Wenn wir also neuartige Antiinfektiva bewerten, müssen wir uns mit zwei Dingen befassen. Eine Seite sind die Bakterien. Wenn es sich um planktonische oder informierte Biofilme handelt, ist die andere Seite das Vorhandensein von Wirtszellen, insbesondere epithelialen Wirtszellen, die enge biologische Barrieren bilden.
Wenn diese Barrieren bewirkt werden, wie die monologische Reaktion sein könnte, und mit diesem neuen Modell können wir tatsächlich beide Parameter gleichzeitig überwachen. Bei der Behandlung von bakteriellen Infektionen müssen wir erkennen, welches Organ betroffen ist. Zum Beispiel, wenn es die Lunge ist, können wir nutzen, und topisch das Medikament als Aerosol verabreichen.
Wenn wir jedoch ein Modell haben wollen, um dies zu untersuchen, brauchen wir ein Modell, das auch die Position von Aerosolen ermöglicht, wie es in unserem Modell der Fall ist. Der andere Vorteil ist, dass es auf menschlichen Zellen basiert, so dass wir Probleme aufgrund von Unterschieden zu Tieren und Arten unterschieden vermeiden können. Dieses System könnte Ihnen mehr Einblick in das Gebiet der Infektionsforschung geben, indem es Licht auf molekulare und zelluläre Ereignisse während der Interaktion von Wirtszellen und Bakterien wirft.
Wenn Sie dieses Protokoll zum ersten Mal versuchen, denken Sie daran, das Zellmedium auf Sterilität und Zellmorphologie zu überprüfen und vorsichtig zu sein, wenn Sie mit den durchlässigen Stützen umgehen. Kultivieren Sie CFBE41 O Minuszellen in einem T 75-Kolben mit einem minimalen essentiellen Medium mit 10%FCS, 1%nicht-essentiellen Aminosäuren und 600 Milligramm pro Liter Glukose bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Fügen Sie den Zellen alle zwei bis drei Tage frisches Medium hinzu.
Nachdem die Zellen 70% Konfluenz erreicht haben, waschen Sie sie mit 10 MilliliterPBS und lösen Sie sie 15 Minuten lang mit drei Millilitern Trypsin EDTA bei 37 Grad Celsius. Dann fügen Sie sieben Milliliter frisches MEM hinzu und zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 mal G für vier Minuten. Nach dem Wegwerfen des Überstandes bei 10 MillilitermeM, während die Klumpen mit sanften Pipetten gestört werden.
Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler oder Hämozytometerkammer, dann verdünnen Sie sie auf eine Konzentration von 200.000 Zellen pro 500 Mikroliter für die Aussaat in 12 Brunnenplatten mit durchlässigen Stützen. Fügen Sie 500 Mikroliter der Zellsuspension pro Brunnen auf die apikale Seite der durchlässigen Unterstützung. Dann 1,5 Milliliter frisches Medium auf die basale Seitenseite geben.
Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 72 Stunden. Am dritten Tag nach der Aussaat, erstellen Sie eine Luftflüssigkeitsschnittstelle, indem Sie das Medium von der basalen Seitenseite zuerst dann von der apikalen Seite entfernen. Fügen Sie 500 Mikroliter frisches MEM auf die basale Seitenseite und ändern Sie das Medium jeden zweiten Tag, bis Zellen eine konfluente Monoschicht bilden.
Um die epitheliale Barriereeigenschaften der Zellen zu bewerten, fügen Sie 500 Mikroliter Zellmedium zur apikalen Seite und 1,5 Milliliter zur Basalseite hinzu und geben die Platte dann für eine Stunde an den Inkubator zurück. Messen Sie den elektrischen Transitmaterial oder TEER mit ann STX2 Essstäbchenelektrode und einem Epithelvolt Ohm Meter. Um THP1-Zellen zu kultivieren, wachsen sie im T 75 Kolben mit RPMI 1640 Medium, ergänzt mit 10%FCS bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.
Teilen Sie die Zellen jeden zweiten Tag, indem Sie 2 Millionen Zellen pro Milliliter in einem neuen T75-Kolben säen. Um die THP1-Zellen zu unterscheiden, zentrifugieren Sie den Inhalt des Kolbens bei 300 mal G für vier Minuten, entsorgen Sie den Überstand. Das Pellet in frischem Medium aussetzen und in einen neuen T75-Kolben geben.
Fügen Sie den Zellen 10 Nanogramm pro Milliliter PMA hinzu und geben Sie sie an den Inkubator zurück. Um die Makrophagen wie Zellen zu lösen, waschen Sie sie einmal mit PBS bei 37 Grad Celsius und inkubieren Sie sie mit drei Millilitern Zellablösung, die 0,5 Millimolar EDTA für 10 Minuten bei Raumtemperatur enthält. Prüfen Sie die Zellablösung unter einem invertierten Mikroskop.
Wenn sich die Zellen gelöst haben, fügen Sie sieben Milliliter frisches Medium hinzu und zentrifugieren Sie sie bei 300 mal G für vier Minuten. Nach dem Entfernen des Überstandes die Makrophagenzellen in drei MilliliterTH1-Medium in einem 15-Milliliter-Konikonröhre wieder aufheben, die Zellen zählen und maximal eine Stunde lang inkubieren, bevor sie die Kokultur einrichten. Um eine epitheliale Makrophagen-Kokultur zu etablieren, entfernen Sie das Medium aus der unteren Kammer der CFBE41 O Minus-Monolayer und invertieren Sie vorsichtig die Stütze in einer sterilen Glas-Petrischale, verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen zu entfernen, die durch die Membranporen überwuchert sind.
