Dieses Protokoll zeigt eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Messung der Steifigkeit von Hydrogelen und Zellen mit einem handelsüblichen Nanoindenter und stellt auch eine Open-Source-Software zur reproduzierbaren Analyse der erfassten Daten vor. Das Protokoll ermöglicht es uns, Rasterkraftmikroskopie-ähnliche Daten zu erhalten, jedoch zu einem Bruchteil der Komplexität. Dieses Protokoll wird also für Wissenschaftler nützlich sein, die an der Untersuchung der mechanischen Eigenschaften gesunder und kranker Proben interessiert sind, aber wir glauben auch, dass es im Zusammenhang mit der Nanoindentation für weiche Materialien von breiterer Anwendbarkeit sein wird.
Nachdem Sie das Gerät eingeschaltet und die ausgewählte Sonde für das Experiment montiert haben, beginnen Sie mit der Kalibrierung der Sonde. Klicken Sie im Hauptfenster der Software auf Initialisieren. Geben Sie im angezeigten Menü Calibration (Kalibrierung) die Sondendetails in die Eingabefelder ein.
Als nächstes füllen Sie eine dicke Glas-Petrischale mit einem flachen Boden mit dem gleichen Medium wie die Probenschale und passen Sie die Temperatur des Mediums an die der Probe an. Stellen Sie dann die Kalibrierschale unter die Sonde. Für die Kalibrierung in Flüssigkeit befeuchten Sie die Sonde mit einem Tropfen 70% Ethanol oder Isopropanol mit dem Ende der Pipette in leichtem Kontakt mit der Glasferrule, so dass der Tropfen über die freitragende und kugelförmige Spitze gleitet.
Dann schieben Sie den Arm des Nanoindringers manuell nach unten, bis die Sonde vollständig untergetaucht ist, aber immer noch weit vom Boden der Petrischale entfernt ist. Warten Sie fünf Minuten, damit Gleichgewichtsbedingungen in der Flüssigkeit erreicht werden können. Klicken Sie anschließend im Initialisierungsmenü der Software auf Scan-Wellenlänge.
Auf dem Bildschirm des Interferometers wird ein Fortschrittsbalken angezeigt. Überprüfen Sie, ob der optische Scan erfolgreich war, indem Sie zum Bereich Wellenlängen-Scan in der Interferometerbox navigieren. Klicken Sie dann im Menü Initialisieren auf Oberfläche suchen, um den Test schrittweise zu verringern.
Die Sonde hört auf, sich zu bewegen, wenn sie die Glas-Petrischale berührt. Sobald die Sonde mit der Oberfläche in Kontakt ist, bewegen Sie die Sonde um einen Mikrometer nach unten, indem Sie die Pfeiltaste y nach unten im Hauptfenster der Software verwenden. Beobachten Sie das grüne Signal im Live-Fenster für Änderungen der Basislinie mit jedem Mikrometerschritt.
Klicken Sie dann im Menü Initialisieren auf Kalibrieren. Wenn die Kalibrierung abgeschlossen ist, überprüfen Sie die alten und neuen Kalibrierungsfaktoren im angezeigten Popup-Fenster. Wenn der neue Kalibrierfaktor im richtigen Bereich liegt, wie im Manuskript erklärt, klicken Sie auf Neuen Faktor verwenden.
Als nächstes bewegen Sie den Piezo um 500 Mikrometer nach oben. Überprüfen Sie dann, ob der Demodulationskreis korrekt kalibriert wurde, indem Sie auf dem Interferometer-Desktop zur Registerkarte Demodulation navigieren. Tippen Sie vorsichtig auf den optischen Tisch oder den Nanoindenter, um genügend Rauschen zu erzeugen.
Ein weißer Kreis diskreter Datenpunkte sollte den roten Kreis ungefähr abdecken. Laden Sie die Petrischale mit der Probe auf den Mikroskoptisch und bewegen Sie die Sonde des Nanoindringers manuell an die gewünschte Position über der Probe. Schieben Sie die Sonde in Lösung und achten Sie darauf, dass ein bis zwei Millimeter zwischen der Sonde und der Probenoberfläche bleiben.
Warten Sie fünf Minuten, bis die Sonde in Lösung ausgeglichen ist. Fokussieren Sie die Sonde mit dem Lichtmikroskop. Um den Elastizitätsmodul weicher Materialien zu messen, klicken Sie auf Experiment konfigurieren.
Fügen Sie einen Schritt "Oberfläche suchen" und einen einzelnen Einzug in der Verschiebungssteuerung hinzu, um experimentelle Parameter zu bestimmen, die anschließend für den automatischen Matrix-Scan verwendet werden. Wenn der einzelne Einzug erfolgreich ist, konfigurieren Sie einen Matrix-Scan mit 50 bis 100 Punkten im Abstand von 10 bis 100 Mikrometern. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass das Kontrollkästchen Oberfläche automatisch suchen aktiviert ist, klicken Sie auf Bühnenposition verwenden, um den Matrixscan von der aktuellen Bühnenposition aus zu starten.
Richten Sie das Matrix-Scan-Profil in der Verschiebungssteuerung ein. Behalten Sie die Anzahl der Segmente auf fünf bei, und verwenden Sie das Standardverschiebungsprofil. Ändern Sie bei Bedarf das Verdrängungsprofil und die Zeit für jedes geneigte Segment.
Überschreiten Sie nicht Dehnungsraten von mehr als 10 Mikrometern pro Sekunde. Speichern Sie das konfigurierte Experiment im gewünschten Experimentpfad. Klicken Sie auf Experiment ausführen und warten Sie, bis der Vorgang abgeschlossen ist.
Wenn alle Daten erfasst sind, reinigen Sie die Sonde und schalten Sie das Gerät wie im Text beschrieben aus. Für das Screening von Kraft-Weg-Kurven und die Erstellung eines bereinigten Datensatzes im JSON-Format starten Sie vorbereiten. py über die Befehlszeile auf dem Laborcomputer.
Wählen Sie das Optics11-Datenformat aus der Dropdown-Liste aus. Wenn die Daten nicht korrekt geladen werden, starten Sie die grafische Benutzeroberfläche neu und wählen Sie Optics11 Alt. Klicken Sie dann auf Ordner laden und wählen Sie einen Ordner aus, der die zu analysierenden Daten enthält.
Bereinigen Sie den Datensatz mithilfe der Registerkarten auf der rechten Seite der grafischen Benutzeroberfläche. Klicken Sie dann auf JSON speichern und geben Sie einen geeigneten Namen für den bereinigten Datensatz ein. Senden Sie die JSON-Datei an den Computer, auf dem die NanoAnalysis-Software installiert wurde, falls sie sich vom aktuellen Computer unterscheidet.
Starten Sie den nano. py-Datei über die Befehlszeile. Klicken Sie oben links in der grafischen Benutzeroberfläche auf Experiment laden und wählen Sie die JSON-Datei aus.
Dadurch werden die Dateiliste und das Rohkurvendiagramm gefüllt, das den Datensatz in Form von Kraft-Weg-Kurven anzeigt. Aktivieren Sie im Feld Statistiken die Werte der drei Parameter N aktiviert, N fehlgeschlagen und N ausgeschlossen. Um eine bestimmte Kurve genauer zu visualisieren, klicken Sie auf die Kurve.
Dadurch wird es grün hervorgehoben und im aktuellen Kurvendiagramm angezeigt. Sobald eine einzelne Kurve ausgewählt wurde, werden die R- und k-Parameter im Feld Statistik ausgefüllt. Sobald der Datensatz weiter bereinigt wurde, filtern Sie alle Rauschen in den Kurven mithilfe der im Feld Filterung implementierten Filter.
Überprüfen Sie dann die gefilterten Kurven im aktuellen Kurvendiagramm. Die gefilterte Kurve ist schwarz, während die nicht gefilterte Version grün ist. Um den Kontaktpunkt zu finden, wählen Sie im Feld Kontaktpunkt eines aus einer Reihe von numerischen Verfahren aus, die in der Software implementiert wurden.
Passen Sie die Parameter des Algorithmus an den Datensatz an, damit der Kontaktpunkt korrekt lokalisiert wird, wie im Manuskript erklärt. Um zu sehen, wo der Kontaktpunkt auf einer einzelnen Kurve gefunden wurde, wählen Sie die Kurve aus, indem Sie darauf klicken. Klicken Sie dann auf Inspect.
Überprüfen Sie das Popup-Fenster, das angezeigt wird, um festzustellen, wo sich der Kontaktpunkt befindet. Klicken Sie anschließend auf Hertz-Analyse. Dadurch werden drei Diagramme generiert.
