ug DNA erhalten. EINt Diese Stufe DNA kann für ein paar Tage bei 4 ° C oder bei -20 ° C für lange Lagerung gehalten werden. </li></ol> 6. Beschallen <ol><li> Transfer-DNA in ein 1,7 ml-Röhrchen, die mit dem magnetischen Ständer kompatibel verwendet. </li><li> Konzentrieren Sie DNA mit 2x SPRI Perlen gemäß den Anweisungen des Herstellers, einen magnetischen Ständer benutzt wird, und Eluieren in 50 &amp; mgr; l Elutionspuffer. </li><li> Shear-DNA mit einem fokussierten Ultraschallgerät auf eine durchschnittliche Soll-Spitzengröße von 250 bp. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen für eine 50 &amp; mgr; l DNA-Probe: 50 W, 20% Einschaltdauer, 200 Zyklen pro Burst, 20 ° C, 120 s. </li><li> Überprüfen Sie die Größe der gescherten DNA durch Elektrophorese. Die empfohlene Größenverteilung von 200 bis 700 bp mit einem Peak bei ~ 250 bp. HINWEIS: In diesem Stadium DNA kann für ein paar Tage bei 4 ° C oder bei -20 ° C für lange Lagerung gehalten werden. </li></ol> 7. Bibliothek Vorbereitung, und Sequenzierung HINWEIS: Viele Bibliothek Vorbereitungs-Kits und unterscheidenent-Sequenzierungsplattformen sollten ähnlich den Abschnitt in den Materialien, die von uns und erwähnt Gebrauchten arbeiten. Tatsächlich in der Vergangenheit wurden ToR Karten 2 erzeugt ein sehr ähnliches Verfahren mit Mikroarray - Plattformen. <ol><li> Bereiten Sie Bibliotheken mit jeder kommerziellen Bibliothek Vorbereitung Kit. </li><li> Am Ende der Bibliothek Vorbereitung, wählen Sie Größe unter Verwendung von magnetischen Kügelchen für 300 bis 800 bp. </li><li> Nach Bibliotheken Vorbereitung messen Fluorometer DNA-Konzentration verwendet wird. </li><li> Messen Sie DNA-Größen Elektrophorese. </li><li> Führen Sie die Sequenzierung auf jeder Plattform. HINWEIS: Sequencing mindestens 10 M liest pro Probe empfohlen. Diese Tiefe entspricht lesen eine etwa alle 300 bp (für ~ 3 Gb Größe Genome), und ist mit einer Auflösung von 50 für ToR Messungen ausreichend - 100 kb. die Tiefe Erhöhung in einer Verringerung der Größe der Fenster führen wird und somit ermöglicht Auflösung mit höherer Sicherheit zu erhöhen. Gepaart Ende Sequenzierung ist nicht notwendig, indieses Protokoll, da nur Abdeckung Informationen gesammelt. Es kann jedoch helfen, die Position bei der Lösung der liest, die repetitive Sequenzen enthalten. </li></ol> 8. Analyse HINWEIS: Die Datenanalyse wird auf dem von A. Koren et al - Verfahren. 19. <ol><li> Karte Sequenzierungsdaten zu dem entsprechenden Genom bowtie2 oder eine zuverlässige kurze Lese Ausrichter mit. Definieren unterschiedlicher Größe, gleicher Abdeckung chromosomalen Fenster als 200 liest in der G1-Fraktion bedeckt Segmente und zählen liest S-Phase in den gleichen Fenster. </li><li> Berechnen Sie den S / G1-Verhältnis für jedes Fenster. Dies sollte eine Karte mit großen Schwankungen in der S / G1 - Verhältnis entlang des Genoms (3) erzeugen. Eine gute Kontrolle für die Zuverlässigkeit der ToR Messungen ist diese Karte das G1 / G1-Verhältnis zu vergleichen (aus zwei separaten Messungen von G1), die wesentlich flacher sein sollte. </li><li> Normalisieren Daten auf 0 bedeuten und 1 SD durch von jedem v Subtrahierenert den Durchschnittswert aller Fenster (mit Ausnahme des X-Chromosoms) und die Ergebnisse durch die Standardabweichung des S / G1 aller Fenster unterteilt wird. Dies wird getan, um zu Z-Werte konvertieren und den Vergleich zwischen verschiedenen Experimenten ermöglichen. </li><li> Entfernen Sie alle Spaltbereiche durch den Browser UCSC Genom aufgelistet sowie jede verbleibende Zwischen Lücke Fragment weniger als 15 Datenfenster enthält. </li><li> Glätten Sie die verbleibenden Fragmente mit einer kubischen Spline Glättungs über die Matlab - Funktion csaps mit einem Parameter von 10 bis 16 und interpolieren zu festgelegten Punkten alle 100 kb. HINWEIS: Parameter der Glättung und Interpolation auf Basis der Tiefe der Daten eingestellt werden. Andere geeignete Glättungsverfahren und Funktionen vorhanden sind und verwendet werden können. </li><li> Nach visuell die Zuverlässigkeit jedes replizieren Bestätigung verschmelzen alle liest und eine tiefere Auflösung Profil berechnen, indem die gleichen Verfahren auf diesen Daten oben beschrieben durchgeführt wird. </li></ol>

