Die Arbeit ist unser Labor durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health unterstützt.

Vorbereitung <ul><li> Deckgläser sollten autoklaviert werden. </li><li> Sterile Zugabe von destilliertem Wasser sollte verwendet werden, um Lösungen vorzubereiten und für das Waschen Deckgläser werden. </li><li> AC (40% w / v) und Bis-AC (1% w / v)-Lösungen werden von 0,2 mu m sterilfiltriert. Bereiten Sie 10% Ammoniumpersulfat (APS; 100μg/ml Wasser) kurz vor dem Gebrauch und Sterilfilter. Ersetzen Sie die APS-Lösung monatlich. </li><li> Chemische Reagenzien wie 3-APTMS, Chloroform, glutaradehyde, NHS und SurfaSil, die nicht zu autoklaviert werden in einem zugewiesenen Flasche ausschließlich für die Herstellung von Hydrogelen verwendet gehalten. </li><li> Für beste Ergebnisse sollte Hydrogele innerhalb von ein paar Tage nach der Inkubation über Nacht mit den entsprechenden ECM-Protein eingesetzt werden. </li><li> Bereiten Sie eine 10% SurfaSil Lösung in Chloroform (10 ml ist in der Regel ausreichend für 20 Top-Deckgläser) in einer 50 ml-Polypropylen-Falcon-Röhrchen vor der Hydrogel Gießen. (Unser Labor in der Regel siliconizes oben Deckgläser während der 0,5% Glutaraldehyd Inkubationsschritt). Fügen Sie die Deckgläser auf die Falcon-Röhrchen und Rock für mindestens 10 min. Dekantieren SurfaSil Lösung und an der Luft trocknen die Deckgläser auf Kimwipes in der biologischen Sicherheitswerkbank, wo die Hydrogele werden. </li><li> Bereiten Sie die hitzeinaktiviertem BSA-Lösung wie folgt: 20 mg / ml Lösung von Fettsäuren frei BSA in PBS in einem 68 ° C Wasserbad für 30 min inkubiert. Die Lösung wird dann sterilfiltriert und bei 4 ° C gelagert </li></ul> Verfahren <ol><li> Eine Schicht Parafilm auf der unteren Hälfte eines 150-mm-Petrischale. </li><li> Legen Sie bis zu 9 25-mm-Deckgläschen auf dem Parafilm und decken Sie sie mit 1 ml 0,1 M NaOH. Inkubieren für 3 min und dann absaugen mit einem Vakuum-Leitung. </li><li> Die Arbeit in einem chemischen Kapuze, statt 0,5 ml 3-APTMS auf jedem Deckglas. Inkubieren für 3 min und dann absaugen APTMS. Wenn Sie zu lange warten, wird ein Schaum zu bilden. </li><li> Spülen Sie die Deckgläschen einmal mit 20 ml deionisiertem Wasser in einer Schüssel. Entfernen Sie die Deckgläser aus der Schüssel mit einer gebogenen Pinzette und übertragen Sie sie mit ihrem behandelnden-Seite nach oben, um eine neue 150-mm-Schale. Waschen Sie die Deckgläser mit entionisiertem Wasser dreimal auf die Wippe, für jeweils 10 Minuten abwaschen. Wenn Sie alle APTMS entfernen scheitern, wird es mit dem Glutaraldehyd in den nächsten Schritt zu reagieren und hinterlassen einen weißen Regen Niederschlag (Abb. 1). </li><li> Auftauen Glutaraldehyd (~ 10 min vor Gebrauch). </li><li> Mit einer gebogenen Pinzette, übertragen Sie die Deckgläser zu einer sauberen Schüssel mit Parafilm geschichtet und saugen alle verbleibenden Flüssigkeit. Verwenden Sie eine Saugleitung oder Kimwipe um das restliche Wasser-Blot, wie gebraucht. </li><li> Cover jede Deckglas komplett mit 0,5 ml 0,5% Glutaraldehyd in sterilem, deionisiertem Wasser und Inkubation für 30 min in einem chemischen Kapuze. Saugen Sie das Glutaraldehyd. Spülen und waschen Sie die Deckgläschen wie in Schritt 4. Trocknen Sie die Deckgläser komplett. [Sie können hier aufhören und lassen Sie die Deckgläser für mehrere Wochen in einem trockenen Raum]. </li><li> Wenn Sie bereit sind, die Hydrogele herzustellen sind, verwenden einer gebogenen Pinzette auf die Deckgläser, reaktive Seite nach oben auf ein Blatt Parafilm, die auf der Oberfläche des biologischen Sicherheitswerkbank wurde mit Klebeband zu übertragen. Stellen Sie sicher, dass die Deckgläser flach auf den Parafilm Oberfläche. </li><li> Bereiten Sie eine gesättigte NHS-Lösung in Toluol. (Man löst eine kleine Menge von NHS in ausreichend Toluol für die jeweilige Experiment. Halten Sie das Hinzufügen NHS Stück für Stück, bis der NHS nicht mehr auflöst. Die gesättigte Lösung ist in der Regel trübe und pink.) </li><li> Als nächstes bereiten die Acrylamid, Bisacrylamid-, Wasser-und APS auf die gewünschte Acrylamid Prozentsatz zu erreichen. Fügen Sie die Reagenzien in Mikrozentrifugenröhrchen wie unten auf ein Gesamtvolumen von 0,8 ml skizziert. </li><li> Dann, eines aliquoten zu einer Zeit, fügen Sie den NHS und TEMED auf die 0,8 ml AC-Lösung, kurz vortexen und SOFORT pour 3-5 Gele mit 140 ul pro Deckglas in die biologische Sicherheit Kapuze. Wann immer möglich, sollten alle Schritte von diesem Punkt in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden. [Anmerkung: unterschiedliche Größe Deckgläser kann basierend auf Bedarf genutzt werden. Wenn 18-mm Deckgläser verwendet werden, verwenden ~ 33 ul AC-Lösung pro Deckglas und ein 18-mm top silikonisierten Deckglas.] <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"><div align="center"> Bis-AC (%) </div></td></tr><tr><td></td><td> 0,3 (steif) </td><td> 0,15 </td><td> 0,06 </td><td> 0,03 (weich) </td></tr><tr><td></td><td> ul </td><td> ul </td><td> ul </td><td> ul </td></tr><tr><td> Wasser </td><td> 402 </td><td> 522 </td><td> 594 </td><td> 618 </td></tr><tr><td> AC </td><td> 150 </td><td> 150 </td><td> 150 </td><td> 150 </td></tr><tr><td> Bis-AC </td><td> 240 </td><td> 120 </td><td> 48 </td><td> 24 </td></tr><tr><td> APS</td><td> 8 </td><td> 8 </td><td> 8 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> NHS </td><td> 228 </td><td> 228 </td><td> 228 </td><td> 228 </td></tr></tbody></table></li><li> Schnell Ort der silikonisierten 25-mm Deckglas auf der jeweils gel, bevor es zu polymerisieren beginnt. Neben der Top Deckglas sollte es dem AC vollständig zu bedecken den Boden Deckglas. Inkubieren dieses &quot;Sandwich&quot; bei Raumtemperatur, bis die AC polymerisiert. (Überprüfen Sie die verbleibende AC-Lösung im Reaktionsgefäß zu bestimmen, wann Polymerisation stattgefunden hat. In der Regel ein paar Minuten für steife Gele und ein wenig mehr für weiche genügt.). </li><li> Sorgfältig nehmen die Sandwich (sterile Handschuhe!) Und schieben Sie die obere Deckglas, bis es Überhänge der polymerisierten Gel. Sie können dann hebeln ihn aus dem Gel. Wenn Sie zu lange vor dem Entfernen der oberen Deckglas warten, wird das Gel rip als Deckglas wird entfernt. </li><li> Entsorgen Sie die Top-Deckglas. Setzen Sie die untere Gel-Deckgläser (im Folgenden als das Hydrogel) in 6-well-Platten mit 2 ml PBS / well. PBS kann vor oder nach der Gel-Deckglas in jedes Well gegeben werden. Waschen Sie die Hydrogele mit PBS dreimal, auf einer Wippe, 5 min pro Waschgang. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 11-14, bis die erforderliche Anzahl von Hydrogelen hergestellt worden sind. </li><li> Cover jede Hydrogel mit 2 ml einer Fibronektin-Lösung (3 g / ml in PBS) oder andere ECM-Protein (siehe Klein et al. 13 für Details.). Die ECM-Protein kovalent an das Hydrogel bei Inkubation über Nacht gebunden bei 4 ° C </li><li> Saugen Sie die ECM-Lösung und Block nicht umgesetzte NHS mit 1mg/ml hitzeinaktiviertem Fettsäuren frei BSA in serum-freien Medien für mindestens 30 min bei 37 ° C in einem Zellkulturbrutschrank. Spülen Sie die Hydrogele einmal mit sterilem PBS oder Zellkulturmedium. </li><li> Platte Zellen in dem entsprechenden Kulturmedium mit FBS. Die Anzahl der Zellen auf das Hydrogel ausgesät sollten vom Anwender auf den Grad der Zelle ausbreitet und Konfluenz benötigt für Experimente bestimmt werden. Etwa 10 5 Zellen ist in der Regel ausreichend für Western-Blot-und qPCR-Analyse. </li><li> Nach der Inkubationszeit kann Zelle Protein oder mRNA extrahiert werden. Die Deckgläser werden sorgfältig aus den Vertiefungen mit einer gebogenen Pinzette entfernt und (Zell-Seite nach unten) auf der Oberseite von 100 ul Tröpfchen Lysepuffer waren und nun nicht (2-3cm) an einem Blatt Parafilm auf dem Labortisch angeordnet. (Wir verwenden Standard-SDS-Probenpuffer und TRIzol jeweils um Proben für die Western-Blot vorzubereiten und RNA für die qPCR zu isolieren.) Inkubieren Sie die Zellen mit dem Lysepuffer für genau eine Minute. Deckgläser abnehmen und übertragen Sie die Lysepuffer zu einem Reaktionsgefäß. Alternativ zur RNA-Extraktion nur, kann der Benutzer jedes Hydrogel, um eine neue 6-Well-Platte übertragen und 1ml von TRIzol / well. Inkubieren für 3 Minuten und entfernen TRIzol Lösung für die Lagerung in einem Reaktionsgefäß. </li></ol> Zusätzliche Informationen über Verfahren wie Immunfluoreszenz, wird BrdU-Färbung, Transfektion, etc. für die Zellen auf Hydrogele gesät in Klein et al. 2007 13. Repräsentative Ergebnisse Gründliches Waschen der Deckgläschen nach der Zugabe von APTMS ist ein wichtiger Schritt in der Herstellung von &quot;reaktiven&quot; Deckgläser. Wenn man die APTMS vollständig zu entfernen scheitert, wird es mit dem Glutaraldehyd in den folgenden Schritt reagieren und eine weiße trübe Niederschlag wie in Abbildung 1A zu sehen. Abbildung 1B zeigt eine richtig gewaschen und getrocknet Deckglas. Wenn der Niederschlag entsteht, muss die ganze Prozedur von vorne begonnen werden, da das Deckglas ist nicht mehr nutzbar. Nach Hydrogelbildung und Beschichtung mit ECM-Proteine ​​über Nacht, können die Zellen ausgesät den folgenden Tag. Wie Abbildung 2 zeigt, gibt es einen deutlichen Unterschied zwischen Zellausbreitung auf steifen gegenüber weichen Hydrogele. Wie von Phalloidin-Färbung in embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) zu entnehmen ist, Zellen in einem größeren Ausmaß auf steifen verbreitet als zu weich Hydrogele verglichen. In der Tat werden die meisten Zellen eine Verbindung zu einem weichen Hydrogel bleiben kompakt und legen weniger effizient. Obwohl nur MEF Morphologie in Abbildung 2 dargestellt ist, ist der Unterschied in der Zelle sich über viele andere Zelllinien konsequent getestet 11-12,14. Secrets to Success <ol><li> Sobald die Prozedur gestartet wird, ist es sehr wichtig, die Deckgläser mit der &quot;reaktiven&quot; Seite halten und im Kopf behalten, welche Seite beschichtet wurde. </li><li> Handschuhe sollten zu jeder Zeit während des Verfahrens ein Arbeitsumfeld zu schaffen, dass möglichst steril bereitzustellen getragen werden. </li><li> Die meisten der ersten Schritte sind zwischen einem Laborabzug und dem Labortisch durchgeführt. Alle Schritte anschließendenzum Entfernen von überschüssigem Glutaraldehyd aus dem Deckgläschen sollte unter einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden. </li><li> Aufgrund von Unterschieden in der Zelle ausbreitet (Abbildung 2), empfehlen wir Säen die doppelte Anzahl von Zellen auf weichen Hydrogele als zu steif Hydrogele verglichen. </li><li> Die AC-Polymerisationsverfahren ist extrem schnell. Bei erstmaliger Benutzung, kann man verringern die Menge von APS oder TEMED in die Lösung der Polymerisation zu verlängern. Versuchen Sie nicht, mehr als ein paar Deckgläser auf einmal vorbereiten. </li><li> In Zellzyklus Studien, in denen die Synchronisation in G0 erforderlich ist, wir in der Regel Serum-verhungern Zellen in Kunststoff-Petrischalen, trypsinize die Zellen und reseed sie auf Hydrogele unterschiedlicher Nachgiebigkeit in Gegenwart von Mitogene (FBS und / oder Wachstumsfaktoren). Dieses Verfahren stellt sicher, dass der Ausgangspunkt Bevölkerung von G0-synchronisierten Zellen identisch in allen Proben ist. Doch für viele Signaltransduktion Studien, können die erforderlichen Mitogenstimulation Zeit nicht lang genug sein, um für die Befestigung und Ausbreitung von Zellen zu ermöglichen. In diesem Fall haben wir Serum-verhungern die Zellen auf der Hydrogele und dann direkt zu stimulieren sie mit Mitogen. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig1a.jpg" alt="Abbildung 1a" /> Abbildung 1A. Falsch gewaschen Deckglas. Nach Zugabe von APTMS wurde Deckglas für 1-2 Minuten vor der Zugabe der Glutaraldehyd-Lösung gewaschen. Ein Niederschlag bildet sich auf dem Deckglas, die nicht nach den Schritten im Verfahren beschrieben wurde gewaschen. <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig1b.jpg" alt="Abbildung 1b" /> Abbildung 1B. Richtig gewaschen Deckglas. Nach Zugabe von APTMS wurde Deckglas für dreimal jeweils 10 Minuten vor der Zugabe der Glutaraldehyd-Lösung gewaschen. Entsteht kein Niederschlag auf dem Deckglas. <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Morphologie der Zellen auf Hydrogele unterschiedlicher Steifigkeit. Etablierte MEFs auf Fibronektin-beschichteten Hydrogele hohe oder niedrige Steifigkeit für 9 Stunden wurden ausgesät. Nach der Inkubationszeit wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und mit FITC-Phalloidin, die f-Aktin bindet. MEFs auf hohe Steifigkeit Gele zeigen Stress-Fasern und sind gut verteilt im Vergleich zu denen auf geringe Steifigkeit Hydrogele ausgesät. Balken = 50 um. <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Vertreter quantitative PCR Ergebnis der Maus Cyclin D1-mRNA-Spiegel. Serum verhungert embryonalen Maus-Fibroblasten wurden auf hoch (3% Acrylamid) oder niedrig (0,3% Acrylamid) Steifigkeit Hydrogele verzinkt und stimuliert mit 10% FBS für 9 Uhr. Nach RNA Extraktion wurde real-time quantitative PCR-Analyse für Cyclin D1-mRNA-Spiegel (normiert auf 18S RNA) durchgeführt. G0 stellt Cyclin D1 mRNA aus ruhenden Zellen. Cyclin D1-mRNA-Spiegel signifikant erhöhen auf steifen Hydrogele, aber nicht auf weichen Hydrogele. Daten sind Mittelwerte + / - SD von doppelten PCR-Reaktionen.

