Wir möchten G. O Toole zur Orientierung und Anregungen bedanken bei der Entwicklung dieser Modelle. Diese Arbeit wurde von der Cystic Fibrosis Foundation (ANDERS06F0 zu GGA, STANTO07RO und STANTO08GA zu BAS), die National Institutes of Health (T32A107363 auf GGA und R01-HL074175 zu BAS) unterstützt wird, und dem National Center for Research Resources Centers for Biomedical Research Excellence (Cobre P20-RR018787 zu BAS).

1. Statische Co-Kultur Biofilm-Modell <ol><li> Die Static Co-Kultur Biofilm Modell 1 verwendet CFBE41o-Zellen (CFBE Zellen), die Zellen, die ursprünglich von einer Person mit CF homozygot für das AF508-CFTR-Mutation 2,3,4 entwickelt verewigt sind. CFBE Zellen sollten bei einer Konzentration von 10 6 Zellen / Well in einer 6-Well Gewebekulturplatten oder 2 X 10 5 in einem 24-Well-Gewebekulturplatten in Minimal Essential Medium (MEM) mit 10% fötalem Rinderserum ausgesät werden, 2mM L-Glutamin, 50 U / ml Penicillin und 50 ug / ml Streptomycin. Wir verwenden 1,5 ml Medium pro Well in 6-Well-Platten und 0,5 ml Medium pro Well in 24-Well-Platten. </li><li> Die Zellen sind bei 37 ° C und 5% CO 2 -95% Luft für 7-10 Tage, um einen Monolayer vor der Inokulation mit Bakterien zu bilden. Das Medium muss jede 2-3 Tage gewechselt werden. Diese Bedingungen haben gezeigt, dass die Bildung einer Monolayer und Tight Junctions führen. </li><li> Wachsen P. aeruginosa in 5 ml LB 18 Stunden bei 37 ° C auf einem Schüttelinkubator bei 200 Umdrehungen pro Minute. Unter diesen Bedingungen, P. aeruginosa Kulturen wird in der Regel erreichen eine Dichte von 5x10 9 KBE / ml. </li><li> Für Bakterieninokulation, entfernen Sie das Medium aus CFBE Zellen und ein gleiches Volumen von MEM ohne Phenolrot, mit 2 mM L-Glutamin (Mikroskopie-Medium). Confluent CFBE Monoschichten mit P. geimpft aeruginosa bei einer Multiplizität der Infektion von rund 30:1 bezogen auf die Anzahl der CFBE Zellen, die ursprünglich ausgesät. Dies entspricht 2 x 10 7 CFU / ml in 1,5 ml MEM / gut für 6-Well-Platten und 1,2 x 10 7 CFU / ml in 0,5 ml MEM / well für 24-Well-Platten. </li><li> Die Platten für 1 Stunde bei 37 ° C und 5% CO 2 -95% Luft. </li><li> Nach dem 1 Stunde Inkubation, sollte der Überstand abgenommen und mit frischem Microscopy Medium mit 0,4% Arginin ergänzt ersetzt werden. </li><li> Bei 37 ° C und 5% CO 2 -95% Luft für verschiedene Zeitpunkte (bis zu ca. 8 Stunden) und zu analysieren, die Integrität der CFBE Monoschicht mit Phasenkontrast-Mikroskopie. Wenn Atemwegszellen nicht konfluent sind, P. aeruginosa wird schnell (innerhalb von Minuten) Zugang zur basolateralen Oberfläche der Zellen und zerstören zelluläre Integrität. Inokulation mit P. aeruginosa-Stämme, die konstitutiv GFP Ergebnisse in fluoreszierenden Biofilm Mikrokolonien, die visualisiert werden Epifluoreszenz oder konfokalen Mikroskopie können. </li><li> Die bakterielle KBE im Biofilm kann durch Waschen der Co-Kultur 2-3 mal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) zu planktonischen Bakterien zu eliminieren bestimmt werden. Nach dem Waschen mit 0,1% zu behandeln Triton X-100 in PBS oder MEM für 10-15 Minuten auf der epithelialen Zellen zu lysieren und verteilen den Biofilm. </li><li> Vortex für 3 Minuten und bereiten serielle Verdünnungen des Lysats. Platte dieser Verdünnungen auf