Bereiten Sie zunächst die doppelsträngigen Chitosan-RNA-Nanopartikel für die Fütterung der Seidenraupenlarven vor. Pflücken Sie dann frisch gehäutete Seidenraupenlarven des fünften Stadiums ähnlicher Größe für das Fütterungsexperiment. Legen Sie jede Larve einzeln in eine Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen.
Decken Sie den Teller ab und lassen Sie die Larven 24 Stunden lang hungern. Spülen Sie anschließend frische Maulbeerblätter mit entionisiertem Wasser ab und trocknen Sie sie mit sauberem Küchenpapier ab. Schneide die vollständig getrockneten Blätter in einen Zentimeter mal einen Zentimeter großen Blattscheiben.
Lösen Sie die Chitosan dsRNA-Nanopartikel vor Gebrauch in nukleasefreiem Wasser in einer Konzentration von 500 Nanogramm pro Mikroliter auf. Beschichten Sie 10 Mikroliter Chitosan-dsRNA-Nanopartikel, kontrollieren Sie Chitosan-Nanopartikel und nackte dsRNA separat auf der Oberfläche jeder Maulbeerblattscheibe. Lassen Sie die Lösungen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur auf den Blattscheiben an der Luft trocknen.
Bieten Sie als Nächstes jeder Larve jeden Tag eine mit Nanopartikeln oder dsRNA beschichtete Blattscheibe an. Sobald die beschichtete Blattscheibe vollständig von den Larven verzehrt ist, geben Sie jeden Tag frische Maulbeerblätter. Am sechsten Tag legen Sie die Larven auf Eis, bis sie unbeweglich sind.
Um die Larven zu sezieren, schneidet man den Thorax mit einer Schere auf einer sauberen Petrischale ab und zieht mit einer Pinzette den Mitteldarm heraus. Nach dem Entfernen des Inhalts. Waschen Sie den Mitteldarm in einer Petrischale mit nukleasefreiem Wasser.
Frieren Sie den Mitteldarm bei minus 70 Grad Celsius in einer 1,5-Milliliter-Tube ein. Die Fütterung von Chitosan-dsRNA-Nanopartikeln in Seidenraupen führte zu einer 79%igen Reduktion der BmToll9-2-Transkriptspiegel im Vergleich zu Kontrollbehandlungen. Seidenraupenlarven, die mit BmToll9-2-silencing Chitosan dsRNA-Nanopartikeln behandelt wurden, waren sichtbar kleiner als die Kontrolllarven.
Die Kokons von BmToll9-2-stummgeschalteten Larven waren ebenfalls signifikant kleiner als die der Kontrollgruppe.