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CNR-TOR kann im Prinzip auf jede eukaryotische proliferierenden Zellpopulation durchgeführt werden , die durch FACS zu S und G1 - Phasen (rezensiert von Rhind N. und Gilbert DM 20) unterteilt werden kann. Das hier beschriebene Verfahren hat sich an Säugerzellen mit einer Genomgröße von ~ 3 Gb wie Mensch und Maus angepasst. Kleine Änderungen in der CNR-TOR-Protokoll (in Zellpräparation und Sequenzierung Tiefe) werden benötigt, um es an andere Eukaryoten einzustellen. Es ist auf die Sammlung...

Mammalian DNA-Replikation ist streng reguliert die exakte Replikation jedes Chromosoms während des Zellzyklus genau einmal zu gewährleisten. Die Replikation erfolgt gemäß einem stark regulierten Ordnung - mehrere große genomischen Regionen (~ Mb) zu Beginn der S - Phase repliziert (frühe Domänen replizieren) , während andere Genomregionen später bei mittleren oder späten S - Phase (Mitte und Ende der replizierenden Domänen) replizieren 1. Der größte Teil des Genoms repliziert zur gleichen Zeit in allen Geweben (konstitutive ToR Domänen), während die 30% - 50% des Genoms, ändert seine ToR zwischen Geweben 2, während der Differenzierung 3, 4 und in geringerem Maße auch während der Krebstransformation 5 . Darüber hinaus sind bestimmte replizieren genomischen Regionen asynchron 6, 7, 8, nämlich ein Unterschied bestehtin den ToR zwischen den beiden Allelen. ToR korreliert mit vielen genomischen und epigenomischen Funktionen , einschließlich der Transkription Ebenen, GC - Gehalt, Chromatinzustand, Gendichte, usw. 1, 9. ToR ist auch mit Mutationsraten und Typen zugeordnet sind 10, 11 und daher wenig überraschend, Störungen des Replikationsprogramms an Krebs 12, verbunden 13. Der kausale Zusammenhang zwischen ToR und Chromatinstruktur ist noch nicht verstanden. Es ist möglich, dass offene Chromatin frühen Replikation ermöglicht. Jedoch schlägt ein alternatives Modell , dass das Chromatin während der Replikation und die verschiedenen Chromatin - Regulatoren am Anfang und Ende der S Phasenvoreilung Verpackung Differentials der frühen und späten replizierende Regionen 1, 14 zusammengesetzt ist </sup&gt;. Wir haben kürzlich gezeigt , dass die ToR formt den GC - Gehalt durch die Art der Mutationen betreffen , die 11 in verschiedenen genomischen Regionen auftreten. Fluoreszenz - in - situ - Hybridisierung (FISH) ist die wichtigste Methode für ToR an einzelnen Loci zu messen. Es wird durchgeführt , indem einfach der Prozentsatz von S - Phasen - Zellen zu zählen , die einzelne FISH - Signale gegen den Prozentsatz der Dubletten für ein bestimmtes Allel 15, 16 aufweisen. Ein alternatives Verfahren besteht aus Impuls mit BrdU die DNA - Markierung, 17 Zellen entsprechend ihrem DNA - Gehalt zu mehreren Zeitpunkten längs S, Immunpräzipitation DNA enthält BrdU und Überprüfung der Fülle von gefällter DNA mit qPCR Sortierung. Genomic ToR Zuordnung kann durch zwei Methoden erreicht werden. Die erste Methode ist eine genomische Version des BrdU-IP basierten oben beschriebenen Verfahren, bei dem die Quantifizierung der Mengevon gefällte DNA in jeder Fraktion wird gleichzeitig für das gesamte Genom durch Hybridisierung mit Microarrays oder durch tiefe Sequenzierung durchgeführt. Die zweite Methode, CNR-TOR, basiert die Kopienzahl jeder genomischen Region von S-Phasen-Zellen und