LB-Agar und Inkubation über Nacht bei 37 ° C. Zählen Sie die Kolonien am nächsten Tag auf die CFU bestimmt. </li></ol> 2. Durchflusszelle Co-Kultur Biofilm-Modell <ol><li> Die Durchflusszelle Co-Kultur Biofilm-Modell (Flow-Test) beinhaltet Modifikation der Standard-Biofilm Durchflusszelle Apparat zur Aufnahme CFBE Zellen 5. </li><li> Legen Sie mehrere 40-mm Durchmesser Deckgläschen in ein sauberes 100-ml-Becherglas werden. Deckel fest mit 2 Lagen Alufolie und Autoklaven auf einem Trocken-Zyklus für 20 min. </li><li> Arbeiten in einer Zellkultur Kapuze, packe einen sterilen Deckglas aus dem Becherglas mit Ethanol gewaschen Pinzette und in einen sterilen 60-mm Durchmesser Plastikschale. </li><li> 3 ml vorgewärmten Zellwachstum Medium, Druck auf das Deckglas mit der Spitze der Pipette auf eine Luftblase eingeschlossen darunter zu entfernen und das Deckglas auf den Boden der Plastikschale Kraft. </li><li> Seed 2x10 6 Zellen pro Schale und schütteln Sie die Schale sanft hin und her. Vermeiden Sie wirbeln zu verhindern Zentrifugieren der Zellen gegen die Seiten der Schüssel. </li><li> Die Schale in einem 5% CO 2 -95% Luft bei 37 ° C und füttern die Zellen jeden zweiten Tag mit 3 ml frisches Wachstumsmedium für 8 bis 10 Tagen. Die Zellen bilden eine konfluente Monoschicht auf der Deckglas. </li><li> Wachsen P. aeruginosa in 5 ml LB 18 Stunden bei 37 ° C auf einem Schüttelinkubator bei 200 Umdrehungen pro Minute. Unter diesen Bedingungen, P. aeruginosa Kulturen wird in der Regel erreichen eine Dichte von 5x10 9 KBE / ml. Wir verwenden P. aeruginosa Stamm PAO1 Durchführung der pSMC21 Plasmid für eine konstitutive Expression von GFP 6. </li><li> 1 ml der Bakterienkultur in ein steriles Reaktionsgefäß. Zentrifugation bei 6000 rpm für 3 min, und waschen Sie die bakterielle Pellet zweimal in 1 ml Medium Mikroskopie. </li><li> Verdünnen Sie 0,5 ml gewaschen und Bakterien in 4,5 ml Microscopy Medium auf eine Konzentration von ~ 5x10 8 CFU / ml zu erreichen. </li><li> Beobachtung von lebenden Zellenin Echtzeit erfordert ein bildgebendes Kammer gekoppelt mit einer Schlauchpumpe (um einen Fluss von Nährstoffen für längere Zeitspannen zu gewährleisten) und einen Temperaturregler. Wir nutzen die Bioptechs FCS2 (Focht Live-Cell) Kammer verbunden mit einem Low-Flow-Mikro-Perfusionspumpe mit 1 / 16 th C-flex Schlauch geschnitten, um entsprechende Längen und autoklaviert Sterilität, und über die FCS2 Kammer Controller Temperatur reguliert. Wir halten die Eingangsquelle des Mediums in einem 37 ° C Wasserbad befindet sich gleich neben dem Mikroskop. </li><li> Montieren Sie die Flusskammer. Die FCS2 Kammer enthält eine Selbsthemmung Basis (die sitzt auf der Bühne Adapter während der Bildgebung) und eine obere Hälfte mit dem Perfusionsschläuche und die Kammer-Controller. Die Kammer ist upside-down, bevor sie umgedreht montiert und platziert auf die Bühne Adapter. Halten Sie die obere Hälfte der Kammer auf den Kopf, so dass die Perfusionsschläuche sichtbar sind, und richten Sie die Durchgangslöcher einer 0,75-mm dicken Gummi-Dichtung auf die Perfusionsschläuche. Stapeln Sie die microaqueduct Schlitten mit der Kammer auf der Oberseite des Gummidichtung zur Verfügung, so dass die geriffelte Seite nach oben und legen Sie eine weitere Gummidichtung auf der Oberseite