Überprüfen Sie die Krafteinzugsdaten für jede Kurve im Datensatz zusammen mit der durchschnittlichen Hertz-Anpassung in Rot. Überprüfen Sie dann die durchschnittliche Krafteindruckkurve mit einem Fehlerband, das eine Standardabweichung anzeigt, zusammen mit der durchschnittlichen Hertz-Anpassung in Rot. Als nächstes überprüfen Sie das Streudiagramm des Elastizitätsmoduls, das sich aus der Anpassung des Hertz-Modells an jede einzelne Kurve ergibt.
Überprüfen Sie das Feld Ergebnisse auf den berechneten Mittelwert des Elastizitätsmoduls und seine Standardabweichung, und stellen Sie sicher, dass sie für das gegebene Experiment angemessen sind. Klicken Sie dann im Feld Speichern auf Hertz. Geben Sie im Popup-Fenster den Dateinamen und das Verzeichnis ein und klicken Sie auf Speichern.
Eine tsv-Datei wird erstellt. Öffnen Sie die tsv-Datei in einer weiteren Software zur statistischen Analyse und weiteren Darstellung. Für Zellnanoindentationsdaten klicken Sie auf Elastizitätsspektrenanalyse.
Untersuchen Sie die beiden erstellten Diagramme, nämlich den Elastizitätsmodul als Funktion der Eindringtiefe für jede Kurve und den durchschnittlichen Elastizitätsmodul als Funktion der Eindringung durch ein Doppelschichtmodell. Sobald die Analyse abgeschlossen ist, klicken Sie auf ES im Feld Speichern. Dadurch wird eine tsv-Datei in das angegebene Verzeichnis exportiert, die in jeder anderen Software Ihrer Wahl geöffnet und geplottet werden kann.
Ein erfolgreiches Experiment führt zum Annäherungssegment einer Kraft-Weg-Kurve mit einer klaren, flachen Basislinie, einem Übergangsbereich und einem geneigten Bereich. Kurven, die Änderungen dieser Form zeigen, können mit NanoPrepare einfach aus dem Datensatz entfernt werden. Mittlere Kraft-Eindruck-Kurven zusammen mit dem durchschnittlichen Hertz-Modell für ein weiches Polyacrylamid-Hydrogel und ein steifes Hydrogel sind hier dargestellt.
Durch Aufzeichnen einzelner Werte des Elastizitätsmoduls wurde der erwartete durchschnittliche Elastizitätsmodul für beide Hydrogele ermittelt. Für Zell-Nanoindentationsexperimente zeigen die durchschnittliche Kraft-Eindring-Kurve und das entsprechende durchschnittliche Hertz-Modell, dass das Hertz-Modell die Entwicklung der Kraft mit zunehmender Eindringtiefe für Zell-Nanoindentationsexperimente nicht vollständig erfasst. Hier werden die durchschnittlichen Elastizitätsspektren bis zu einem Eindruck von 200 Nanometern demonstriert.
Die durchschnittlichen Elastizitätsspektren beginnen bei einer Eindringtiefe von 200 Nanometern zuzunehmen, was auf den Beitrag eines Substrats zum untersuchten scheinbaren Elastizitätsmodul hinweist. Aus diesem Grund wurde 200 Nanometer als Anpassungsbereich sowohl für das Hertz- als auch für das Doppelschichtmodell gewählt. Die Anpassung des Doppelschichtmodells ermöglicht dem Extrakt mehr Informationen über den mechanischen Zustand der Zelle, einschließlich der Dicke des Zellaktinkortex, des Zellaktin-Kortexmoduls und des Zellvolumenmoduls, wie im Haupttext erläutert.
Ein direkter Vergleich zwischen dem Hertz-Modell und dem Elastizitätsspektrenansatz in Bezug auf die Elastizitätsmodulverteilung zeigt überlappende Verteilungen mit vergleichbaren Mitteln, was die Machbarkeit des Elastizitätsspektrenansatzes zeigt. Die genaue Lokalisierung des Kontaktpunkts und die Konsistenz der ausgewählten Algorithmusparameter zwischen den zu vergleichenden Datensätzen ist von größter Bedeutung, um zuverlässige Vergleiche zwischen den Stichproben zu erhalten. Das Verfahren ist allgemein anwendbar, um die lokalen elastischen Eigenschaften biologischer Proben, einschließlich Sphäroide, Organoide, Gewebe und im Allgemeinen alle weichen Materie, zu quantifizieren.