<ol>
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Ein entscheidendes Element des Hydrogels Polymerisation wird die Luft Blasenbildung, die es Zellen, die Deckglas, anstatt die ECM-beschichteten Hydrogel sich binden zu vermeiden. Dies kann durch vorsichtiges Pipettieren der Polymerisationslösung nach Vortexen und visuell darauf achten, dass keine Luftblasen eingeschlossen werden in das Gel verhindert werden. Wir empfehlen immer, bereitet zusätzliche &quot;reaktiven&quot; Deckgläser und Hydrogele, um sicherzustellen, dass genug für Experimente. <p class="jove_con...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Glutaraldehyde, 70%</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G7776</td>
<td>Store at -20&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>3-APTMS (3-Aminopropyltrimethosysilane 97%)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>281778</td>
<td>Store at room temperature</td>
</tr>
<tr>
<td>SurfaSil Siliconizing Fluid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>42800</td>
<td>Store at room temperature</td>
</tr>
<tr>
<td>NHS (N-hydroxysucinimide Ester)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A-8060</td>
<td>Store at 4&deg;C Replace monthly</td>
</tr>
<tr>
<td>Albumin, bovine serum, essentially fatty acid free</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A6003-100G</td>
<td>Store at 4&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Coverslips (25mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-545-86 25 Cir 1D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslips (18mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-545-84 18 Cir 1D</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels

Tissue Steifigkeit ist eine wichtige Determinante für zelluläre Funktion und Veränderungen im Gewebe Steifigkeit sind häufig mit Fibrose, Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankung 1-11 verbunden. Traditionelle zellbiologische Ansätze zum Studium zellulärer Funktionen werden Zellkulturen auf einem starren Substrat (Plastikschalen oder Deckgläschen), die nicht für die Wirkung eines elastischen ECM oder die Variationen in ECM Steifigkeit zwischen Geweben erklären kann. Zur Modellierung in vivo Tissue Compliance-Bedingungen in vitro, verwenden wir und andere ECM-beschichteten Hydrogele. In unserem Labor werden die Hydrogele auf Polyacrylamid, die den Bereich des Tissue Verstöße gesehen biologisch 12 nachahmen kann basieren. &quot;Reaktive&quot; Deckgläser werden durch Inkubation mit NaOH durch Zugabe von 3-APTMS gefolgt generiert. Glutaraldehyd wird verwendet, um Vernetzung der 3-APTMS und das Polyacrylamidgel. Eine Lösung von Acrylamid (AC), Bis-Acrylamid (Bis-AC) und Ammoniumpersulfat ist für die Polymerisation des Hydrogels verwendet. N-Hydroxysuccinimid (NHS) in den AC-Lösung zur Vernetzung von ECM-Protein auf das Hydrogel eingebaut. Nach der Polymerisation des Hydrogels wird das Gel Oberfläche mit einer ECM-Protein der Wahl, wie Fibronektin, Vitronektin, Kollagen, etc. beschichtet Die Steifigkeit eines Hydrogels kann durch Rheologie oder Rasterkraftmikroskopie (AFM) bestimmt und angepasst werden durch Variation der Anteil der AC-und / oder Bis-AC in der Lösung 12. Auf diese Weise können Substrat Steifigkeit, um die Steifigkeit von biologischen Geweben, die auch quantifiziert werden mit Hilfe der Rheologie oder AFM abgestimmt werden. Die Zellen können dann auf dieser Hydrogele und kultiviert auf die experimentellen Voraussetzungen basiert ausgesät werden. Imaging der Zellen und ihre Genesung für die molekulare Analyse ist einfach. Für diesen Artikel definieren wir weichen Substraten, wie solche mit Elastizitätsmoduln (E) &lt;3000 Pascal und steife Substrate / Gewebe wie die mit E&gt; 20.000 Pascal.

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Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

Die Wirkung von Substraten Steifigkeit auf die zelluläre Funktion modelliert werden kann<em&gt; In-vitro-</em&gt; Verwendung von Polyacrylamid-Hydrogele unterschiedlicher nachzubessern.

Untersuchung der Auswirkungen von Matrix Stiffness auf Cellular-Funktion mit Acrylamid-basierte Hydrogele

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and ...

studying-effects-matrix-stiffness-on-cellular-function-using

Research

JoVE Journal

Biology

21.9K Aufrufe.  University of Pennsylvania. Die Wirkung von Substraten Steifigkeit auf die zelluläre Funktion modelliert werden kann In-vitro- Verwendung von Polyacrylamid-Hydrogele unterschiedlicher nachzubessern.

Serie: Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development of constructs for tissue engineering. This environment better mimics what cells observe in vivo, compared to standard tissue culture, due to the tissue-like properties and 3D environment. Synthetic polymeric hydrogels are water-swollen networks that can be designed to be stable or to degrade through hydrolysis or proteolysis as new tissue is deposited by encapsulated cells. A wide variety of polymers have been explored for these applications, such as poly(ethylene glycol) and hyaluronic acid. Most commonly, the polymer is functionalized with reactive groups such as methacrylates or acrylates capable of undergoing crosslinking through various mechanisms. In the past decade, much progress has been made in engineering these microenvironments - e.g., via the physical or pendant covalent incorporation of biochemical cues - to improve viability and direct cellular phenotype, including the differentiation of encapsulated stem cells (Burdick et al.).
The following methods for the 3D encapsulation of cells have been optimized in our and other laboratories to maximize cytocompatibility and minimize the number of hydrogel processing steps. In the following protocols (see Figure 1 for an illustration of the procedure), it is assumed that functionalized polymers capable of undergoing crosslinking are already in hand; excellent reviews of polymer chemistry as applied to the field of tissue engineering may be found elsewhere (Burdick et al.) and these methods are compatible with a range of polymer types. Further, the Michael-type addition (see Lutolf et al.) and light-initiated free radical (see Elisseeff et al.) mechanisms focused on here constitute only a small portion of the reported crosslinking techniques. Mixed mode crosslinking, in which a portion of reactive groups is first consumed by addition crosslinking and followed by a radical mechanism, is another commonly used and powerful paradigm for directing the phenotype of encapsulated cells (Khetan et al., Salinas et al.).