Legen Sie 200 000 THP1-Makrophagen in 200 Mikroliter RPMI auf die basale Seitenseite des invertierten Einsatzes in jedem Brunnen, schließen Sie die Petri-Gerichte und inkubieren Sie sie für zwei Stunden. Legen Sie die Einsätze dann wieder in die 12 gut Mikroplatten und fügen Sie 500 Mikroliter MEM-Medium auf die basale Seitenseite des durchlässigen Einsatzes ein. Impfen 15 Milliliter lb ergänzt mit 300 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin mit einer einzigen Kolonie von P aeruginosa, PAO1GFP, inkubieren die Bakterien für 18 Stunden bei 37 Grad Celsius, während schütteln bei 180 U/min.
Nach der Inkubation die Bakterien in ein 50 Milliliter konisches Rohr und Zentrifugen bei 3, 850 mal G für fünf Minuten übertragen. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 10 Milliliter sterilen PBS hinzu, der auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde. Messen Sie die optische Dichte mit 600 Nanometern und passen Sie die Konzentration von Bakterien mit dem Zellkulturmedium auf eine Endkonzentration von 200.000 koloniebildenden Einheiten pro Milliliter an, was einer Vielzahl von Infektionen eines Bakteriums pro Epithelzelle entspricht.
Fügen Sie 100 Mikroliter bakterielle Suspension auf der apikalen Seite der durchlässigen Stütze hinzu und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für eine Stunde, damit Bakterien an den Zellen befestigt werden können, und entfernen Sie dann vorsichtig apikale Flüssigkeit mit einer Pipette, um ALI-Bedingungen wiederherzustellen. Für Experimente mit medikamentöser Behandlung 500 Mikroliter einer im Zellmedium verdünnten Wirkstofflösung zur apikalen Seite hinzufügen. Dann 1,5 Milliliter Zellmedium auf die basale Seitenseite geben.
Sammeln Sie 500 Mikroliter des atypischen und basalen Seitenmediums und bündeln Sie sie, um die KBE nicht angeschlossener Bakterien zu bewerten. Um das Überleben von angeschlossenen oder verinnerlichten Bakterien zu beurteilen, fügen Sie 500 Mikroliter sterilen entionisierten kalten Wassers in jedes Fach des durchlässigen Trägers ein und inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Wenn Sie Die KBE aus gefrorenen Proben bewerten, tauen Sie sie 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf.
Dann verwenden Sie Pipettenspitzen, um die Membranoberfläche zu kratzen, wobei darauf geachtet wird, dass die Brunnen nicht zu stark unter Druck gesetzt werden. Pipette nach oben und unten, um alle haftenden Inhalte zu entfernen. Mit der bakteriellen Suspension aus beiden Fraktionen, machen Sie eine ein bis zehn serielle Verdünnung mit PBS Tween und platte die Bakterien auf lb Agar Platten.
Inkubieren Sie die Agarplatten bei 30 Grad Celsius für 16 bis 72 Stunden, zählen Sie dann die Kolonien und berechnen Sie die KBE. Die Morphologie der resultierenden Kokultur menschlicher Bronchialepithelzellen und Makrophagen auf der apikalen und basilikanen Seitenseite der durchlässigen Stützen wird hier gezeigt. Eine höhere TEER-Messung und Immunfärbung für die engen Knotenproteine ZO1 erwies sich als epitheliale Barriereintegrität.
Um eine bakterielle Infektion zu modellieren, wurde P aeruginosa auf CFBE41 o minus Zellen geimpft. Makrophagen wurden sechs Stunden nach der Infektion auf der apikalen Seite der Co-Kultur beobachtet. Der TEER fiel auf 250 Ohm pro Zentimeter quadratisch, was auf eine kompromittierte Epithelbarriere hindeutet, die auch durch ZO1-Färbung vorgeschlagen wurde.
Die Makrophagen-Transmigration durch die durchlässigen Filterporen und die Bakterienaufnahme durch THP-1-Zellen auf der apikalen Seite wird hier gezeigt. In den THP-1-Monokulturen, Makrophagenmigration bereits eine Stunde nach der Infektion. In der Zwischenzeit wurde die Migration nach drei Stunden nach der Infektion in der Co-Kultur gesehen.
Infizierte Kokulturen, die sechs oder 20 Stunden lang mit Tobramycin behandelt wurden, wurden mit konfokaler Scanlasermikroskopie abgebildet. Ohne Behandlung starben entweder die Epithelzellen oder Makrophagen nach 20 Stunden Infektion. Obwohl sie nach sechs Stunden Behandlung in den Mikroskopiebildern gesehen wurden, zeigte ein CFU-Test, dass sich die Bakterien nicht vermehrten.
Dennoch erholten sich die Bakterien nach der 20-stündigen Behandlung wieder. TEER von Monokulturen und Kokulturen wurden ebenfalls gemessen. Die Kokultur von CFBE41 o minus Zellen mit THP-1 induzierte keine Veränderungen in der Epithelbarriereintegrität im Vergleich zur Monokultur.
Bei einer Infektion sank der TEER-Wert. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Zellen richtig sitzen und die Filtermembran nicht gestört wird. Daher müssen die Zellsaatschritte sorgfältig durchgeführt werden.
Zusätzlich zu diesem Protokoll würde die Vernebelung von Antibiotika auf den Einsätzen es ermöglichen, zu sehen, ob sich das Überleben von Bakterien im Vergleich zu den untergetauchten Bedingungen ändert.
