Wir möchten G. O Toole zur Orientierung und Anregungen bedanken bei der Entwicklung dieser Modelle. Diese Arbeit wurde von der Cystic Fibrosis Foundation (ANDERS06F0 zu GGA, STANTO07RO und STANTO08GA zu BAS), die National Institutes of Health (T32A107363 auf GGA und R01-HL074175 zu BAS) unterstützt wird, und dem National Center for Research Resources Centers for Biomedical Research Excellence (Cobre P20-RR018787 zu BAS).

1. Statische Co-Kultur Biofilm-Modell <ol><li> Die Static Co-Kultur Biofilm Modell 1 verwendet CFBE41o-Zellen (CFBE Zellen), die Zellen, die ursprünglich von einer Person mit CF homozygot für das AF508-CFTR-Mutation 2,3,4 entwickelt verewigt sind. CFBE Zellen sollten bei einer Konzentration von 10 6 Zellen / Well in einer 6-Well Gewebekulturplatten oder 2 X 10 5 in einem 24-Well-Gewebekulturplatten in Minimal Essential Medium (MEM) mit 10% fötalem Rinderserum ausgesät werden, 2mM L-Glutamin, 50 U / ml Penicillin und 50 ug / ml Streptomycin. Wir verwenden 1,5 ml Medium pro Well in 6-Well-Platten und 0,5 ml Medium pro Well in 24-Well-Platten. </li><li> Die Zellen sind bei 37 ° C und 5% CO 2 -95% Luft für 7-10 Tage, um einen Monolayer vor der Inokulation mit Bakterien zu bilden. Das Medium muss jede 2-3 Tage gewechselt werden. Diese Bedingungen haben gezeigt, dass die Bildung einer Monolayer und Tight Junctions führen. </li><li> Wachsen P. aeruginosa in 5 ml LB 18 Stunden bei 37 ° C auf einem Schüttelinkubator bei 200 Umdrehungen pro Minute. Unter diesen Bedingungen, P. aeruginosa Kulturen wird in der Regel erreichen eine Dichte von 5x10 9 KBE / ml. </li><li> Für Bakterieninokulation, entfernen Sie das Medium aus CFBE Zellen und ein gleiches Volumen von MEM ohne Phenolrot, mit 2 mM L-Glutamin (Mikroskopie-Medium). Confluent CFBE Monoschichten mit P. geimpft aeruginosa bei einer Multiplizität der Infektion von rund 30:1 bezogen auf die Anzahl der CFBE Zellen, die ursprünglich ausgesät. Dies entspricht 2 x 10 7 CFU / ml in 1,5 ml MEM / gut für 6-Well-Platten und 1,2 x 10 7 CFU / ml in 0,5 ml MEM / well für 24-Well-Platten. </li><li> Die Platten für 1 Stunde bei 37 ° C und 5% CO 2 -95% Luft. </li><li> Nach dem 1 Stunde Inkubation, sollte der Überstand abgenommen und mit frischem Microscopy Medium mit 0,4% Arginin ergänzt ersetzt werden. </li><li> Bei 37 ° C und 5% CO 2 -95% Luft für verschiedene Zeitpunkte (bis zu ca. 8 Stunden) und zu analysieren, die Integrität der CFBE Monoschicht mit Phasenkontrast-Mikroskopie. Wenn Atemwegszellen nicht konfluent sind, P. aeruginosa wird schnell (innerhalb von Minuten) Zugang zur basolateralen Oberfläche der Zellen und zerstören zelluläre Integrität. Inokulation mit P. aeruginosa-Stämme, die konstitutiv GFP Ergebnisse in fluoreszierenden Biofilm Mikrokolonien, die visualisiert werden Epifluoreszenz oder konfokalen Mikroskopie können. </li><li> Die bakterielle KBE im Biofilm kann durch Waschen der Co-Kultur 2-3 mal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) zu planktonischen Bakterien zu eliminieren bestimmt werden. Nach dem Waschen mit 0,1% zu behandeln Triton X-100 in PBS oder MEM für 10-15 Minuten auf der epithelialen Zellen zu lysieren und verteilen den