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

We present protocols for the 3-dimensional (3D) encapsulation of cells within synthetic hydrogels. The encapsulation procedure is outlined for two commonly used methods of crosslinking (michael-type addition and light-initiated free radical mechanisms), as well as a number of techniques for assessing encapsulated cell behavior.

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogele für Tissue Engineering

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

Forschung

Biologie

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic three-dimensional spring made of light that is formed when a high-intensity laser beam is focused to a very small spot by a microscope's objective lens. To bend a cell, we first bind live bacteria to a chemically-treated coverslip. As these cells grow, the middle of the cells remains bound to the coverslip but the growing ends are free of this restraint. By inducing filamentous growth with the drug cephalexin, we are able to identify cells in which one end of the cell was stuck to the surface while the other end remained unattached and susceptible to bending forces. A bending force is then applied with an optical trap by binding a polylysine-coated bead to the tip of a growing cell. Both the force and the displacement of the bead are recorded and the bending stiffness of the cell is the slope of this relationship.

We present a protocol for bending filamentous bacterial cells attached to a cover-slip surface with an optical trap to measure the cellular bending stiffness.

Die Messung der Biegesteifigkeit von Bakterienzellen mit einer optischen Falle

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic ...

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the BRCA1 have been complicated by the lack of a robust assay for the full length BRCA1 protein and the difficulties inherent in working with cell lines that express hypomorphic BRCA1 protein1,2,3,4,5. We developed a system whereby the endogenous BRCA1 protein in a cell was acutely depleted by RNAi targeting the 3'-UTR of the BRCA1 mRNA and replaced by co-transfecting a plasmid expressing a BRCA1 variant. One advantage of this procedure is that the acute silencing of BRCA1 and simultaneous replacement allow the cells to grow without secondary mutations or adaptations that might arise over time to compensate for the loss of BRCA1 function. This depletion and add-back procedure was done in a HeLa-derived cell line that was readily assayed for homologous recombination activity. The homologous recombination assay is based on a previously published method whereby a recombination substrate is integrated into the genome (Figure 1)6,7,8,9. This recombination substrate has the rare-cutting I-SceI restriction enzyme site inside an inactive GFP allele, and downstream is a second inactive GFP allele. Transfection of the plasmid that expresses I-SceI results in a double-stranded break, which may be repaired by homologous recombination, and if homologous recombination does repair the break it creates an active GFP allele that is readily scored by flow cytometry for GFP protein expression. Depletion of endogenous BRCA1 resulted in an 8-10-fold reduction in homologous recombination activity, and add-back of wild-type plasmid fully restored homologous recombination function. When specific point mutants of full length BRCA1 were expressed from co-transfected plasmids, the effect of the specific missense mutant could be scored. As an example, the expression of the BRCA1(M18T) protein, a variant of unknown clinical significance10, was expressed in these cells, it failed to restore BRCA1-dependent homologous recombination. By contrast, expression of another variant, also of unknown significance, BRCA1(I21V) fully restored BRCA1-dependent homologous recombination function. This strategy of testing the function of BRCA1 missense mutations has been applied to another biological system assaying for centrosome function (Kais et al, unpublished observations). Overall, this approach is suitable for the analysis of missense mutants in any gene that must be analyzed recessively.

We provide a method for testing BRCA1 variants in a tissue culture based assay for homologous recombination repair of DNA damage by depleting endogenous BRCA1 protein from a cell using RNAi and replacing it with a BRCA1 point mutant that contains a coding change.

Ermittlung der Auswirkungen von BRCA1-Mutationen auf homologe Rekombination unter Verwendung von Zellen, die endogenes Wildtyp-BRCA1 Express

