RNAi hat sich zu einer effektiven Methode zur Identifizierung der Funktion von Genen in Nematoden entwickelt und wird als neuer Weg zur effektiven Kontrolle pathogener Nematoden vorgeschlagen. RNAi ist das Einweichen von Nematoden in dsRNA kann für das Verfahren ausreichen. Sammeln Sie zunächst die Nematoden mit der Baermann-Trichtermethode.
Legen Sie dazu einen klemmten Gummischlauch unter einen Trichter und legen Sie zwei Schichten Filterpapier in den Mund des Trichters. Die Botrytis cinerea-Pilzkulturen in den Trichter geben und Wasser hinzufügen, um die Pilzmatte einzutauchen. Wenn Nematoden gesammelt werden, fügen Sie 500 Mikroliter Extraktionsreagenz und 100 Mikroliter Magnetperlen zu einem Zentrifugenröhrchen mit zwei Millilitern hinzu.
20 Mikroliter der Nematoden absaugen und die Proben bei 9.000 x g 30 Sekunden lang mahlen. Fünf Minuten inkubieren und bei 12.000 x g 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Den Überstand in ein frisches Zentrifugenröhrchen überführen.
Fügen Sie 100 Mikroliter Chloroform hinzu und mischen Sie, indem Sie das Röhrchen mehrmals umdrehen. Drei Minuten inkubieren und dann bei 12.000 x g 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Übertragen Sie den Überstand erneut in ein frisches Zentrifugenröhrchen.
Fügen Sie 250 Mikroliter Isopropylalkohol hinzu und wirbeln Sie kräftig. Zentrifugieren bei 12.000 x g für 10 Minuten und Wirbel. Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie 500 Mikroliter 75% Ethanol hinzu, um die RNA zu waschen.
Wirbeln Sie die Probe an, gefolgt von einer Zentrifugation bei 12.000 x g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Trocknen Sie das RNA-Pellet fünf Minuten an der Luft und resuspendieren Sie es in 30 Mikrolitern RNase-freiem Wasser. Berechnen Sie die RNA-Konzentration mit dieser Formel und berechnen Sie das Verhältnis von A260 zu A280.
Als nächstes verwenden Sie ein Paar Primer, um die teilweise kodierende Sequenz des BX ppm-1-Gens aus dem B.xylophilus zu amplifizieren. Dann klonen Sie die ppm-1 one-Gensequenzen in einen pGEM-T Easy-Vektor, der den T7-Promotor enthält. Wiederherstellung des 894 Basenpaares langes ppm-1-Genfragment, indem das klonierte Plasmid als Vorlage für pcr verwendet wird.
Verwenden Sie dann ein In-vitro-Transkriptionskit, um die dsRNA zu synthetisieren. Analysieren Sie die Qualität der dsRNA mit einem Spektralphotometer und visualisieren Sie die Produkte auf einem 1%Agarose-Gel. Fügen Sie vier Mikroliter 5X Einweichpuffer hinzu und füllen Sie das Volumen auf 20 Mikroliter mit doppelt destilliertem Wasser, um eine endgültige RNA-Konzentration von 0,8 Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten.
Dann legen Sie die Nematoden für 30 Minuten in die Schale und warten Sie, bis die Eier am Boden haften. Entfernen Sie vorsichtig das Wasser und die Nematoden, ohne die Eier zu stören, bis nur noch die Eier in der Schale verbleiben. Die gesammelten Eier im Dunkeln bei 25 Grad Celsius für 24 Stunden ausbrüten, um J2-Larven zu erhalten.
Sammeln Sie die Larven in einem Röhrchen und waschen Sie sie dreimal mit doppelt destilliertem Wasser. Dann werden die Larven in das Röhrchen mit der dsRNA-Lösung überführt. Fügen Sie dazu Resorcin hinzu, um eine 1% ige Lösung zu erhalten.
Legen Sie die Larven auf einen Schütteltisch, um eine ausreichende Aufnahme von dsRNA in die Larven zu gewährleisten. Für Kontrollen ist die gleiche Menge Nematoden ohne die dsRNA-Sonde oder mit einer GFP-dsRNA-Sonde in den Einweichpuffer eingeweicht. Führen Sie eine qPCR mit den actB- und tbb-2-Genen als interne Referenzen durch, um die Veränderungen des Genexpressionsniveaus zu bewerten.
Verwenden Sie die delta-delta-Ct-Methode, um das relative Genexpressionsniveau aus der Auflösungskurve und dem Ct-Wert zu schätzen. Nach RNAi kultivieren Sie die J2-Larven bis ins Erwachsenenalter auf Botrytis cinerea-Rasenflächen auf PDA-Platten. Sammeln Sie die Erwachsenen mit der Baermann Trichtermethode, wie in Abschnitt eins gezeigt.
Nehmen Sie Bilder der erwachsenen Nematoden unter einem Mikroskop auf und verwenden Sie die ImageJ-Software, um die Körperlänge von 50 männlichen und 50 weiblichen Nematoden zu messen. Analysieren Sie die Daten, indem Sie den Mittelwert und die Standardabweichung für jede Stichprobe berechnen. Wenden Sie den Student's t-Test an, um die Mittelwerte der Stichproben aus den verschiedenen Gruppen zu vergleichen.
Die Analyse der relativen Genexpression nach RNAi zeigte, dass die ppm-1 dsRNA die Expression des ppm-1 one-Gens von B.Xylophilus wirksam hemmen kann. Während exogene GFP dsRNA keinen Einfluss auf die ppm-1-Expression hatte. Nach RNAi nahm die Größe der Erwachsenen trotz Erreichen der Geschlechtsreife deutlich ab, was zu dem kleinen mutierten Phänotyp der Körpergröße führte.
Die mittlere Körperlänge der mutierten Weibchen und Männchen betrug 544 und 526 Mikrometer im Vergleich zu 971 und 912 Mikrometer für die Kontrollgruppe. Das Wichtigste ist, die Nematoden in die Doppelstrang-RNA-Lösung zu übertragen und ein weiteres Reagenz hinzuzufügen, um die Nematoden zum Fressen anzuregen. Diese Methode eignet sich für großflächige Genscreens und wird häufig in der Zellforschung eingesetzt. Die Untersuchung der Genfunktion von B.Xylophilus mit dieser Methode hat Leitwert für die biologische Kontrolle von B.Xylophilus.