Biofilm. </li><li> Vortex für 3 Minuten und bereiten serielle Verdünnungen des Lysats. Platte dieser Verdünnungen auf LB-Agar und Inkubation über Nacht bei 37 ° C. Zählen Sie die Kolonien am nächsten Tag auf die CFU bestimmt. </li></ol> 2. Durchflusszelle Co-Kultur Biofilm-Modell <ol><li> Die Durchflusszelle Co-Kultur Biofilm-Modell (Flow-Test) beinhaltet Modifikation der Standard-Biofilm Durchflusszelle Apparat zur Aufnahme CFBE Zellen 5. </li><li> Legen Sie mehrere 40-mm Durchmesser Deckgläschen in ein sauberes 100-ml-Becherglas werden. Deckel fest mit 2 Lagen Alufolie und Autoklaven auf einem Trocken-Zyklus für 20 min. </li><li> Arbeiten in einer Zellkultur Kapuze, packe einen sterilen Deckglas aus dem Becherglas mit Ethanol gewaschen Pinzette und in einen sterilen 60-mm Durchmesser Plastikschale. </li><li> 3 ml vorgewärmten Zellwachstum Medium, Druck auf das Deckglas mit der Spitze der Pipette auf eine Luftblase eingeschlossen darunter zu entfernen und das Deckglas auf den Boden der Plastikschale Kraft. </li><li> Seed 2x10 6 Zellen pro Schale und schütteln Sie die Schale sanft hin und her. Vermeiden Sie wirbeln zu verhindern Zentrifugieren der Zellen gegen die Seiten der Schüssel. </li><li> Die Schale in einem 5% CO 2 -95% Luft bei 37 ° C und füttern die Zellen jeden zweiten Tag mit 3 ml frisches Wachstumsmedium für 8 bis 10 Tagen. Die Zellen bilden eine konfluente Monoschicht auf der Deckglas. </li><li> Wachsen P. aeruginosa in 5 ml LB 18 Stunden bei 37 ° C auf einem Schüttelinkubator bei 200 Umdrehungen pro Minute. Unter diesen Bedingungen, P. aeruginosa Kulturen wird in der Regel erreichen eine Dichte von 5x10 9 KBE / ml. Wir verwenden P. aeruginosa Stamm PAO1 Durchführung der pSMC21 Plasmid für eine konstitutive Expression von GFP 6. </li><li> 1 ml der Bakterienkultur in ein steriles Reaktionsgefäß. Zentrifugation bei 6000 rpm für 3 min, und waschen Sie die bakterielle Pellet zweimal in 1 ml Medium Mikroskopie. </li><li> Verdünnen Sie 0,5 ml gewaschen und Bakterien in 4,5 ml Microscopy Medium auf eine Konzentration von ~ 5x10 8 CFU / ml zu erreichen. </li><li> Beobachtung von lebenden Zellenin Echtzeit erfordert ein bildgebendes Kammer gekoppelt mit einer Schlauchpumpe (um einen Fluss von Nährstoffen für längere Zeitspannen zu gewährleisten) und einen Temperaturregler. Wir nutzen die Bioptechs FCS2 (Focht Live-Cell) Kammer verbunden mit einem Low-Flow-Mikro-Perfusionspumpe mit 1 / 16 th C-flex Schlauch geschnitten, um entsprechende Längen und autoklaviert Sterilität, und über die FCS2 Kammer Controller Temperatur reguliert. Wir halten die Eingangsquelle des Mediums in einem 37 ° C Wasserbad befindet sich gleich neben dem Mikroskop. </li><li> Montieren Sie die Flusskammer. Die FCS2 Kammer enthält eine Selbsthemmung Basis (die sitzt auf der Bühne Adapter während der Bildgebung) und eine obere Hälfte mit dem Perfusionsschläuche und die Kammer-Controller. Die Kammer ist upside-down, bevor sie umgedreht montiert und platziert auf die Bühne Adapter. Halten Sie die obere Hälfte der Kammer auf den Kopf, so dass die Perfusionsschläuche sichtbar sind, und richten Sie die Durchgangslöcher einer 0,75-mm dicken Gummi-Dichtung auf