Normalisierung durch den DNA-Gehalt in Zellen G1 zu messen. Bei diesem Verfahren werden die Zellen durch FACS in nicht-replizierenden (G1 - Phase) und Replizieren (S - Phase) Gruppen (1) sortiert. Zellen in G1 haben die gleiche Kopienzahl in allen genomischen Regionen und somit sollten ihren DNA-Gehalt gleich sein. Auf der anderen Seite hängt die DNA-Kopienzahl in S auf der ToR, seit Anfang replizierende Regionen unterzog Replikation in den meisten Zellen und wird daher ihre DNA-Gehalt verdoppelt, während spät replizierende Regionen noch nicht in den meisten Zellen repliziert wurden und damit deren DNA-Gehalt werden dem von G1-Zellen ähnlich. Daraus ergibt sich die S G1 Verhältnis von DNA-Gehalt der ToR indikativ. Die Menge an DNA für jeden genomischen Region wird entweder durch Hybridisierung gemessenMicroarrays oder durch tiefe Sequenzierung 2, 8. Die Vorteile des CNR-TOR Verfahren wird weiter diskutiert. Dieses Papier beschreibt die CNR-ToR Verfahren zur genomischen ToR - Mapping , wie in Abbildung 2 beschrieben. Das Papier beschreibt die feinen Details des gesamten Prozesses von Zellen, bis die grundlegenden Analyse der Ergebnisse und der Erstellung von genomischen ToR Karten zu sammeln. Das Protokoll in diesem Papier beschrieben wurde auf verschiedenen Zelltypen in Kultur gezüchtet erfolgreich durchgeführt. Zukünftige Verbesserungen dieses Protokolls können in vivo zu der Abbildung des ToR führen und in seltenen Zelltypen.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>BI (Biological Industries)</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>BI (Biological Industries)</td><td>03-052-1B</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tube</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Polystyrene round Bottom tube with cell strainer cap&amp;nbsp;</td><td>BD-Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Gadot</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RNAse-A 10 mg/mL</td><td>Sigma</td><td>R4875</td><td></td></tr><tr><td>Propidiom iodide 1 mg/mL</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Parafilm</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL DNA LoBind Eppendorf tubes&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL MaxyClear tube&amp;nbsp;</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>magnetic beads - Agencourt AMPure XP&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonicator</td><td>Covaris</td><td>M-series&amp;nbsp; -530092</td><td></td></tr><tr><td>50 &amp;micro;L microTUBE AFA Fiber Screw-Cap 6 x 16 mm</td><td>Covaris</td><td>520096</td><td></td></tr><tr><td>Qubit fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis 2200 Tape station system</td><td>Agilent</td><td>D1000 ScreenTape</td><td></td></tr><tr><td>Seqeuncing - Illumina NextSeq system</td><td>Illumina</td><td>SY-415-1001</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy kit for DNA purification</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>PureProteom Magnetic Stand</td><td>Millipore</td><td>LSKMAGS08</td><td></td></tr><tr><td>Anti-BrdU/FITC</td><td>DAKO</td><td>F7210</td><td></td></tr><tr><td>FACS sorter</td><td>BD</td><td>FACSARIA III</td><td></td></tr><tr><td>FACS software</td><td>BD</td><td>FACSDiva v 8.0.1</td><td></td></tr></tbody></table>

genome-wide determination of mammalian replication timing by dna content measurement