des Schlittens. Die Dicke und innere Geometrie der zweiten Dichtung bestimmen das Volumen der Kammer. Wir in der Regel mit einem 0,75-mm dicken Gummi-Dichtung mit einer 30-mm rund innere Geometrie arbeiten. </li><li> 1 ml der vorgewärmten (37 ° C) Mikroskopie Medium in den Mittelpunkt der Folie. </li><li> Abrufen einer 60-mm-Schale aus der Zellkultur-Inkubator, entfernen Sie das verbrauchte Medium und waschen Sie die Zellen einmal mit 3 ml vorgewärmten Microscopy Medium. Dieser Schritt sorgt für die Beseitigung der Phenolrot und Antibiotika in der Zelle vorhandene Wachstumsmedium. Phenolrot ist leicht fluoreszierend und können mit der Bildgebung stören, während Antibiotika P. ausrotten können aeruginosa Bakterien, bevor sie zu etablieren Biofilme können. </li><li> Mit Ethanol-gewaschen Pinzette, rufen Sie die Deckgläschen aus der Schüssel und senken Sie den Kopf auf die Perle der Mikroskopie Mediums auf die Kammer gelegt. Das Deckglas ruht sich jetzt auf der zweiten Gummidichtung und die Monoschicht von Atemwegszellen nach unten zeigt. </li><li> Halten Sie die montierten Komponenten in einer Hand, setzen Sie den Boden der Kammer auf der Oberseite des Stapels, und drehen Sie die Kammer über schnell, so dass alles wieder richtig herum. Verriegeln Sie die Basis in Position, indem Sie den Ring. </li><li> Schließen Sie das Zuleitungsrohr der Low-Flow-Mikro-Perfusionspumpe und starten Sie den Fluss mit einer Geschwindigkeit von 20 ml / h; dieser Durchfluss innerhalb der Schwimmgeschwindigkeit Fähigkeit P. aeruginosa. Ein zweites Stück Schlauch verbindet die Pumpe in einen Kolben der Mikroskopie Medium in der 37 ° C Wasserbad befindet sich gleich neben dem Mikroskop. </li><li> Bringen Sie sterile pre-cut 1 / 16 th C-Flex-Schlauch mit dem Einlass und Auslass Perfusionsschläuche der Kammer, schließen Sie die Temperaturregler, legen Sie dann die versammelten Kammer auf den Mikroskoptisch eines invertierten Fluoreszenzmikroskop. </li><li> Mit einer 1-ml-Einweg-Spritze die zuvor vorbereiteten Bakteriensuspension in die Kammer, mit einem Zwei-Wege-Ventil in-line zwischen der Pumpe und die Kammer gelegt. In unserem speziellen Einstellung, dauert es eine 0,6 ml Volumen Bakteriensuspension in die Kammer zu erreichen. Passen Sie dieses Volumen nach Ihren speziellen Schlauchlänge. Wir finden es auch nützlich, um eine in-line Einweg 0,22 um Filter zwischen der Pumpe und die Zwei-Wege-Ventil, um Bakterien aus den Strom schwimmen und eine Verunreinigung des Eingangs Kolben zu verhindern statt. </li><li> Um Bakterien, um die Atemwege Zellen legen, stoppen Sie die Pumpe für 2 Stunden. Die Strömung kann dann wieder begonnen werden und bei 20 ml / h für den Rest des Experiments. </li><li> Überwachen Sie die Integrität der Atemwege Zellen durch differentielle Interferenzkontrast (DIC) Mikroskopie während des Experiments, um auf Anzeichen von Schäden an der Monoschicht zu überprüfen. Gleichzeitig verfolgt die Entwicklung der GFP-markierten S. aeruginosa Biofilmen an der apikalen Oberfläche der Atemwege Zellen durch den Erwerb von Bildern mit einer invertierten konfokalen oder Weitwinkel-Fluoreszenz-Mikroskop. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse Wir verwenden ein Stamm von P. aeruginosa mit der pSMC21 Plasmid, das für die konstitutive Expression von GFP 6 ermöglicht. Aus diesem Grund können GFP-markierten Biofilme wachsen auf einem CFBE Monoschicht visualisiert werden Epifluoreszenzmikroskopie. Alternativ kann die Visualisierung der Biofilm durch Färbung unmarkiertem P. erreicht werden aeruginosa mit einer 1% Calcofluor weiß Lösung für 1 Stunde bei 37 ° C 1. Für die Bildgebung Biofilmbildung auf CFBE Zellen in den Fluss-Assay verwenden wir ein maßgeschneidertes Bühne Adapter, sondern mehrere Unternehmen bietet jetzt speziell ausgerüstete Bühne Adapter. Wir arbeiten mit einem Olympus IX70 inversen Mikroskop mit einem ORCA-AG Tiefkühlung CCD-Kamera und einem x60 Ölimmersionsobjektiv (numerische Apertur 1,40) ausgestattet. Der Filter wFerse ist mit einer 480/40 nm Bandpassfilter Anregungsfilter und ein 535/30 nm Bandpass-Emission-Filter ausgestattet. Digitale Bilder wurden mit der OpenLab 4.0.3 Software-Paket (Improvisation) erworben und Volumina wurden durch iterative Restauration mit der Volocity 3.5.1 Software (Improvisation) entfaltet. Quantitative Analyse von 3D-Biofilm-Strukturen wurde mit dem COMSTAT Bildanalyse-Software-Paket 7,8 erreicht. Für jede Co-Kultur-Modell betrachtet, muss man besonders auf die Zytotoxizität der Entwicklung zwischen den Komponenten des Modells zu zahlen. In sowohl statische als auch der Fluss-Zell-Assays, fanden wir, dass die CFBE Monoschicht konnte die Anwesenheit von P. standhalten aeruginosa für bis zu 8 Stunden nach der Impfung ohne Anzeichen von Veränderung. Epitheliale Monoschicht Integrität kann durch Phasenkontrast-Mikroskopie mit einem inversen Mikroskop 1 (Abbildung 1A) oder durch Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Mikroskopie während des gesamten Experiments mit 5 benotet werden. Im Laufe der Zeit, P. aeruginosa produzieren Toxine und Virulenzfaktoren, die und reichern sich die Epithelzellen Monoschicht vollständig oder in Teilen (Abbildung 1B-1C) Schaden. Zytotoxizität kann quantitativ beurteilt werden mit verschiedenen Kits zur Freisetzung von Lactat-Dehydrogenase (LDH) aus den Epithelzellen zu messen. LDH ist ein stabiles cytosolischen Enzym in das extrazelluläre Milieu auf Zell-Lyse oder Zelltod freigesetzt. Wenn die Integrität der Atemwege Monoschicht nicht beeinträchtigt wird (in der Regel für ~ 8 h nach der Impfung), P. aeruginosa Biofilmen kann erfolgreich zu gestalten und zu entwickeln an der apikalen Oberfläche der Atemwege Zellen in beiden Co-Kultur-Modelle beschrieben (Abb. 2A-2B). Nach 3D-Rekonstruktion (Abbildung 2C) und Quantifizierung kann Biomassenakkumulation genau bestimmt werden. Wir haben auch diese Co-Kultur Biofilmen in mehrere phänotypische Tests verwendet. Zum Beispiel, wie oben erwähnt, kann Biofilm CFU leicht durch Lyse der Epithelzellen bestimmt werden, seriell verdünnt das Lysat und Plattierung auf Agarplatten. Wir haben festgestellt, diese Technik vorteilhaft bei der Bestimmung der Beständigkeit von verschiedenen Stämmen auf antibiotische Behandlung. Darüber hinaus können Biofilm Toxizität gegenüber den Epithelzellen gemessen unter Verwendung kommerziell erhältlicher LDH Nachweis-Kits werden. Auf diese Weise kann die Rolle von Virulenzfaktoren in der Toxizität von Biofilmen zu beurteilen. Diese Modell-Systeme unterstützen auch eine Reihe von Gen-Expression-Anwendungen, einschließlich des Antragstellers Fusion Studien, RT-PCR und Microarray-Analyse 1,5,9. <img src="/files/ftp_upload/2186/2186fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Monolayer von CFBE Zellen und repräsentative Bilder kompromittiert und Atemwege Zellmonoschichten durch P. beschädigt aeruginosa Biofilm Wachstum. (A) Repräsentative Bild einer Monolayer von CFBE Zellen in Gewebekultur-Platten kultiviert, durch Phasenkontrast-Mikroskopie untersucht. Scale-bar, 120 um. (B) Beispiel eines kompromittierten CFBE Monoschicht. Auch wenn die Monoschicht nicht angezeigt offensichtlich sichtbare Beschädigungen noch, P. aeruginosa Bakterien gesehen Ausbreitung zwischen den Tight Junctions der Epithelzellen und Zugang zu den basolateralen Membranen. Biofilmbildung ist in der Regel nicht unter diesen Bedingungen aufgrund der sich verschlechternden Monoschicht erreicht. Scale-bar, 20 um. (C) Beispiel eines verwilderten P. aeruginosa Biofilm beobachtet 24 h nach der Inokulation. Nach der erfolgreichen Unterstützung Biofilmbildung wurde die CFBE Monoschicht irreparabel beschädigt und ist nun praktisch nicht vorhanden. Residual Biofilm wachsen als flache Schicht von Bakterien, wird gezeigt, Befestigung am Deckglas. Scale-bar, 20 um. <img src="/files/ftp_upload/2186/2186fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. P. aeruginosa Biofilmen an der apikalen Oberfläche von konfluenten CFBE Zellen unter Verwendung des Static Co-Kultur Biofilm-Modell und die Durchflusszelle Co-Kultur Biofilm-Modell entwickelt. (A) Repräsentative Bild eines GFP-exprimierenden P. aeruginosa Biofilm auf einem Monolayer von CFBE Zellen unter Verwendung des Static Co-Kultur Biofilm-Modell, durch Epifluoreszenzmikroskopie beurteilt gewachsen. Das Bild ist eine Überlagerung der Phasenkontrast-Kanal und die Fluoreszenz-Kanal. Scale-bar, 35 um. (B) Repräsentative Bild eines GFP-markierten S. aeruginosa Biofilm für 6 h auf einem Monolayer von CFBE Zellen unter Verwendung des Flow Cell Co-Kultur Biofilm-Modell entwickelt. Zur Erleichterung der Visualisierung der Atemwege Monolayer wurden Kerne mit 10 pg / mL Hoechst 33342 (Molecular Probes) für 30 min vor der Inokulation mit P. gebeizt aeruginosa. Zusammengeführt und pseudocolored Bilder wurden durch Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) betrachtet, und die entsprechenden fluoreszierenden Bilder angezeigt werden. Biofilme, präsentiert als grüne Klumpen an der apikalen Oberfläche der CFBE Zellen werden über die Atemwege Zellen verteilt. Scale-bar, 20 um. (C) Dreidimensionale RekonstruktionTION der z-Serie Bildstapel mit dem typischen pilzförmige Strukturen von 6 h-jährige P. aeruginosa Biofilmen bilden auf einer CFBE Zellmonolayer. Scale-bar, 10 pm.

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Biofilme sind Gemeinschaften von Bakterien, die in Reaktion auf Reize aus der Umwelt zu bilden. Diese Signale aus der Umwelt auf globaler regulatorischer Veränderungen innerhalb jedes Bakterium, wodurch die Bindung an eine Oberfläche, Aggregation, Herstellung von Exopolysaccharide und andere Phänotypen wie erhöhte Antibiotikaresistenz 10 führen. In den letzten paar Jahrzehnten hat viele Beweise der Hypothese, dass Biofilme eine große Rolle spielen in der Pathogenese der chronischen Infektionen unterstü...

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		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>FCS2 (Focht Live-Cell) chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bioptechs, Butler, PA</td>
<td>060319131616</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FCS2 chamber controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bioptechs, Butler, PA</td>
<td>060319-2-0303</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>40 mm glass coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bioptechs, Butler, PA</td>
<td>PH 40-1313-0319</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech, Manassass, VA</td>
<td>#10-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM without phenol red</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech, Manassass, VA</td>
<td>Mediatech, Manassass, VA</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

co-culture models of pseudomonas aeruginosa biofilms grown on live human airway cells

Bakterielle Biofilme sind mit einer Reihe von verschiedenen Krankheiten beim Menschen in Verbindung gebracht, aber Biofilm Entwicklung hat in der Regel auf nicht-lebenden Oberflächen untersucht. In diesem Papier beschreiben wir Protokolle zur Bildung Pseudomonas aeruginosa Biofilmen auf die menschliche Epithelzellen der Atemwege (CFBE Zellen) in Kultur gezüchtet. Bei der ersten Methode (der so genannten Static Co-Kultur Biofilm-Modell), P. aeruginosa ist mit CFBE Zellen Monolayers auf Standard-Zellkultur-Platten kultiviert inkubiert. Obwohl das Bakterium ist sehr giftig für Epithelzellen, die Zugabe von Arginin verzögert die Zerstörung der Monoschicht lange genug für Biofilme auf der CFBE Zellen bilden. Die zweite Methode (sog. Flow Cell Co-Kultur Biofilm Model), beinhaltet die Anpassung eines Biofilms Durchflusszelle Apparate, die oft in Biofilm-Forschung, wird ein Deckglas Unterstützung einer Monolayer von CFBE Zellen unterzubringen. Diese Monoschicht mit P. geimpft aeruginosa und eine peristaltische Pumpe fließt dann frisches Medium über die Zellen. In beiden Systemen bilden bakterielle Biofilme innerhalb von 6-8 Stunden nach der Impfung. Visualisierung des Biofilms wird durch die Verwendung von P. verbesserte aeruginosa-Stämme konstitutiv grün fluoreszierende Protein (GFP). Die statischen und Durchflusszelle Co-Kultur Biofilm-Assays sind Modellsysteme für die frühe P. aeruginosa-Infektion der Mukoviszidose (CF) Lunge, und diese Techniken ermöglichen unterschiedliche Aspekte der P. aeruginosa Biofilm-Bildung und Virulenz untersucht werden, einschließlich Biofilm Zytotoxizität, Messung von Biofilm CFU, und Färbung und Visualisierung der Biofilm.

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Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Dieses Papier beschreibt verschiedene Methoden der wachsenden<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Biofilme auf kultivierten menschlichen Epithelzellen der Atemwege. Diese Protokolle können an unterschiedliche Aspekte der Bildung von Biofilmen, einschließlich Visualisierung der Biofilm-Studie, Färbung des Biofilms, der Messung der Kolonie-bildenden Einheiten (KBE) des Biofilms und Studium Biofilm Zytotoxizität werden.

Co-Kultur Modelle Pseudomonas aeruginosa Biofilme auf lebenden menschlichen Zellen gezüchtet Airway

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

22.0K Aufrufe.  Dartmouth College. Dieses Papier beschreibt verschiedene Methoden der wachsenden Pseudomonas aeruginosa Biofilme auf kultivierten menschlichen Epithelzellen der Atemwege. Diese Protokolle können an unterschiedliche Aspekte der Bildung von Biofilmen, einschließlich Visualisierung der Biofilm-Studie, Färbung des Biofilms, der Messung der Kolonie-bildenden Einheiten (KBE) des Biofilms und Studium Biofilm Zytotoxizität werden.