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces the 'free' surfaces and the basolateral membrane is in contact with the substrate and neighboring cells. Both membrane domains are separated by tight junctions, which form a diffusion barrier. Apical-basolateral polarization can be recapitulated successfully in culture when epithelial cells such as Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells are seeded at high density on polycarbonate filters and cultured for several days 1 2. Establishment and maintenance of cell polarity is regulated by an array of small GTPases of the Ras superfamily such as RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 and Rab13 3 4 5 6 7. Like all GTPases these proteins cycle between an inactive GDP-bound state and an active GTP-bound state. Specific mutations in the nucleotide binding regions interfere with this cycling 8. For example, Rab13T22N is permanently locked in the GDP-form and thus dubbed 'dominant negative', whereas Rab13Q67L can no longer hydrolyze GTP and is thus locked in a 'dominant active' state 7. To analyze their function in cells both dominant negative and dominant active alleles of GTPases are typically expressed at high levels to interfere with the function of the endogenous proteins 9. An elegant way to achieve high levels of overexpression in a short amount of time is to introduce the plasmids encoding the relevant proteins directly into the nuclei of polarized cells grown on filter supports using microinjection technique. This is often combined with the co-injection of reporter plasmids that encode plasma membrane receptors that are specifically sorted to the apical or basolateral domain. A cargo frequently used to analyze cargo sorting to the basolateral domain is a temperature sensitive allele of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVGts045) 10. This protein cannot fold properly at 39&deg;C and will thus be retained in the endoplasmic reticulum (ER) while the regulatory protein of interest is assembled in the cytosol. A shift to 31&deg;C will then allow VSVGts045 to fold properly, leave the ER and travel to the plasma membrane 11. This chase is typically performed in the presence of cycloheximide to prevent further protein synthesis leading to cleaner results. Here we describe in detail the procedure of microinjecting plasmids into polarized cells and subsequent incubations including temperature shifts that allow a comprehensive analysis of regulatory proteins involved in basolateral sorting.

This article details the procedures involved in overexpression and analysis of small GTPases in polarized epithelial cells using microinjection technique.

Die Analyse der Funktion von kleinen GTPasen durch Mikroinjektion von Plasmiden in polarisierten Epithelzellen

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of aging suggests a role for mtDNA mutations, which can alter bioenergetics homeostasis and cellular function, in the aging process 3. A wealth of evidence has been compiled in support of this theory 1,4, an example being the mtDNA mutator mouse 5; however, the precise role of mtDNA damage in aging is not entirely understood 6,7.
Observing the activity of respiratory enzymes is a straightforward approach for investigating mitochondrial dysfunction. Complex IV, or cytochrome c oxidase (COX), is essential for mitochondrial function. The catalytic subunits of COX are encoded by mtDNA and are essential for assembly of the complex (Figure 1). Thus, proper synthesis and function are largely based on mtDNA integrity 2. Although other respiratory complexes could be investigated, Complexes IV and II are the most amenable to histochemical examination 8,9. Complex II, or succinate dehydrogenase (SDH), is entirely encoded by nuclear DNA (Figure 1), and its activity is typically not affected by impaired mtDNA, although an increase might indicate mitochondrial biogenesis 10-12. The impaired mtDNA observed in mitochondrial diseases, aging, and age-related diseases often leads to the presence of cells with low or absent COX activity 2,12-14. Although COX and SDH activities can be investigated individually, the sequential double-labeling method 15,16 has proved to be advantageous in locating cells with mitochondrial dysfunction 12,17-21.
Many of the optimal constitutions of the assay have been determined, such as substrate concentration, electron acceptors/donors, intermediate electron carriers, influence of pH, and reaction time 9,22,23. 3,3'-diaminobenzidine (DAB) is an effective and reliable electron donor 22. In cells with functioning COX, the brown indamine polymer product will localize in mitochondrial cristae and saturate cells 22. Those cells with dysfunctional COX will therefore not be saturated by the DAB product, allowing for the visualization of SDH activity by reduction of nitroblue tetrazolium (NBT), an electron acceptor, to a blue formazan end product 9,24. Cytochrome c and sodium succinate substrates are added to normalize endogenous levels between control and diseased/mutant tissues 9. Catalase is added as a precaution to avoid possible contaminating reactions from peroxidase activity 9,22. Phenazine methosulfate (PMS), an intermediate electron carrier, is used in conjunction with sodium azide, a respiratory chain inhibitor, to increase the formation of the final reaction products 9,25. Despite this information, some critical details affecting the result of this seemly straightforward assay, in addition to specificity controls and advances in the technique, have not yet been presented.

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

The cytochrome c oxidase/sodium dehydrogenase (COX/SDH) double-labeling method allows for direct visualization of mitochondrial respiratory enzyme deficiencies in fresh-frozen tissue sections. This is a straightforward histochemical technique and is useful in investigating mitochondrial diseases, aging, and aging-related disorders.