Replikation des Genoms erfolgt während der S-Phase des Zellzyklus in einem stark regulierten Prozess, der die Genauigkeit der DNA-Vervielfältigung gewährleistet. Jede genomischen Region wird an einer bestimmten Zeit während der S-Phase durch die gleichzeitige Aktivierung mehrerer Replikationsursprünge repliziert. Zeit-Replikation (ToR) korreliert mit vielen genomischen und epigenetische Merkmale und ist mit Mutationsraten und Krebs in Verbindung gebracht. Begreifen die vollständige genomische Ansicht des Replikationsprogramm, in Gesundheit und Krankheit ist ein wichtiges Ziel für die Zukunft und Herausforderung. Dieser Artikel beschreibt im Detail die &quot;Copy Number Verhältnis von S / G1 zum Abbilden genomischen Zeit-Replikation&quot; Methode (hier genannt: CNR-ToR), einen einfachen Ansatz der genomweiten ToR von Säugetierzellen abzubilden. Das Verfahren basiert auf der Kopienzahlunterschiede zwischen der S-Phase-Zellen und G1-Phasen-Zellen. 1. Herstellung von Zellen und Färbung mit Propidiumiodid (PI);: Der CNR-ToR Verfahren wird in 6 Schritten 2. Sorting G1 und S-Phasen-Zellen fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS); 3. DNA-Reinigung; 4. Ultraschall-Behandlung; 5. Bibliothek Vorbereitung und Sequenzierung; und 6. Die bioinformatische Analyse. Die CNR-ToR-Methode ist eine schnelle und einfache Ansatz, der in der detaillierten Replikation Karten führt.

Eine typische ToR Karte ist in Abbildung 3 für embryonalen Maus - Fibroblasten (MEF) gezeigt. Diese Figur zeigt den Analyseprozess, da es zeigt sowohl die Punkte, die die normierte S / G1-Verhältnis für einzelne Fenster (Schritt 8.3), sowie die Linie, die sich von der kubischen Glättung ergibt und Interpolation (Schritt 8.5). Solche Karten, um die Organisation des Replikationsprogramms zu erfassen, die ein...

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Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

Genomweite Bestimmung der Mammalian Replication-Timing von Inhaltsmessung DNA

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

genome-wide-determination-mammalian-replication-timing-dna-content

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Genetics

8.4K Aufrufe.  Hebrew University of Jerusalem. We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

Serie: Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have been directed toward elucidation of the location and timing of initiation of genome duplication rather than its completion. However, it is critical that we understand regions of the genome that are last to complete replication, because these regions suffer elevated levels of chromosomal breakage and mutation, and they have been associated with both disease and aging. Here we describe how we have extended a technique that has been used to monitor replication initiation to instead identify those regions of the genome last to complete replication. This approach is based on a combination of flow cytometry and high throughput sequencing. Although this report focuses on the application of this technique to yeast, the approach can be used with any cells that can be sorted in a flow cytometer according to DNA content.

We describe a technique for combining flow cytometry and high throughput sequencing to identify late replicating regions of the genome.

G2-Seq: Ein hoher Durchsatz Sequenzierung-basierten Methode zur Identifizierung von spät repliziert Regionen des Genoms

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Forschung

Genetik

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Visualizing Einzel-Molekül-DNA-Replikation mit Fluoreszenz-Mikroskopie

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Biologie

<meta charset="utf8"></head><body>2D-Gelelektrophorese zur Analyse der DNA-Replikation und von Fork-Stalling-Ereignissen

Electrophoretic Analysis of Replication Through Structure-Prone DNA Repeats Within the SV40-Based Human Episome

Two-dimensional neutral/neutral gel-electrophoresis (2DGE) emerged as a benchmark technique to analyze DNA replication through natural impediments. This protocol describes how to analyze replication fork progression through structure-prone, expandable DNA repeats within the simian virus 40 (SV40)-based episome in human cells. In brief, upon plasmid transfection into human cells, replication intermediates are isolated by the modified Hirt protocol and treated with the DpnI restriction enzyme to remove non-replicated DNA. Intermediates are then digested by appropriate restriction enzymes to place the repeat of interest within the origin-distal half of a 3-5 kb-long DNA fragment. The replication intermediates are separated into two perpendicular dimensions, first by size and then by shape. Following Southern blot hybridization, this approach allows researchers to observe fork stalling at various structure-forming repeats on the descending half of the replication Y-arc. Furthermore, this positioning of the stall site allows the visualization of various outcomes of repeat-mediated fork stalling, such as fork reversal, the advent of a converging fork, and recombinational fork restart.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Charakterisierung der DNA-Replikation pathogener Wiederholungen zur Aufdeckung von Mechanismen des Abwürgens und der Expansion von Replikatio

Here, we outline the procedure for analyzing replication progression through pathogenic, structure-prone repeats using 2-dimensional gel electrophoresis.

