Isolierung und Verarbeitung von Whole-Mount-Netzhäuten für die Immunfärbung von retinalen Ganglienzellen der Maus

Nachdem Sie die Maus mit einer zervikalen Dislokation für die Enukleation und die Verarbeitung des Augapfels eingeschläfert haben, markieren Sie den Rand der Hornhaut auf der dorsalen Seite des Augapfels mit einem blauen Marker, um die Orientierung während der Dissektion sicherzustellen. Entfernen Sie mit einer Schere restliches Muskelgewebe, das am Augapfel befestigt ist. Übertragen Sie dann den enukleierten Augapfel in ein zwei Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen mit rundem Boden, das mit PBS gefüllt ist.

Legen Sie nun den Augapfel in ein weiteres Zwei-Milliliter-Röhrchen mit frisch zubereitetem 4%-Paraformaldehyd zur Fixierung bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Unter einem Präpariermikroskop machst du mit einer feinen Pinzette einen kleinen Schnitt an der Hornhaut. Legen Sie den Augapfel wieder in das Fixiermittel und inkubieren Sie ihn drei Stunden lang bei vier Grad Celsius, um die Gewebemorphologie zu erhalten.

Um die Hornhaut und die Linse zu entfernen, wird mit einer feinen chirurgischen Schere ein kleiner Schnitt von etwa einem Millimeter um den Hornhautlimbus, die Grenze zwischen Hornhaut und Sklera, gemacht. Schneiden Sie vorsichtig um den Umfang der Hornhaut herum und schneiden Sie sie vollständig aus, um die darunter liegenden Strukturen freizulegen. Fassen Sie dann mit einer feinen Pinzette die Linse vorsichtig an und heben Sie sie vorsichtig vom umgebenden Gewebe ab, um eine Beschädigung der Netzhaut zu vermeiden.

Für den Skleraschnitt schneiden Sie mit einer feinen Augenschere einen präzisen Schlitz in die Sklera, um die anschließende Dissektion zu erleichtern. Als nächstes führen Sie für die Netzhauttrennung eine Zahnzange in den Schnitt zwischen Sklera und Netzhaut ein. Fassen Sie vorsichtig den Rand der Sklera an und vermeiden Sie übermäßige Gewalt, um ein Reißen des Gewebes zu verhindern.

Vergrößern Sie den Schnitt allmählich, indem Sie die Pinzette entlang der Grenze zwischen Sklera und Netzhaut bewegen. Trennen Sie die Sklera vorsichtig mit dem Zahnteil der Pinzette von der Netzhaut, ohne sie zu beschädigen. Teilen Sie nun die Netzhaut mit einer scharfen Schere in vier etwa gleich große Lappen.

Entfalten Sie die präparierte Netzhaut vorsichtig mit einer weichen Borstenbürste und entfernen Sie sorgfältig Schmutz von der Oberfläche.