die Perfusionsschläuche. Stapeln Sie die microaqueduct Schlitten mit der Kammer auf der Oberseite des Gummidichtung zur Verfügung, so dass die geriffelte Seite nach oben und legen Sie eine weitere Gummidichtung auf der Oberseite des Schlittens. Die Dicke und innere Geometrie der zweiten Dichtung bestimmen das Volumen der Kammer. Wir in der Regel mit einem 0,75-mm dicken Gummi-Dichtung mit einer 30-mm rund innere Geometrie arbeiten. </li><li> 1 ml der vorgewärmten (37 ° C) Mikroskopie Medium in den Mittelpunkt der Folie. </li><li> Abrufen einer 60-mm-Schale aus der Zellkultur-Inkubator, entfernen Sie das verbrauchte Medium und waschen Sie die Zellen einmal mit 3 ml vorgewärmten Microscopy Medium. Dieser Schritt sorgt für die Beseitigung der Phenolrot und Antibiotika in der Zelle vorhandene Wachstumsmedium. Phenolrot ist leicht fluoreszierend und können mit der Bildgebung stören, während Antibiotika P. ausrotten können aeruginosa Bakterien, bevor sie zu etablieren Biofilme können. </li><li> Mit Ethanol-gewaschen Pinzette, rufen Sie die Deckgläschen aus der Schüssel und senken Sie den Kopf auf die Perle der Mikroskopie Mediums auf die Kammer gelegt. Das Deckglas ruht sich jetzt auf der zweiten Gummidichtung und die Monoschicht von Atemwegszellen nach unten zeigt. </li><li> Halten Sie die montierten Komponenten in einer Hand, setzen Sie den Boden der Kammer auf der Oberseite des Stapels, und drehen Sie die Kammer über schnell, so dass alles wieder richtig herum. Verriegeln Sie die Basis in Position, indem Sie den Ring. </li><li> Schließen Sie das Zuleitungsrohr der Low-Flow-Mikro-Perfusionspumpe und starten Sie den Fluss mit einer Geschwindigkeit von 20 ml / h; dieser Durchfluss innerhalb der Schwimmgeschwindigkeit Fähigkeit P. aeruginosa. Ein zweites Stück Schlauch verbindet die Pumpe in einen Kolben der Mikroskopie Medium in der 37 ° C Wasserbad befindet sich gleich neben dem Mikroskop. </li><li> Bringen Sie sterile pre-cut 1 / 16 th C-Flex-Schlauch mit dem Einlass und Auslass Perfusionsschläuche der Kammer, schließen Sie die Temperaturregler, legen Sie dann die versammelten Kammer auf den Mikroskoptisch eines invertierten Fluoreszenzmikroskop. </li><li> Mit einer 1-ml-Einweg-Spritze die zuvor vorbereiteten Bakteriensuspension in die Kammer, mit einem Zwei-Wege-Ventil in-line zwischen der Pumpe und die Kammer gelegt. In unserem speziellen Einstellung, dauert es eine 0,6 ml Volumen Bakteriensuspension in die Kammer zu erreichen. Passen Sie dieses Volumen nach Ihren speziellen Schlauchlänge. Wir finden es auch nützlich, um eine in-line Einweg 0,22 um Filter zwischen der Pumpe und die Zwei-Wege-Ventil, um Bakterien aus den Strom schwimmen und eine Verunreinigung des Eingangs Kolben zu verhindern statt. </li><li> Um Bakterien, um die Atemwege Zellen legen, stoppen Sie die Pumpe für 2 Stunden. Die Strömung kann dann wieder begonnen werden und bei 20 ml / h für den Rest des Experiments. </li><li> Überwachen Sie die Integrität der Atemwege Zellen durch differentielle Interferenzkontrast (DIC) Mikroskopie während des Experiments, um auf Anzeichen von Schäden an der Monoschicht zu überprüfen. Gleichzeitig verfolgt die Entwicklung der GFP-markierten S. aeruginosa Biofilmen an der apikalen Oberfläche der Atemwege Zellen durch den Erwerb von Bildern mit einer invertierten konfokalen oder Weitwinkel-Fluoreszenz-Mikroskop. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse Wir verwenden ein Stamm von P. aeruginosa mit der pSMC21 Plasmid, das für die konstitutive Expression von GFP 6 ermöglicht. Aus diesem Grund können GFP-markierten Biofilme wachsen auf einem CFBE Monoschicht visualisiert werden Epifluoreszenzmikroskopie. Alternativ kann die Visualisierung der Biofilm durch Färbung unmarkiertem P. erreicht werden aeruginosa mit einer 1% Calcofluor weiß Lösung für 1 Stunde bei 37 ° C 1. Für die Bildgebung Biofilmbildung auf CFBE Zellen in den Fluss-Assay verwenden wir ein maßgeschneidertes Bühne Adapter, sondern mehrere Unternehmen bietet jetzt speziell ausgerüstete Bühne Adapter. Wir arbeiten mit einem Olympus IX70 inversen Mikroskop mit einem ORCA-AG Tiefkühlung CCD-Kamera und einem x60 Ölimmersionsobjektiv (numerische Apertur 1,40) ausgestattet. Der Filter wFerse ist mit einer 480/40 nm Bandpassfilter Anregungsfilter und ein 535/30 nm Bandpass-Emission-Filter ausgestattet. Digitale Bilder wurden mit der OpenLab 4.0.3 Software-Paket (Improvisation) erworben und Volumina wurden durch iterative Restauration mit der Volocity 3.5.1 Software (Improvisation) entfaltet. Quantitative Analyse von 3D-Biofilm-Strukturen wurde mit dem COMSTAT Bildanalyse-Software-Paket 7,8 erreicht. Für jede Co-Kultur-Modell betrachtet, muss man besonders auf die Zytotoxizität der Entwicklung zwischen den Komponenten des Modells zu zahlen. In sowohl statische als auch der Fluss-Zell-Assays, fanden wir, dass die CFBE Monoschicht konnte die Anwesenheit von P. standhalten aeruginosa für bis zu 8 Stunden nach der Impfung ohne Anzeichen von Veränderung. Epitheliale Monoschicht Integrität kann durch Phasenkontrast-Mikroskopie mit einem inversen Mikroskop 1 (Abbildung 1A) oder durch Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Mikroskopie während des gesamten Experiments mit 5 benotet werden. Im Laufe der Zeit, P. aeruginosa produzieren Toxine und Virulenzfaktoren, die und reichern sich die Epithelzellen Monoschicht vollständig oder in Teilen (Abbildung 1B-1C) Schaden. Zytotoxizität kann quantitativ beurteilt werden mit verschiedenen Kits zur Freisetzung von Lactat-Dehydrogenase (LDH) aus den Epithelzellen zu messen. LDH ist ein stabiles cytosolischen Enzym in das extrazelluläre Milieu auf Zell-Lyse oder Zelltod freigesetzt. Wenn die Integrität der Atemwege Monoschicht nicht beeinträchtigt wird (in der Regel für ~ 8 h nach der Impfung), P. aeruginosa Biofilmen kann erfolgreich zu gestalten und zu entwickeln an der apikalen Oberfläche der Atemwege Zellen in beiden Co-Kultur-Modelle beschrieben (Abb. 2A-2B). Nach 3D-Rekonstruktion (Abbildung 2C) und Quantifizierung kann Biomassenakkumulation genau bestimmt werden. Wir haben auch diese Co-Kultur Biofilmen in mehrere phänotypische Tests verwendet. Zum Beispiel, wie oben erwähnt, kann Biofilm CFU leicht durch Lyse der Epithelzellen bestimmt werden, seriell verdünnt das Lysat und Plattierung auf Agarplatten. Wir haben festgestellt, diese Technik vorteilhaft bei der Bestimmung der Beständigkeit von verschiedenen Stämmen auf antibiotische Behandlung. Darüber hinaus können Biofilm Toxizität gegenüber den Epithelzellen gemessen unter Verwendung kommerziell erhältlicher LDH Nachweis-Kits werden. Auf diese Weise kann die Rolle von Virulenzfaktoren in der Toxizität von Biofilmen zu beurteilen. Diese Modell-Systeme unterstützen auch eine Reihe von Gen-Expression-Anwendungen, einschließlich des Antragstellers Fusion Studien, RT-PCR und Microarray-Analyse 1,5,9. <img src="/files/ftp_upload/2186/2186fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Monolayer von CFBE Zellen und repräsentative Bilder kompromittiert und Atemwege Zellmonoschichten durch P. beschädigt aeruginosa Biofilm Wachstum. (A) Repräsentative Bild einer Monolayer von CFBE Zellen in Gewebekultur-Platten kultiviert, durch Phasenkontrast-Mikroskopie untersucht. Scale-bar, 120 um. (B) Beispiel eines kompromittierten CFBE Monoschicht. Auch wenn die Monoschicht nicht angezeigt offensichtlich sichtbare Beschädigungen noch, P. aeruginosa Bakterien gesehen Ausbreitung zwischen den Tight Junctions der Epithelzellen und Zugang zu den basolateralen Membranen. Biofilmbildung ist in der Regel nicht unter diesen Bedingungen aufgrund der sich verschlechternden Monoschicht erreicht. Scale-bar, 20 um. (C) Beispiel eines verwilderten P. aeruginosa Biofilm beobachtet 24 h nach der Inokulation. Nach der erfolgreichen Unterstützung Biofilmbildung wurde die CFBE Monoschicht irreparabel beschädigt und ist nun praktisch nicht vorhanden. Residual Biofilm wachsen als flache Schicht von Bakterien, wird gezeigt, Befestigung am Deckglas. Scale-bar, 20 um. <img src="/files/ftp_upload/2186/2186fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. P. aeruginosa Biofilmen an der apikalen Oberfläche von konfluenten CFBE Zellen unter Verwendung des Static Co-Kultur Biofilm-Modell und die Durchflusszelle Co-Kultur Biofilm-Modell entwickelt. (A) Repräsentative Bild eines GFP-exprimierenden P. aeruginosa Biofilm auf einem Monolayer von CFBE Zellen unter Verwendung des Static Co-Kultur Biofilm-Modell, durch Epifluoreszenzmikroskopie beurteilt gewachsen. Das Bild ist eine Überlagerung der Phasenkontrast-Kanal und die Fluoreszenz-Kanal. Scale-bar, 35 um. (B) Repräsentative Bild eines GFP-markierten S. aeruginosa Biofilm für 6 h auf einem Monolayer von CFBE Zellen unter Verwendung des Flow Cell Co-Kultur Biofilm-Modell entwickelt. Zur Erleichterung der Visualisierung der Atemwege Monolayer wurden Kerne mit 10 pg / mL Hoechst 33342 (Molecular Probes) für 30 min vor der Inokulation mit P. gebeizt aeruginosa. Zusammengeführt und pseudocolored Bilder wurden durch Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) betrachtet, und die entsprechenden fluoreszierenden Bilder angezeigt werden. Biofilme, präsentiert als grüne Klumpen an der apikalen Oberfläche der CFBE Zellen werden über die Atemwege Zellen verteilt. Scale-bar, 20 um. (C) Dreidimensionale RekonstruktionTION der z-Serie Bildstapel mit dem typischen pilzförmige Strukturen von 6 h-jährige P. aeruginosa Biofilmen bilden auf einer CFBE Zellmonolayer. Scale-bar, 10 pm.

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	<li>Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+analysis+of+tobramycin-treated+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+on+cystic+fibrosis-derived+airway+epithelial+cells.">In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells.</a> Infect Immun. 76, 1423-1433 (2008).</li><li>Bruscia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CF+cell+lines+corrected+at+DeltaF508-CFTR+locus+by+SFHR-mediated+targeting.">Isolation of CF cell lines corrected at DeltaF508-CFTR locus by SFHR-mediated targeting.</a> Gene Ther. 9, 683-685 (2002).</li><li>Cozens, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+expression+and+chloride+secretion+in+polarized+immortal+human+bronchial+epithelial+cells.">CFTR expression and chloride secretion in polarized immortal human bronchial epithelial cells.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 10, 38-47 (1994).</li><li>Hentchel-Franks, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+airway+cl-+secretion+in+human+subjects+by+adenosine.">Activation of airway cl- secretion in human subjects by adenosine.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 31, 140-146 (2004).</li><li>Moreau-Marquis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DeltaF508-CFTR+mutation+results+in+increased+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa+by+increasing+iron+availability.">The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, 25-37 (2008).</li><li>Kuchma, S. L., Connolly, J. P., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-component+regulatory+system+regulates+biofilm+maturation+and+type+III+secretion+in+Pseudomonas+aeruginosa.">A three-component regulatory system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas aeruginosa.</a> J Bacteriol. 187, (2005).</li><li>Heydorn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+reproducibility+in+flow-chamber+biofilms.">Experimental reproducibility in flow-chamber biofilms.</a> Microbiology. 146 (Pt 10), 2409-2415 (2000).</li><li>Heydorn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT.">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).</li><li>Anderson, G. G., Yahr, T. L., Lovewell, R. R., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pseudomonas+aeruginosa+magnesium+transporter+MgtE+inhibits+transcription+of+the+type+III+secretion+system.">The Pseudomonas aeruginosa magnesium transporter MgtE inhibits transcription of the type III secretion system.</a> Infect Immun. 78, (2010).</li><li>Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+microbial+biofilms.">Overview of microbial biofilms.</a> J Ind Microbiol. 15, 137-140 (1995).</li><li>Hoiby, N., Frederiksen, B., Pressler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+early+Pseudomonas+aeruginosa+infection.">Eradication of early Pseudomonas aeruginosa infection.</a> J Cyst Fibros. 4, 49-54 (2005).</li><li>Ko, Y. H., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis:+a+brief+look+at+some+highlights+of+a+decade+of+research+focused+on+elucidating+and+correcting+the+molecular+basis+of+the+disease.">Cystic fibrosis: a brief look at some highlights of a decade of research focused on elucidating and correcting the molecular basis of the disease.</a> J Bioenerg Biomembr. 33, 513-521 (2001).</li><li>Gibson, R. L., Burns, J. L., Ramsey, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+and+management+of+pulmonary+infections+in+cystic+fibrosis.">Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis.</a> Am J Respir Crit Care Med. 168, 918-951 (2003).</li><li>Furukawa, S., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+their+options+open:+acute+versus+persistent+infections.">Keeping their options open: acute versus persistent infections.</a> J Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).</li><li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+and+analyzing+static+biofilms.">Growing and analyzing static biofilms.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 1, Unit 1B 1-Unit 1B 1 (2005).</li><li>O'Toole, G. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+biofilm+formation+in+Pseudomonas+fluorescens+WCS365+proceeds+via+multiple,+convergent+signalling+pathways:+a+genetic+analysis.">Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis.</a> Mol Microbiol. 28, 449-461 (1998).</li><li>Gomez, M. I., Prince, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunistic+infections+in+lung+disease:+Pseudomonas+infections+in+cystic+fibrosis.">Opportunistic infections in lung disease: Pseudomonas infections in cystic fibrosis.</a> Curr Opin Pharmacol. 7, 244-251 (2007).</li></ol>

Biofilme sind Gemeinschaften von Bakterien, die in Reaktion auf Reize aus der Umwelt zu bilden. Diese Signale aus der Umwelt auf globaler regulatorischer Veränderungen innerhalb jedes Bakterium, wodurch die Bindung an eine Oberfläche, Aggregation, Herstellung von Exopolysaccharide und andere Phänotypen wie erhöhte Antibiotikaresistenz 10 führen. In den letzten paar Jahrzehnten hat viele Beweise der Hypothese, dass Biofilme eine große Rolle spielen in der Pathogenese der chronischen Infektionen unterstü...

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>FCS2 (Focht Live-Cell) chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bioptechs, Butler, PA</td>
<td>060319131616</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FCS2 chamber controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bioptechs, Butler, PA</td>
<td>060319-2-0303</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>40 mm glass coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bioptechs, Butler, PA</td>
<td>PH 40-1313-0319</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech, Manassass, VA</td>
<td>#10-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM without phenol red</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech, Manassass, VA</td>
<td>Mediatech, Manassass, VA</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

co-culture models of pseudomonas aeruginosa biofilms grown on live human airway cells

Bakterielle Biofilme sind mit einer Reihe von verschiedenen Krankheiten beim Menschen in Verbindung gebracht, aber Biofilm Entwicklung hat in der Regel auf nicht-lebenden Oberflächen untersucht. In diesem Papier beschreiben wir Protokolle zur Bildung Pseudomonas aeruginosa Biofilmen auf die menschliche Epithelzellen der Atemwege (CFBE Zellen) in Kultur gezüchtet. Bei der ersten Methode (der so genannten Static Co-Kultur Biofilm-Modell), P. aeruginosa ist mit CFBE Zellen Monolayers auf Standard-Zellkultur-Platten kultiviert inkubiert. Obwohl das Bakterium ist sehr giftig für Epithelzellen, die Zugabe von Arginin verzögert die Zerstörung der Monoschicht lange genug für Biofilme auf der CFBE Zellen bilden. Die zweite Methode (sog. Flow Cell Co-Kultur Biofilm Model), beinhaltet die Anpassung eines Biofilms Durchflusszelle Apparate, die oft in Biofilm-Forschung, wird ein Deckglas Unterstützung einer Monolayer von CFBE Zellen unterzubringen. Diese Monoschicht mit P. geimpft aeruginosa und eine peristaltische Pumpe fließt dann frisches Medium über die Zellen. In beiden Systemen bilden bakterielle Biofilme innerhalb von 6-8 Stunden nach der Impfung. Visualisierung des Biofilms wird durch die Verwendung von P. verbesserte aeruginosa-Stämme konstitutiv grün fluoreszierende Protein (GFP). Die statischen und Durchflusszelle Co-Kultur Biofilm-Assays sind Modellsysteme für die frühe P. aeruginosa-Infektion der Mukoviszidose (CF) Lunge, und diese Techniken ermöglichen unterschiedliche Aspekte der P. aeruginosa Biofilm-Bildung und Virulenz untersucht werden, einschließlich Biofilm Zytotoxizität, Messung von Biofilm CFU, und Färbung und Visualisierung der Biofilm.

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Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Dieses Papier beschreibt verschiedene Methoden der wachsenden<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Biofilme auf kultivierten menschlichen Epithelzellen der Atemwege. Diese Protokolle können an unterschiedliche Aspekte der Bildung von Biofilmen, einschließlich Visualisierung der Biofilm-Studie, Färbung des Biofilms, der Messung der Kolonie-bildenden Einheiten (KBE) des Biofilms und Studium Biofilm Zytotoxizität werden.

Co-Kultur Modelle Pseudomonas aeruginosa Biofilme auf lebenden menschlichen Zellen gezüchtet Airway

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

co-culture-models-pseudomonas-aeruginosa-biofilms-grown-on-live-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

22.1K Aufrufe.  Dartmouth College. Dieses Papier beschreibt verschiedene Methoden der wachsenden Pseudomonas aeruginosa Biofilme auf kultivierten menschlichen Epithelzellen der Atemwege. Diese Protokolle können an unterschiedliche Aspekte der Bildung von Biofilmen, einschließlich Visualisierung der Biofilm-Studie, Färbung des Biofilms, der Messung der Kolonie-bildenden Einheiten (KBE) des Biofilms und Studium Biofilm Zytotoxizität werden.

Serie: Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa und Saccharomyces cerevisiae Biofilm im Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Forschung

Immunologie und Infektion

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

RNA Isolierung von Pseudomonas aeruginosa Kolonisierung der Murine Gastrointestinaltrakt

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Langzeitchronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airway-Infektion bei Mäusen

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

Beurteilung der Innate Sensing von HIV-1-infizierten CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen durch Plasmazytoide Dendritische Zellen unter Verwendung eines<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Co-Kultursystem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa induzierte Lungenschädigung-Modell

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

Methoden zur Erkennung von zytotoxischen amyloiden folgende Infektion der pulmonalen Endothelzellen durch Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype called mucoidy. Alginate is linked to chronic lung infections resulting in poor prognosis in patients with cystic fibrosis (CF). Understanding the pathways that regulate the production of alginate can aid in the development of novel therapeutic strategies targeting the alginate formation. Another disease-related phenotype is the small colony variant (SCV). SCV is due to the slow growth of bacteria and often associated with increased resistance to antimicrobials. In this paper, we first show a method of culturing a genetically defined form of P. aeruginosa SCV due to pyrimidine biosynthesis mutations. Supplementation of nitrogenous bases, uracil or cytosine, returns the normal growth to these mutants, demonstrating the presence of a salvage pathway that scavenges free bases from the environment. Next, we discuss two methods for the measurement of bacterial alginate. The first method relies on the hydrolysis of the polysaccharide to its uronic acid monomer followed by derivatization with a chromogenic reagent, carbazole, while the second method uses an ELISA based on a commercially available, alginate-specific mAb. Both methods require a standard curve for quantitation. We also show that the immunological method is specific for alginate quantification and may be used for the measurement of alginate in the clinical specimens.

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Here, we describe a growth condition to culture the small colony variant of Pseudomonas aeruginosa. We also describe two separate methods for the detection and quantitation of the exopolysaccharide alginate produced by P. aeruginosa using a traditional uronic acid carbazole assay and an alginate-specific monoclonal antibody (mAb) based ELISA.

Kultur der kleinen Kolonie Variante von Pseudomonas aeruginosa und Quantitation seines Alginats

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of chronic wound infections in diabetic and hospitalized patients. There is an urgent need for chronic infection models to aid in the investigation of wound pathogenesis and the development of new therapies against this pathogen. Here, we describe a protocol that uses delayed inoculation 24 hours after full-thickness excisional wounding. The infection of the provisional wound matrix present at this time forestalls either rapid clearance or dissemination of infection and instead establishes chronic infection lasting 7&#8211;10 days without the need for implantation of foreign materials or immune suppression. This protocol mimics a typical temporal course of post-operative infection in humans. The use of a luminescent P. aeruginosa strain (PAO1:lux) allows for quantitative daily assessment of bacterial burden for P. aeruginosa wound infections. This novel model may be a useful tool in the investigation of bacterial pathogenesis and the development of new therapies for chronic P. aeruginosa wound infections.

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

We describe a delayed inoculation protocol for generating chronic wound infections in immunocompetent mice.

Ein verzögertes Impfmodell der chronischen Pseudomonas aeruginosa Wundinfektion

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of bacteria in lung models can re-adapt epithelial arrangement, while immune cells coordinate an inflammatory response against the bacteria in the microenvironment. While in vivo models have been the choice for testing new anti-infectives in the context of cystic fibrosis, they still do not accurately mimic the in vivo conditions of such diseases in humans and the treatment outcomes. Complex in vitro models of the infected airways based on human cells (bronchial epithelial and macrophages) and relevant pathogens could bridge this gap and facilitate the translation of new anti-infectives into the clinic. For such purposes, a co-culture model of the human cystic fibrosis bronchial epithelial cell line CFBE41o- and THP-1 monocyte-derived macrophages has been established, mimicking an infection of the human bronchial mucosa by P. aeruginosa at air-liquid interface (ALI) conditions. This model is set up in seven days, and the following parameters are simultaneously assessed: epithelial barrier integrity, macrophage transmigration, bacterial survival, and inflammation. The present protocol describes a robust and reproducible system for evaluating drug efficacy and host responses that could be relevant for discovering new anti-infectives and optimizing their aerosol delivery to the lungs.

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

We describe a protocol for a three-dimensional co-culture model of infected airways, using CFBE41o- cells, THP-1 macrophages, and Pseudomonas aeruginosa, established at the air-liquid interface. This model provides a new platform to simultaneously test antibiotic efficacy, epithelial barrier function, and inflammatory markers.

P. aeruginosa Infizierte 3D-Co-Kultur von Bronchialepithelzellen und Makrophagen an der Luft-Flüssig-Schnittstelle zur präklinischen Bewertung von Anti-Infektivika

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic infection. The development of chronic P. aeruginosa infections is associated with a decline in lung function and increased morbidity. Therefore, there is a great interest in elucidating the reasons for the failure to eradicate P. aeruginosa with antibiotic therapy which occurs in approximately 10-40% of pediatric patients. One of many factors that can affect host clearance of P. aeruginosa and antibiotic susceptibility is variations in spatial organization (such as aggregation or biofilm formation) and polysaccharide production. Therefore, we were interested in visualizing the in situ characteristics of P. aeruginosa within the sputum of CF patients. A tissue clearing technique was applied to sputum samples after embedding the samples into a hydrogel matrix to retain the 3D structures relative to host cells. After tissue clearing, fluorescent labels and dyes were added to allow visualization. Fluorescence in situ hybridization was performed for the visualization of bacterial cells, binding of fluorescently labeled anti-Psl-antibodies for the visualization of the exopolysaccharide and DAPI staining to stain host cells to obtain structural insight. These methods allowed for the high-resolution imaging of P. aeruginosa within the sputum of CF patients via confocal laser scanning microscopy.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

This protocol provides methods for visualization of bacterial cells and polysaccharide synthesis locus (Psl) polysaccharide within the sputum of cystic fibrosis patients.