Diese Arbeit wird durch das Australian Research Council (ARC DP0988227) und der Biomedical Science Research Initiative Zuschuss der Disziplin der biomedizinischen Wissenschaft, The University of Sydney unterstützt. Die Ausrüstung Patch-Clamp-Verstärker EPC 8 wurde von der Startup Fund aus der Disziplin der biomedizinischen Wissenschaft, The University of Sydney finanziert. Die Ausrüstung InstruTECH LIA 8 +8 Datenerfassungssystem wurde mit den Mitteln aus Rebecca L. Cooper Foundation und Startup Fund aus der Disziplin der biomedizinischen Wissenschaft, The University of Sydney gekauft. Wir möchten den anonymen Gutachtern für ihre aufschlussreichen Anregungen und Kommentare danken.

1. Allgemeine Einrichten und Tissue Vorbereitung <ol><li> Halten Sie die Maus in der Dunkelheit für 30 min (Zweck hat, ihren Stress zu reduzieren). Während des Wartens, bereiten 1 L von extrazellulären Lösung. Zunächst löst 1,9 g Natriumhydrogencarbonat in einem halben Liter Milli-Q-Wasser. Ihr pH-Wert wird bei 7,4 durch Durchblasen mit 95% O 2 und 5% CO 2 gehalten. Fünf Minuten später auflösen 8,8 g Ames Medium in 100 ml Milli-Q Wasser, fügen Sie der Natriumhydrogencarbonat-Lösung, oben bis zu 1 L mit Milli-Q-Wasser und gut mischen. Diese Lösung wird für den Rest des Experiments carboxygenated. </li><li> Nehmen Sie 250 ml des carboxygenated Ames Medium und stellen Sie die Flüssigkeit Reperfusion System in der elektrophysiologischen Set-up. Halten Sie die Lösung carboxygenated. </li><li> Einheitlich Abstrich eine dünne Schicht Vakuumfett auf der Unterseite des Perfusionskammer. Seal es mit einem Deckglas und sicherzustellen, dass es luftdicht. Nehmen Sie eine kleine Menge Fett (~ 2 mm im Durchmesser) und platzieren Sie es auf der Oberseite undunteren Enden der Kammer. Diese Kugeln werden das Raster (Platin-Rahmen mit Zahnseide besaitet) in Position zu halten und verhindern, dass es zu hart drücken auf der Netzhaut. Fix die Kammer auf die Plattform und richten die beiden Öffnungen. </li><li> Das Tier ist mit Isofluran betäubt zuerst für 2 min, und dann durch Genickbruch getötet. Schnelles Entfernen Augen mit einer kleinen Schere (Schaufeln), gründlich mit carboxygenated extrazellulären Flüssigkeit in ein kleines Becherglas, und legen Sie dann in einer Petrischale mit carboxygenated extrazellulären Flüssigkeit gefüllt. </li><li> Unter dem Binokular, stellen ein Einführloch in der Hornhaut (~ 2 mm von der Kante) mit einem 19-Gauge-Nadel. Wiederholen Sie für das andere Auge. Dieser wichtige Schritt sollte schnell sein, um Sauerstoffversorgung sowohl retinae ermöglichen. Entfernen Sie eine Hornhaut mit einem kleinen Paar Iris Schere durch Schneiden parallel zu dessen Rand. Dann entfernen Sie den Iris und Linse mit einer feinen Pinzette. Wiederholen Sie für das andere Auge. Übertragen Sie ein Auge cup in ein Becherglas mitcarboxygenated extrazellulären Lösung. </li><li> Mit einem Skalpell, schnitt ein Auge Tasse in die Hälfte, in der Lage sein, um die whole-mount glätten und zu zwei Ganzkörper-Aufnahmen pro Netzhaut erhalten. Sorgfältig trennen die Netzhaut vom Pigmentepithel mit einem stumpfen Sezieren Sonde oder indem Sie es vorsichtig aus. Einmal gelöst, ist die Netzhaut ziemlich transparent. Beachten Sie die konvexe Oberfläche ist die Photorezeptoren Seite. Die konkave Oberfläche der Ganglienzellen Seite und es können sich aufgrund des Vorhandenseins von klebrigen Glaskörper haften. </li><li> Mit einer feinen Pinzette, halten Sie den Rand der abgelösten Netzhaut Gewebe in der Nähe der Ora serrata und greifen die ora serrata mit einem anderen Paar von feinen Pinzette, ziehen Sie sie in Richtung der Mitte der Netzhaut. Dies ist ein schwieriger Prozess und kann ein paar Versuche dauern. Wenn dies gelingt, sind ora serrata, Ziliarkörper und Glaskörper durch dieses Verfahren entfernt, und die Krümmung der Netzhaut verringert wird (dh flacher). </li><li> Schneiden Sie die Kanten, und dann übertragen sie auf die Pro-Fusion Kammer mit Ganglienzellen nach oben. Halten Sie das Gewebe an Ort und Stelle, indem das Gitter auf den Fett-Bälle. Legen Sie das verbleibende Gewebe mit dem anderen Auge Tasse für die spätere Verwendung. Ähnliche Verfahren zur retinalen Dissektion in Middleton und Protti 16 und Pottek et al. 17. </li><li> Montieren Sie die Aufnahme Kammer unter einem aufrechten Mikroskop. Unmittelbar Einrichten der kontinuierliche Perfusion der Netzhaut mit carboxygenated extrazellulären Lösung (35,5 ° C) bei einer Geschwindigkeit von 3 - 5 ml / min. Stellen Sie sicher, dass die Masse-Elektrode ist an Ort und Stelle. </li><li> An dem Mikroskop ist eine digitale Kamera ermöglicht die Visualisierung des Gewebes. Das ganze Set up sitzt über einem Luft-Tabelle (Stoßdämpfung) und innerhalb eines Faradayschen Käfigs (Blöcke externe statische und nicht-statische elektrische Felder). </li><li> Schalten Sie die Lichtquelle (Infrarot,&gt; 850 nm) und einem 40X-Objektiv, bringen ihren Fokus auf die Zellkörper der Ganglienzellen. Finden Sie den zentralen Bereich der whole-mount für recording. </li><li> Auftauen eine gefrorene Flasche K + basierte intrazellulären Lösung (300 ul, pH = 7,4), die (in mM) K-Gluconat: 140, HEPES Säure: 10, MgCl 2: 4.6, ATP-Na +: 4, GTP-Na + : 0,4 und EGTA: 10. Alle Reagenzien von Sigma-Aldrich. </li></ol> 2. Patching Zellkörper der retinalen Ganglienzellen <ol><li> Erstes Feuer polieren die Enden der Kapillare Borosilikatglas Glasröhren, dann ziehen Sie sie mit einem Glasmikroelektrode Abzieher mit zwei Heizstufen (Widerstand: 5 - 8 MQ). </li><li> In 3 ul Lucifer Yellow (Endkonzentration 0,2%) auf die intrazelluläre Lösung, gut mischen und zentrifugieren es. Als nächstes übertragen Sie die oberen 85% der Lösung in eine 1 ml Spritze, verbinden Sie es mit einem 0,22 um f ilter Einheit, dann zu einem 30 G wiederverwendbar Injektionsnadel. Kühlen. </li><li> Befestigen Sie die Glaspipette ähnlicher Größe wie die Spitze für Aufnahmen verwendet, in seiner Halterung und verschieben Sie sie unter dem Mikroskop mit einem micromanipulator. Unter einem 40X-Objektiv, langsam wieder die Pipette, bis er eine kleine Grübchen auf der Oberfläche der inneren Grenzmembran macht. Vorsichtig voran die Pipette nach vorne, bis es eine kleine Menge an Gewebe fängt, und bewegen Sie ihn dann nach oben und / oder seitlich ein kleines Loch, um die Zellkörper der Ganglienzellen aussetzen reißen. Je kleiner das Loch, desto höher ist der Grad der Integrität der Netzhaut Netzwerk aufrechterhalten wird. Falls gewünscht, Sulforhodamin 101 (SR101; 0,5-1 uM) kann in das extrazelluläre Medium zu beschädigten Nervenzellen durch Fluoreszenzmikroskopie 15 Bezeichnung hinzugefügt werden. </li><li> Füllen Sie eine saubere Pipette mit 8 - 10 ul der intrazellulären Lösung. Legen Sie es in die Halterung an der Verstärker-Kopf Bühne und stellen Sie sicher, das chlorierte Silberchloridelektrode eingetaucht ist. Verwerfen, wenn Schmutz und / oder Luftblasen vorhanden ist / sind. </li><li> Schalten Sie alle Geräte. Wir verwendeten einen EPC-8 Patch-Clamp-Verstärker von PatchMaster gesteuert Ganzzellableitungen in Voltage-Clamp-con erreichenFiguration. Beachten Sie, dass andere Verstärker, die Stromzange Aufnahmen erlauben im schnellen Modus können ebenfalls verwendet werden. Übernehmen und pflegen Überdruck in der Pipette Lösung. Markieren Sie eine Zelle mit einer großen Zellkörper so wahrscheinlich ist es ein Ganglienzellen anstatt einer verschobenen Amakrinzell oder Gliazellen. Langsam senken die Pipettenspitze so machen es ist ein kleines Grübchen auf der Oberfläche der Membran, zu stoppen und den Druck. Unmittelbar senken halten Potenzial - 60 mV. Sobald ein Giga (GOhm) zwischen ihnen erreicht wird, sanft zu saugen, um die Membran zu brechen, um eine Whole-Cell-Patch-Clamp-Konfiguration zu erzielen. Dieses Verfahren ist eine feine Schritt, wenn zu viel Unterdruck angelegt wird, wird die Verbindung undicht wird, wenn zu wenig, bleibt die Membran intakt. </li><li> Im Laufe der Zeit wird Lucifer Yellow füllen die Zelle, wodurch die Visualisierung der Zelle Morphologie. Wenn stabil, sollte dieses Set-up dauern 30 min oder mehr. </li></ol> 3. Aufnahmen von Ganglienzellen Mit Dynamitec Clamp <ol><li> Zunächst wird eine Strom-Spannungs-Test (von - 75 bis + 35 mV alle 10 mV) wird unter Verwendung PatchMaster. Gehen Sie zu einem späteren Zeitpunkt Tests nur dann, wenn eine große Na + Strom (&gt; 1 nA) vorhanden ist. Beachten Sie, dass in den seltenen Fällen, wo ein verschobener Amakrinzell gepatcht wird, in diesem Fall wird nicht mit Zügen der Aktionspotentiale nachfolgende Strominjektionen reagieren. </li><li> Offene LabVIEW und führen Sie die benutzerdefinierte geschrieben Neuroakuma Programm, dann laden verschiedene Wellenformen Leitwert. Set Wiederholungszahl bis 8 (6 - 8 für statistische Zwecke). Set Umkehrpotentiale von erregenden und hemmenden Leitwerte bei 0 und - 75 mV bzw.. Wählen Sie ein passendes Paar von erregenden und hemmenden Leitwerte für die Prüfung. Excitatory Leitwert trace (in grün) und hemmenden Leitwert trace (in rot), wird in der unteren Platte erscheinen. </li><li> Gehen Sie zurück zu PatchMaster, wählen Stromzange Modus und schalten Sie sofort den Verstärker Stromzange &#39;CC + Comm FAST &quot;-Modus. Dieser Modus erlaubt es, nachurately folgen schnelle Änderungen des Membranpotentials. Wenn eine gute Abdichtung zwischen der Membran und Pipette aufrecht erhalten wird, wenig / kein Ausgleich erforderlich ist, da sonst die Aufnahme wird nicht lange dauern. In Neuroakuma, drücken Sie die &quot;Record&quot;-Taste. Die zelluläre Antwort (in der Regel mit einer phasischen Platzen der Aktionspotentiale, 1A) wird auf der oberen Platte erscheinen. Spritzen Strom in der Zelle mit niedriger Skalierung der Leitwerte zuerst, wenn wenig / keine Antwort beobachtet wird, in kleinen Schritten erhöhen, bis es eine starke Reaktion produziert. Übermäßige Stromeinspeisung kann töten die Zelle. Sobald Tests abgeschlossen sind, wählen Sie ein neues Paar Leitwert Wellenformen, wiederholen Sie die oben für alle Paare von physiologischen und künstliche Leitwerte. Die physiologischen Ströme (I) in Echtzeit injiziert basieren auf: I (t) = G exc (t) x (V m (t) - V exc) + G inh (t) x (V m (t) - V Inh.) </li></ol> Leitwert (G in nS) konnte sy seinnaptic oder künstlich. Erregenden und hemmenden synaptischen Leitfähigkeit Wellenformen wurden aus früheren Experimenten durch Protti, Di Marco, Huang, Vonhoff, Nguyen und Solomon (unveröffentlichte Ergebnisse) in Reaktion auf unterschiedliche visuelle Reize in Kontrollbedingungen und in Gegenwart von Tetrodotoxin durchgeführt gesammelt (TTX, 1 uM) . Künstliche Leitwert Wellenformen modelliert wurden unter Verwendung eines alpha-Funktion. V m (in mV) ist die aufgezeichnete Membranpotential. G und G ohne inh repräsentieren erregenden und hemmenden Leitwerte bzw. während V und ohne V Inh. stellen die Umkehrung Potenziale von erregenden und hemmenden bzw. Leitwerte. Time is t in ms. Abtastrate ist 40 kHz. I s = I 0 (t / α) e-&amp;agr; t Die obige Gleichung ist ein Alpha-Funktion (I 0 = maximale Strom, 1 / α = Zeit bis zur maximalen (s -1) des Stroms). Die Anstiegs-und Abklingzeit der synaptischenStrom wird durch α 4 diktiert. Die exzitatorische Leitfähigkeit war unverändert, während die Latenzzeit der inhibitorischen Leitfähigkeit geändert wurde, wodurch die Verzögerung relativ zu dem Beginn der Anregung (Fig. 2D). <ol start="4"><li> Nach der Aufnahme sorgfältig einfahren Pipette so die Zelle Körper bleibt intakt. Sofort den Gewebe in 4% Paraformaldehyd für 30 min, gefolgt von drei Waschungen 10 min mit 0,1 M Phosphat-Puffer. Kühlen und führen Antikörper-Färbung am folgenden Tag oder innerhalb einer Woche. </li></ol> 4. Antikörper-Färbung gegen Lucifer Yellow Gefüllt retinalen Ganglienzellen <ol><li> Antikörper-Färbung gegen Lucifer Yellow gefüllt Ganglienzellen bei Raumtemperatur (primäre Anti-Kaninchen-IgG Lucifer Yellow (= Verdünnung 1:10.000) für fünf Tage; am sechsten Tag, Übernachtung Färbung mit sekundären Ziege-Anti-Kaninchen-IgG (Verdünnung 1:500 = )). Nasspräparat die Netzhaut in Fluorescent Erhaltung Medien. Deckplättchenträger und mit Nagel p versiegelnolish. </li><li> Nehmen konfokale Bilder der Zellmorphologie mit einem Leica-Spec II konfokalen Mikroskop (Abbildung 1B). Die Anwesenheit eines Axons ermöglicht die Bestätigung der Ganglienzellen. </li></ol>

<ol>
	<li>Robinson, H. P. C., Kawai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+digitally+synthesized+synaptic+conductance+transients+to+measure+the+integrative+properties+of+neurons.">Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 49, 157-165 (1993).</li><li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+clamp:+artificial+conductances+in+biological+neurons.">The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons.</a> Trends in Neuroscience. 16, 389-394 (1993).</li><li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+clamp:+computer-generated+conductances+in+real+neurons.">Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).</li><li>Johnson, D., Wu, S. M. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Foundations of cellular neurophysiology. , (1995).</li><li>Taylor, W. R., Vaney, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+synaptic+mechanisms+generate+direction+selectivity+in+the+rabbit+retina.">Diverse synaptic mechanisms generate direction selectivity in the rabbit retina.</a> Journal of Neuroscience. 22 (17), 7712-7720 (2002).</li><li>Jurkat-Rott, K., Lehmann-Horn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+patch+clamp+technique+in+ion+channel+research.">The patch clamp technique in ion channel research.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 4, 221-238 (2003).</li><li>Prinz, A. A., Abbott, L. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-attached+voltage-clamp+and+current-clamp+recording+and+stimulation+techniques+in+brain+slices.">Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices.</a> Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).</li><li>Feng, S. S., Jaeger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+SK+calcium-dependent+potassium+currents+in+regulating+the+activity+of+deep+cerebellar+nucleus+neurons:+a+dynamic+clamp+study.">The role of SK calcium-dependent potassium currents in regulating the activity of deep cerebellar nucleus neurons: a dynamic clamp study.</a> Cerebellum. 7 (4), 542-546 (2008).</li><li>Butera, R., Lin, R., Destexhe, A., Bal, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+factors+for+improving+dynamic+clamp+performance.+In:+Dynamic-Clamp+From+Principles+to+Applications+Series.">Key factors for improving dynamic clamp performance. In: Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series.</a> Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series: Springer Series in Computational Neuroscience. 1, (2009).</li><li>Marco, S. D. i., Nguyen, V. A., Bisti, S., Protti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permanent+functional+reorganization+of+retinal+circuits+induced+by+early+long-term+visual+deprivation.">Permanent functional reorganization of retinal circuits induced by early long-term visual deprivation.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (43), 13691-13701 (2009).</li><li>Zhao, Y., Inayat, S., Dikin, D. A., Singer, J. H., Ruoff, R. S., Troy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+technique:+review+of+the+current+state+of+the+art+and+potential+contributions+from+nanoengineering.">Patch clamp technique: review of the current state of the art and potential contributions from nanoengineering.</a> Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part N: Journal of Nanoengineering and Nanosystems. 222 (1), 1-11 (2009).</li><li>Lobb, C. J., Paladini, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+NMDA+receptor+conductance+in+rat+midbrain+dopaminergic+neurons+using+the+dynamic+clamp+technique.">Application of a NMDA receptor conductance in rat midbrain dopaminergic neurons using the dynamic clamp technique.</a> J. Vis. Exp. (46), e2275 (2010).</li><li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina.">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).</li><li>Middleton, T. P., Protti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+modulate+spontaneous+synaptic+activity+in+retinal+ganglion+cells.">Cannabinoids modulate spontaneous synaptic activity in retinal ganglion cells.</a> Visual Neuroscience. 28 (5), 393-402 (2011).</li><li>Pottek, M., Knop, G. C., Weiler, R., Dedek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+GFP-expressing+cell+populations+in+the+intact+retina.">Electrophysiological characterization of GFP-expressing cell populations in the intact retina.</a> J. Vis. Exp. (57), e3457 (2011).</li></ol>

Alle Verfahren wurden zunächst von der Animal Care Ethikkommission der Universität von Sydney genehmigt, und dann in Übereinstimmung mit den Richtlinien des australischen Code of Practice für die Pflege und Verwendung von Tieren zu wissenschaftlichen Zwecken (National Health and Medical Research Council of Australia durchgeführt ).

Hier zeigen wir die Verwendung von dynamischen Haken, um den Einfluß des Verhältnisses und Timing der Erregung und Hemmung von retinalen Ganglienzellen Ausgang bewerten. Dynamische Klammer nutzt Computersimulationen physiologisch aufgezeichneten oder künstliche synaptischen Leitwerte in lebende Neuronen einzuführen. Diese Methode bietet ein interaktives Werkzeug, mit dem Leitwerte können modifiziert werden und injiziert in Neuronen zur Berechnung ihres Einflusses auf neuronalen Antworten. Leitwert Wellenformen von ...

Die Netzhaut ist eine nahezu transparente neuronalen Gewebe an der Rückseite des Auges. Viele Studien verwenden die Netzhaut als Modell, um die ersten Schritte in der visuellen Verarbeitung und Mechanismen der synaptischen Signalisierung zu untersuchen. Da die Netzhaut Netzwerk in der whole-mount Vorbereitung bleibt nach Dissektion, stellt es ein ideales System, um synaptische Interaktionen zu untersuchen, wie ihre physiologischen Reaktionen sehr ähnlich zu der in vivo-Bedingungen sind. Somit ist die Verwendung eines isolierten Netzhaut die Eigenschaften der Neuronen untersucht mittels Patch-Clamp-Verfahren (für Bewertungen auf der Technik, siehe 6,9,13) werden kann. Ermittlung des genauen Beitrag der spezifischen Schaltungen und Neurotransmitter Ganglienzellen Reaktion wird jedoch üblicherweise behindert als pharmakologische Wirkstoffe an unterschiedlichen Standorten handeln. Physiologische Reaktionen von retinalen Neuronen mit Licht, die natürliche Reiz, kann mit Glas-Pipetten mit intrazellulären Flüssigkeit gefüllt aufgezeichnet werden. Mit Patch clamp Techniken, neuronale Reaktionen auf Licht Stimulation kann als Membranpotential Schwankungen (Stromzange) oder als Ströme (Voltage-Clamp) aufgezeichnet werden. Durch Halten des Membranpotentials mit unterschiedlichen Spannungen und Umsetzung einer posteriori Leitfähigkeit Analyse ist es möglich, zu isolieren und hemmende erregenden synaptischen Eingänge 5,12. Diese Art der Experimente sind in normalen Badmedium und in Gegenwart von verschiedenen pharmakologischen Mitteln, um den Beitrag von verschiedenen Neurotransmittern und Rezeptoren auf neuronale Reaktionen isolieren durchgeführt werden. Eine Fülle von Studien aus vielen Laboratorien dadurch die Abhängigkeit der Spick-Ausgang und erregenden und hemmenden Eingänge Reiz Eigenschaften wie Größe, Kontrast, räumlichen und zeitlichen Frequenzen, Richtung, Orientierung und anderen Stimulus Variablen. Obwohl diese experimentelle Ansätze liefern Informationen über die Beziehung zwischen Spike Ausgang und synaptische Eingänge in Abhängigkeit von Stimulus-Eigenschaften,Interpretation des Beitrags spezifische Zelltypen und deren synaptische Eingänge Zellerregbarkeit ist nicht einfach. Dies ist aufgrund der Tatsache, dass in der Regel sowohl erregenden und hemmenden Eingänge mit Stimulus Eigenschaften variieren und somit ist es nicht möglich, die genaue Wirkung, dass Änderungen in diesen beiden Eingängen auf neuronale Spiking bewerten. Ein alternativer Ansatz, diese Einschränkungen zu umgehen, ist die Durchführung von dynamischen Clamp Messungen, die eine kritische Bewertung des Beitrags der einzelnen synaptischen Eingänge Spick Ausgang zu ermöglichen. Die dynamische Clamp-Technik erlaubt die direkte Injektion von Strom in die Zelle und die Menge der injizierten Strom zu einem bestimmten Zeitpunkt hängt von der aufgezeichneten Membranpotential damals 1,2,3 (für eine Übersicht siehe 7,14). Es ist eine modifizierte Stromzange Set-up, wo ein Echtzeit-, schnelles Feedback Interaktion zwischen der Zelle unter Aufnahme und der Ausrüstung, die spezielle Hardware, Softwareund einen Computer erzielt wird. Die Strommenge, die in die Zelle injiziert wird entsprechend berechnet. Daher ist der Vorteil dieses Verfahrens, dass die Zelle mit verschiedenen Kombinationen von Leitfähigkeit Wellenformen stimuliert werden kann, und die Antwort wird die Aktivierung von Rezeptoren, die synaptischen Eingänge vermitteln imitieren. Zum Beispiel der Vergleich der Reaktion auf Injektion von erregenden und hemmenden Leitwerte für einen kleinen Ort mit der Antwort auf Injektion von erregenden Leitwert für einen kleinen Ort nur Informationen über die Auswirkungen der Hemmung auf Zell-Antwort. Ebenso können andere Kombinationen von physiologisch aufgezeichnet Leitwerte co-injiziert werden zu zeigen, wie Stimulus-abhängigen Veränderungen in erregenden und / oder hemmenden Leitfähigkeiten beeinflussen Spike Ausgang. In unserer Studie wird die dynamische Clamp-Technik verwendet, um die Auswirkung der relativen Amplitude und Zeitpunkt der synaptischen Eingänge der Brenneigenschaften von retinalen Ganglienzellen demonstrieren. Verschiedene Leitwerteerhalten von physiologischen Experimente in Steuerbedingungen oder in Gegenwart von pharmakologischen Mitteln wurden als Eingänge verwendet. Darüber hinaus wurden künstliche Leitwerte auf alpha-Funktionen basierend auch verwendet werden, um zu untersuchen, wie synaptische Eingänge von den Neuronen integriert sind. Somit ist eine vielseitige Technik, die verschiedene Typen von Leitfähigkeit erzeugt entweder physiologisch oder pharmakologisch rechnerisch in die gleiche Ganglienzellen injiziert werden, so Vergleich der Antworten auf diese Eingaben vorgenommen werden können.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Inhalation Anaesthetic</td>
			<td>Pharmachem</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ames Medium with L-Glutamate (Powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Gluconate, Anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution (4.9 mol/l)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Powder, 95%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Preserving Media</td>
			<td>BioFX Laboratories Inc.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0794</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Stage Glass Microelectrode Puller</td>
			<td>Narishinge Japan</td>
			<td>Model PP-830</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minipuls 2</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GV 0.22 &mu;m Filter Unit</td>
			<td>Millipore Corporation</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G</td>
			<td>Smith &amp; Nephew (Australia)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Inline Solution Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>Model SH-27B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Automatic Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-344B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Stereomicroscope SZ61</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0-30 V 2.5 A DC Power Supply</td>
			<td>Dick Smith Electronics</td>
			<td>Q1770</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Microscopic Camera ProgResMF cool</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator MP-225</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch Clamp Amplifier EPC 8</td>
			<td>HEKA Elektronik</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System</td>
			<td>HEKA Elektronik</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
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			<td>Computer: DELL</td>
			<td>Dell Corporation</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
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implementing dynamic clamp with synaptic and artificial conductances in mouse retinal ganglion cells

Ganglienzellen sind die Ausgangs-Neuronen der Netzhaut und ihre Tätigkeit spiegelt die Integration von mehreren synaptischen Eingänge auf Grund von spezifischen neuronalen Schaltkreisen. Patch-Clamp-Technik, in Voltage-Clamp und Stromzange Konfigurationen, werden häufig verwendet, um die physiologischen Eigenschaften von Neuronen zu untersuchen und ihre synaptischen Eingänge zu charakterisieren. Obwohl die Anwendung dieser Techniken ist sehr informativ, stellen sie verschiedene Einschränkungen. Zum Beispiel ist es schwierig zu quantifizieren, wie die genauen Wechselwirkungen der erregenden und hemmenden Eingänge Antwortausgabe bestimmen. Um dieses Problem anzugehen, verwendeten wir eine modifizierte Strom-Clamp-Technik, dynamische Klemme, die auch als Leitwert Klemme 1, 2, 3 und untersuchte den Einfluss von erregenden und hemmenden synaptischen Eingänge auf die neuronale Erregbarkeit. Diese Technik erfordert die Injektion von Strom in die Zelle und ist abhängig von der Echtzeit-Feedback der Membranpotential zu dieser Zeit. Die INJECTEd Strom von vorgegebenen erregende und hemmende synaptische Leitwerte, ihre Potenziale und Umkehrung der Zelle momentanen Membranpotential berechnet. Details zu den experimentellen Verfahren werden Patch-Clamp-Zellen, um eine Whole-Cell-Konfiguration und Einsatz der dynamischen Clamp-Technik erreichen in diesem Video-Artikel dargestellt. Hier zeigen wir die Antworten der Maus retinalen Ganglienzellen auf verschiedene Wellenformen Leitwert von physiologischen Experimenten unter Kontrolle Bedingungen oder in Gegenwart von Medikamenten erhalten. Darüber hinaus zeigen wir die Verwendung von künstlichen erregenden und hemmenden Leitwerte generiert unter Verwendung von Alpha-Funktionen, um die Reaktionen der Zellen zu untersuchen.

Der Beitrag der verschiedenen Quellen von hemmenden Eingänge Ganglienzellen Antworten wird durch die Anwendung verschiedener Leitfähigkeit Wellenformen gezeigt. Diese Wellenformen wurden mit Stimuli unterschiedlicher Leuchtdichte unter normalen Bedingungen und in Gegenwart von TTX einen spannungsgesteuerten Na +-Kanal-Blocker, der die Wirkung Potentialerzeugungsschaltung nur bei einem Teil der Retina hemmende interneurons. 2A eine repräsentative Antwort auf Injektion zeigt erhaltene errege...

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Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Dieses Video zeigt die Artikel-Set-up, die Verfahren zum Zellkörper patchen und wie man dynamische Clamp Messungen von Ganglienzellen in whole-mount Maus retinae umzusetzen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung der genauen Anteil von erregenden und hemmenden synaptischen Eingänge und ihre relative Größe und den Zeitpunkt zu neuronalen Spiking.

Implementieren Dynamische Clamp mit Synaptic und künstliche Leitfähigkeiten in Maus retinalen Ganglienzellen

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.2K Aufrufe.  University of Sydney. Dieses Video zeigt die Artikel-Set-up, die Verfahren zum Zellkörper patchen und wie man dynamische Clamp Messungen von Ganglienzellen in whole-mount Maus retinae umzusetzen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung der genauen Anteil von erregenden und hemmenden synaptischen Eingänge und ihre relative Größe und den Zeitpunkt zu neuronalen Spiking.

Serie: Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Patch Clamp Messungen von Mouse Netzhautneuronen in einem Dark-Scheiben angepasst Vorbereitung

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Forschung

Neurowissenschaften

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1. This information is then segregated into what are known as the ON and OFF pathways. The photoreceptors signal light information to the bipolar cells (BCs), which depolarize in response to increases (On BCs) or decreases (Off BCs) in light intensity. This segregation of light information is maintained at the level of the retinal ganglion cells (RGCs), which have dendrites stratifying in either the Off sublamina of the inner plexiform layer (IPL), where they receive direct excitatory input from Off BCs, or stratifying in the On sublamina of the IPL, where they receive direct excitatory input from On BCs. This segregation of information regarding increases or decreases in illumination (the On and Off pathways) is conserved and signaled to the brain in parallel.
The RGCs are the output cells of the retina, and are thus an important cell to study in order to understand how light information is signaled to visual nuclei in the brain. Advances in mouse genetics over recent decades have resulted in a variety of fluorescent reporter mouse lines where specific RGC populations are labeled with a fluorescent protein to allow for identification of RGC subtypes 2 3 4 and specific targeting for electrophysiological recording. Here, we present a method for recording light responses from fluorescently labeled ganglion cells in an intact, isolated retinal preparation. This isolated retinal preparation allows for recordings from RGCs where the dendritic arbor is intact and the inputs across the entire RGC dendritic arbor are preserved. This method is applicable across a variety of ganglion cell subtypes and is amenable to a wide variety of single-cell physiological techniques.

This article provides a description of how to dissect and record from the isolated retinal preparation in mouse. In particular, we describe how to record light responses from a fluorescently labeled ganglion cell population and subsequently identify and analyze its morphology.

Eine isolierte Retinal Vorbereitung auf leichte Ansprache aus genetisch markierten retinalen Ganglienzellen Rekord

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Retrograde Markierung von retinalen Ganglienzellen im erwachsenen Zebrafisch mit Fluoreszenzfarbstoffen

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Recording Licht-evozierte Postsynaptische Antworten in Neuronen im Dunkel-adaptierten, Maus retinalen Scheibe Vorbereitungen Verwendung Patch-Clamp-Techniken

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for the improved understanding of neuronal diversity, it is important to identify genes whose expression defines various subpopulations of cells. The retina serves as an excellent model for the study of central nervous system diversity, as it is composed of multiple major cell types. The study of each major class of cells has yielded genetic markers that facilitate the identification of these populations. However, multiple subtypes of cells exist within each of these major retinal cell classes, and few of these subtypes have known genetic markers, although many have been characterized by morphology or function. A knowledge of genetic markers for individual retinal subtypes would allow for the study and mapping of brain targets related to specific visual functions and may also lend insight into the gene networks that maintain cellular diversity. Current avenues used to identify the genetic markers of subtypes possess drawbacks, such as the classification of cell types following sequencing. This presents a challenge for data analysis and requires rigorous validation methods to ensure that clusters contain cells of the same function. We propose a technique for identifying the morphology and functionality of a cell prior to isolation and sequencing, which will allow for the easier identification of subtype-specific markers. This technique may be extended to non-neuronal cell types, as well as to rare populations of cells with minor variations. This protocol yields excellent-quality data, as many of the libraries have provided read depths greater than 20 million reads for single cells. This methodology overcomes many of the hurdles presented by Single-cell RNA-Seq and may be suitable for researchers aiming to profile cell types in a straightforward and highly efficient manner.

Here, we present a combinatorial approach for classifying neuronal cell types prior to isolation and for the subsequent characterization of single-cell transcriptomes. This protocol optimizes the preparation of samples for successful RNA Sequencing (RNA-Seq) and describes a methodology designed specifically for the enhanced understanding of cellular diversity.

Einzelzell-RNA-Seq von definierten Subsets von Retinal-Ganglion-Zellen

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Optische Kohärenztomographie: Maus retinalen Ganglienzellen Zellen In Vivo Imaging

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Kombination von Optogenetik mit künstlichen Mikro-RNAs, die Effekte gen Knockdown präsynaptischen Funktion innerhalb intakte neuronale Schaltkreise zu charakterisieren

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic multiplicity). Synaptic multiplicity is plastic and changes throughout development and in different physiological conditions, being an important determinant for the efficacy of synaptic transmission. Here, we outline experiments for estimating the degree of multiplicity of synapses terminating onto a given postsynaptic neuron using whole-cell patch clamp electrophysiology in acute brain slices. Specifically, voltage-clamp recording is used to compare the difference between the amplitude of spontaneous excitatory postsynaptic currents (sEPSCs) and miniature excitatory postsynaptic currents (mEPSCs). The theory behind this method is that afferent inputs that exhibit multiplicity will show large, action potential-dependent sEPSCs due to the synchronous release that occurs at each synaptic contact. In contrast, action potential-independent release (which is asynchronous) will generate smaller amplitude mEPSCs. This article outlines a set of experiments and analyses to characterize the existence of synaptic multiplicity and discusses the requirements and limitations of the technique. This technique can be applied to investigate how different behavioral, pharmacological or environmental interventions in vivo affect the organization of synaptic contacts in different brain areas.

Here, we present a protocol for evaluating the functional synaptic multiplicity using whole-cell patch clamp electrophysiology in acute brain slices.

Bewertung der synaptischen Multiplizität mit Whole-Cell Patch-Clamp-Elektrophysiologie

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

Isolierung der Netzhaut von Mäusen und Methanolbehandlung zur Untersuchung von retinalen Ganglienzellen

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in RGCs have a close relationship with numerous retinal degenerative diseases. Whole-mount retinal immunostaining is frequently used in experimental studies on RGCs to evaluate the developmental and pathological conditions of the retina. Under some circumstances, some valuable retina samples, such as those from transgenic mice, may need to be retained for a long period without affecting the morphology or number of RGCs. For credible and reproducible experimental results, using an effective preserving medium is essential. Here, we describe the effect of methanol as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage. In brief, during the isolation process, cold methanol (&#8722;20 &#176;C) is pipetted onto the surface of the retina to help fix the tissues and facilitate their permeability, and then the retinas can be stored in cold methanol (&#8722;20 &#176;C) before being immunostained. This protocol describes the retina isolation workflow and tissue sample storage protocol, which is useful and practical for the investigation of RGCs.

Autor im Rampenlicht: Methanol-basiertes Whole-Mount-Präparat für die Untersuchung von retinalen Ganglienzellen  

Methanol can be used as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage, which is useful for the investigation of retinal ganglion cells.

Methanol-basiertes Whole-Mount-Präparat zur Untersuchung retinaler Ganglienzellen

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...