Visualisierung der mitochondrialen Atmungskette Funktion mit Cytochrom C Oxidase / Succinat-Dehydrogenase (COX / SDH) Double-Kennzeichnung Histochemie

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, normal development or changes in environmental conditions2-5. Understanding the cellular signaling pathways that are involved in the response to hypoxia could provide new insight into treatment strategies for diverse human pathologies, from stroke to cancer. This goal has been impeded, at least in part, by technical difficulties associated with controlled hypoxic exposure in genetically amenable model organisms.
The nematode Caenorhabditis elegans is ideally suited as a model organism for the study of hypoxic response, as it is easy to culture and genetically manipulate. Moreover, it is possible to study cellular responses to specific hypoxic O2 concentrations without confounding effects since C. elegans obtain O2 (and other gasses) by diffusion, as opposed to a facilitated respiratory system6. Factors known to be involved in the response to hypoxia are conserved in C. elegans. The actual response to hypoxia depends on the specific concentration of O2 that is available. In C. elegans, exposure to moderate hypoxia elicits a transcriptional response mediated largely by hif-1, the highly-conserved hypoxia-inducible transcription factor6-9. C .elegans embryos require hif-1 to survive in 5,000-20,000 ppm O27,10. Hypoxia is a general term for "less than normal O2". Normoxia (normal O2) can also be difficult to define. We generally consider room air, which is 210,000 ppm O2 to be normoxia. However, it has been shown that C. elegans has a behavioral preference for O2 concentrations from 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. In larvae and adults, hif-1 acts to prevent hypoxia-induced diapause in 5,000 ppm O212. However, hif-1 does not play a role in the response to lower concentrations of O2 (anoxia, operational definition &lt;10 ppm O2)13. In anoxia, C. elegans enters into a reversible state of suspended animation in which all microscopically observable activity ceases10. The fact that different physiological responses occur in different conditions highlights the importance of having experimental control over the hypoxic concentration of O2.
Here, we present a method for the construction and implementation of environmental chambers that produce reliable and reproducible hypoxic conditions with defined concentrations of O2. The continual flow method ensures rapid equilibration of the chamber and increases the stability of the system. Additionally, the transparency and accessibility of the chambers allow for direct visualization of animals being exposed to hypoxia. We further demonstrate an effective method of harvesting C. elegans samples rapidly after exposure to hypoxia, which is necessary to observe many of the rapidly-reversed changes that occur in hypoxia10,14. This method provides a basic foundation that can be easily modified for individual laboratory needs, including different model systems and a variety of gasses.

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

This paper details how to use continuous-flow hypoxia chambers to generate atmospheres with defined concentrations of O2 to understand biological responses to decreased O2. This system is easy to setup and maintain, and flexible enough to suit a wide range of O2 concentrations and model systems

Erstellen Definierte gasförmigen Umgebungen, um die Auswirkungen von Hypoxie auf Studieren<em&gt; C elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Messung der Auswirkungen von Bakterien auf<em&gt; C. Elegans</em&gt; Verhalten Mit einem Ei Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Analyse der Beta-Zellfunktion mit einzelligen Auflösung Kalzium Imaging im Zebrafisch Inselchen

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights the need to better understand the molecular mechanism involved in adipocyte dysfunction to develop new therapies against obesity-related diseases. Modulating the expression of proteins and micro-RNAs in adipocytes remains highly challenging. This paper describes a protocol to differentiate murine fibroblasts into mature adipocytes and to modulate the expression of proteins and micro-RNAs in mature adipocytes through reverse-transfection using small-interfering RNA (siRNA) and micro-RNA mimicking (miR mimic) oligonucleotides. This reverse-transfection protocol involves the incubation of the transfection reagent and the oligonucleotides to form a complex in the cell culture plate to which the mature adipocytes are added. The adipocytes are then allowed to reattach to the adherent plate surface in the presence of the oligonucleotides/transfection reagent complex. Functional analyses such as the study of insulin signaling, glucose uptake, lipogenesis, and lipolysis can be performed on the transfected 3T3-L1 mature adipocytes to study the impact of protein or micro-RNA manipulation on adipocyte function.

Presented here is a protocol to deliver oligonucleotides such as small-interfering RNA (siRNA), micro-RNA mimics (miRs), or anti-micro-RNA (anti-miR) into mature adipocytes to modulate protein and micro-RNA expression.

Ein Adipozyten-Zellkulturmodell zur Untersuchung des Einflusses der Protein- und Mikro-RNA-Modulation auf die Adipozytenfunktion

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

In vitro Analyse der E3-Ubiquitin-Ligase-Funktion

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...