Elektrophoretische Analyse der Replikation durch strukturanfällige DNA-Wiederholungen innerhalb des SV40-basierten humanen Episoms

Two-dimensional neutral/neutral gel-electrophoresis (2DGE) emerged as a benchmark technique to analyze DNA replication through natural impediments. This ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

Direkte Beobachtung von Enzymen Replizieren DNA Mit einem Single-Molekül DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Proximity Ligation Assay to Study Oncogene-Derived Transcription-Replication Conflicts

Both DNA replication and RNA transcription utilize genomic DNA as their template, necessitating spatial and temporal separation of these processes. Conflicts between the replication and transcription machinery, termed transcription-replication conflicts (TRCs), pose a considerable risk to genome stability, a critical factor in cancer development. While several factors regulating these collisions have been identified, pinpointing primary causes remains difficult due to limited tools for direct visualization and clear interpretation. In this study, we directly visualize TRCs using a proximity ligation assay (PLA), leveraging antibodies specific to PCNA and phosphorylated CTD of RNA polymerase II. This approach allows precise measurement of TRCs between replication and transcription processes mediated by RNA polymerase II. The method is further enhanced through DNA primers conjugated covalently to these antibodies, coupled with PCR amplification using fluorescent probes, providing a highly sensitive and specific means of detecting endogenous TRCs. Fluorescence microscopy enables the visualization of these conflicts, offering a powerful tool to study genome instability mechanisms associated with cancer. This technique addresses the gap in direct TRC visualization, allowing for a more comprehensive analysis and understanding of the underlying processes driving genome instability in cells.

Here, we present a sensitive and specific method to detect oncogene-induced transcription-replication conflicts (TRCs) using the proximity ligation assay (PLA). This approach leverages specific antibodies targeting PCNA and phospho-CTD RNAPII, enabling the assessment of TRC prevalence between RNA polymerase II transcription and DNA replication machinery.

Proximity-Ligation-Assay zur Untersuchung von Onkogen-abgeleiteten Transkriptions-Replikationskonflikten

Both DNA replication and RNA transcription utilize genomic DNA as their template, necessitating spatial and temporal separation of these processes. ...

Krebsforschung

<meta charset="utf8"></head><body>CMG-vermittelte DNA-Dewindung durch Wachstum des ssDNA-RPA-Trakts beobachtet

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a dynamic complex of proteins termed the replisome. At the heart of the replisome is the&#160;CDC45-MCM2-7-GINS (CMG) helicase, which separates the two strands of the DNA double helix such that DNA polymerases can copy each strand. During genome duplication, replisomes must overcome a plethora of obstacles and challenges. Each of these threatens genome stability, as failure to replicate DNA completely and accurately can lead to mutations, diseases, or cell death. Therefore, it is of great interest to understand how CMG functions in the replisome during both normal replication and replication stress. Here, we describe a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy assay using recombinant purified proteins, which allows for real-time visualization of surface-tethered stretched DNA molecules by individual CMG complexes. This assay provides a powerful platform to investigate CMG behavior at the single-molecule level, allowing helicase dynamics to be directly observed with real-time control over reaction conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Entschlüsselung der Dynamik der eukaryotischen DNA-Replikation durch Einzelmolekül-Visualisierung

This protocol demonstrates performing a single-molecule assay for live visualization of DNA unwinding by CMG helicase. It describes (1) preparing a DNA substrate, (2) purifying fluorescently labeled Drosophila melanogaster CMG helicase, (3) preparing a microfluidic flow cell for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and (4) the single-molecule DNA unwinding assay.

Einzelmolekül-Echtzeit-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

Genomweite Bestimmung der Mammalian Replication-Timing von Inhaltsmessung DNA

Zusammenfassung

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G2-Seq: Ein hoher Durchsatz Sequenzierung-basierten Methode zur Identifizierung von spät repliziert Regionen des Genoms

Visualizing Einzel-Molekül-DNA-Replikation mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Elektrophoretische Analyse der Replikation durch strukturanfällige DNA-Wiederholungen innerhalb des SV40-basierten humanen Episoms

Elektrophoretische Analyse der Replikation durch strukturanfällige DNA-Wiederholungen innerhalb des SV40-basierten humanen Episoms

Elektrophoretische Analyse der Replikation durch strukturanfällige DNA-Wiederholungen innerhalb des SV40-basierten humanen Episoms

Direkte Beobachtung von Enzymen Replizieren DNA Mit einem Single-Molekül DNA Stretching Assay

Proximity-Ligation-Assay zur Untersuchung von Onkogen-abgeleiteten Transkriptions-Replikationskonflikten

Einzelmolekül-Echtzeit-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase

Einzelmolekül-Echtzeit-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase

Einzelmolekül-Echtzeit-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase