Diese Arbeit wird durch die National Institutes of Health (NIH R01 AI46435) und die RMRCE (NIH AI065357) unterstützt.

Das folgende Protokoll ist für die Produktion und Verwendung eines ATS auf der Sindbisvirus MRE16 Basis geschrieben. Die ATS ist für GFP in der Mücke Aedes aegypti auszudrücken. cDNA-Klone Infectious einer Reihe von Alphaviren (Sindbis Virus, Chikungunya-Virus, O&#39;nyong-nyong Virus, West-Pferde-Enzephalitis-Virus) sind derzeit zur Verfügung, die als ATS (Tabelle 1) konzipiert. Für beste Ergebnisse Plasmid-DNA in Bakterien wie SURE kompetente Bakterien (Stratagene / Agilent Technologies), um unerwünschte Rekombination und Verlust der viralen cDNA vermeiden verstärkt. Alle infektiösen Klon Plasmide haben einen Bakteriophagen T7 oder SP6-Promotor in der unmittelbaren 5&#39;-Ende des viralen cDNA für die Transkription von full-length genomischen RNA und einem einzigartigen Restriktionsendonuklease am 3 &#39;Ende für Abfluss-Transkription. Für jeden ATS, müssen die Benutzer den entsprechenden Bakteriophagen-DNA abhängigen RNA-Polymerase und einzigartigen Restriktionsendonuklease für in vitro-Transkription der viralen RNA-Genom. 1. Generation of Infectious RNA aus cDNA Klonen. <ol><li> Linearisieren der 5μg der infektiösen Klon Plasmid (p5&#39;dsMRE16 / GFP) mit 20 Einheiten Restriktionsenzym XhoI in einer 100 ul-Reaktion. Inkubieren für 2-3h bei 37 ° C </li><li> Purify linearisierte DNA mittels Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit alternative Aufreinigungsprotokolls, eluting DNA aus Spin-Säule mit 50 ul RNase-freiem Wasser. Plasmid-Konzentration sollte etwa 1,0 ug / ul werden. </li><li> In ein RNase-freies 0,2 ml PCR-Röhrchen, Set-up mit 50 ul Transkriptionsreaktion mit Ambion MAXIscript Kit pro Protokoll wie folgt. <ul><li> 22,5 ul RNase-freies dH 2 O <ul><li> 5,0 ul linearisierte DNA-Template (1,0 ug / ul) </li><li> 2,5 ul 10 mM ATP </li><li> 2,5 ul 10 mM CTP </li><li> 2,5 ul 10 mM UTP </li><li> 2,5 ul 1 mM GTP </li><li> 2,5 ul 10 mM Kappe analog (m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) G) </li><li> 5,0 ul 10x Transkriptionspuffer </li><li> 5,0 ul T7-oder SP6-Polymerase-Mix </li></ul></li><li> 50,0 ul insgesamt </li></ul></li><li> Inkubieren Sie die Transkription für 1 Stunde bei 37 ° C. Nach der Inkubation sollte die Reaktion sofort für die Elektroporation von BHK-21 Zellen verwendet werden. Vorbereitung der BHK-21-Zellen für die Elektroporation sollte während der Inkubation Transkriptionsreaktion beginnen. </li></ol> 2. Erzeugung von Virus aus Infectious RNA <ol><li> Trypsinize zwei 70-80% konfluente 150 cm 2 (T-150) Kolben BHK-21 Zellen pro ATS. </li><li> Übertragen Sie alle Zellen in ein 15 ml konisches Zentrifugenröhrchen. </li><li> Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 2000 rpm, 10 min, 4 ° C in einer herkömmlichen Tischzentrifuge. </li><li> Die Zellen in sterilem PBS ohne Mg + + und Ca + +. Wiederholen Sie die Schritte 2,3 und 2,4, bis die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen. </li><li> Resuspendieren der pelletierten Zellen 0,5 ml MEM mit 10% FBS. </li><li> Verdünnen Sie 10 l-Zellen mit 90 ul MEM mit 10% FBS und zählen auf einem Hämacytometer. Falls notwendig, verdünnen Zellen 2,5-12,5 x 10 7 Zellen / ml mit MEM mit 10% FBS. </li><li> Um ein eiskaltes 0,2 cm Elektroporationsküvette, fügen Sie 400 ul Zellsuspension und 20 ul Transkriptionsreaktion. Wischen Kondensation von Küvette. </li><li> Pulse die Küvette zweimal: 450V, 1200Ω, 150 uF. Wir verwenden ein Electro Zellmanipulators, Harvard Apparatus Modell ECM630. </li><li> Platzieren Sie den gesamten Inhalt der Küvette in eine 25 cm 2 Zellkulturflasche mit 5 ml MEM mit 10% FBS. </li><li> Inkubieren Kolben (s) bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Überwachen Sie die Infektion täglich mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop mit geeigneten Filter-Set (zB GFP-Filter: Anregungswellenlänge = 460-490 nm, Emissionswellenlänge = 510-550 nm; oder dsRed Filter: Anregungswellenlänge = 460-560 nm, Emissionswellenlänge =&gt; 590 nm). </li><li> Als Fluoreszenz schlägt Infektion ist konfluent und / oder CPE ist sichtbar in den Kolben, sammeln die Inhalte der aufgefangen und mit 30% FBS, Aliquot wie nötig, und bei -80 ° C. Falls gewünscht, kann Zelllysate durch Zentrifugation geklärt werden (2000 rpm, 10 min, 4 ° C) vor der Zugabe von FBS. </li><li> Passage-Virus mindestens einmal durch eine neue Flasche von Zellen, die Virustiter für nachfolgende Blut Fütterung Assays zu erhöhen. </li></ol> 3. Per os Infektion der Mücken <ol><li> Mischen Blut (in der Regel gekauft de-fibrinated Schafblut) und Zellkultur-abgeleitete Virus Suspension aus Schritt 2.13. Finale Virustiter in der Blutmahlzeit in der Regel sollte ~ 1x10 7 Plaque-bildenden Einheiten (pfu) / mL für eine effiziente Infektion Mitteldarm der Mücke werden. Zur Stimulierung Mücken engorge, Adenosin-5&#39;-Triphosphat (ATP) kann bis zu einer Endkonzentration von 0,02 M hinzugefügt werden. </li><li> Mücken könnenhaben, um aus Wasser und Zucker entzogen werden vor der Infektion, um sie effizient Blut ernähren stimulieren aus einer künstlichen einlegen. Dauer des Entzugs sollte vorher festgelegt werden, um die Sterblichkeit zu minimieren. Die Zeiten werden auf Mückenarten, Feuchtigkeit der Insektarium etc. Als Ausgangspunkt ab, entfernen Sie Zucker und Wasser 24 Stunden 12h vor dem zu ernähren. Dieses Protokoll verwendet Wassermantel Glas feeders17 mit umlaufendem 37 ° C Wasser. Ein Schweine-Darm-Membran (dh gründlich gewaschen Wursthülle in den meisten Lebensmittelgeschäften) wird über den Mund des Zubringers und das Essen wird in die Kammer pipettiert platziert. Verschiedene Ausführungen, Membranen und Protokolle für verschiedene Vektor-Typen zur Verfügung. </li><li> Moskitos sind sortiert, um nur die Mücken mit Blut gefüllt wählen. Engorged Mücken sind ein Karton mit Organza auf der Spitze übertragen und die Mücken sind bei 28 ° C, 75-80% relative Luftfeuchtigkeit bis auf GFP-Expression verarbeitet. </li></ol> 4. Intrathorakale Inokulation von Mücken Intrathorakale Impfung ist eine alternative Methode zur Infektion der Arthropoden. Diese Methode wird verwendet, wenn die Verbreitung durch den Mitteldarm nicht erforderlich ist. (Methode beschrieben, aber die Technik ist noch nicht in diesem visuelles Experiment gezeigt). <ol><li> Eine kleine Anzahl von Mücken (5-10) ist aus dem Betrieb Käfige in Kunststoff Holding Rohre angesaugt. Die versiegelten hält Röhrchen bei 4 ° C für 15 min die Moskitos Chill auf. </li><li> 2 5 Moskitos aus der Tube auf eine Glas-Petrischale ruht auf Eis verschüttet werden. Setzen Sie den Deckel auf die Petrischale, wenn nicht in Gebrauch ist oder wenn Mücken zu bewegen beginnen. Während der Handhabung von Mücken, muss darauf geachtet werden, zu zählen und zu verfolgen die Zahl der Mücken manipuliert werden. Wie Mücken auf der Chill Tisch verschüttet werden, wird die Gesamtzahl auf dem Labortisch aufgezeichnet werden. </li><li> Die Nadel wird durch Schmelzen Kapillarrohr mit Nanoject spezifische Glas-und einer Nadel puller vorbereitet. </li><li> Richten Sie die Nanoject II Mikroinjektor pro Anweisungen des Herstellers für die Lieferung von 69 nL Inokulum. Vorsicht ist bei der Erstellung des Inokulums in die Nadel so, dass die Nadel nicht beschädigt wird. </li><li> Mit einem Binokular die Nadel in den Brustkorb von der Mücke und aktivieren Sie die Nanoject zur Impfung. Vorsicht ist bei der Impfung Mücken, so dass die Nadel nicht vollständig durchdringen die Mücke und Ausfahrt der anderen Seite, was in der anschließenden Tod der Mücke werden. Prüfen Sie jede Mücke sicher sein, dass das Inokulum, bevor es aus der Nadel eingetragen. </li><li> Nach der Impfung während der Mücke ist noch auf der Nadel aufgespießt, legen Sie es in einem Papier Holding Karton durch ein kleines Loch in die Seite, die mit Watte oder einem Korken zu allen anderen Zeiten angeschlossen ist. </li><li> Wenn die Mücken haben geimpft und in den Karton (bis zu ca. 50 pro Karton), sorgfältig Band der Korken in Ort, um ein unbeabsichtigtes Lösen der Mücken zu verhindern platziert. Legen Sie die Kartons in einen sicheren Halt bin vor einer weiteren Inkubation im Insektarium bei 28 ° C und 80% relativer Luftfeuchtigkeit. </li></ol> 5. Überwachung der Infektion der Mücken <ol><li> Legen Sie das Papier hält Karton bei 4 ° C für ca. 15 Minuten, um Mücken zu immobilisieren. </li><li> Übertragen einer kleinen Anzahl von Mücken (5-10 auf einmal) zu einem Chill-Tabelle für den Einsatz auf einem Fluoreszenz-Mikroskop angepasst. </li><li> Untersuchen und sortieren Mücken auf Vorhandensein oder Fehlen von Fluoreszenz. Darüber hinaus kann Fluoreszenzintensität als Proxy quantitative Messung der Infektion verwendet werden. Mosquito Geweben wie Mitteldärmen, Speicheldrüsen, können fetten Körper seziert und für die Fluoreszenz beobachtet werden. </li><li> Gegebenenfalls wieder gewählt Mücken auf Papier Karton zur Inkubation von infizierten Mücken weiter. </li></ol> 6. Transmission Assay (Forced Speichelfluss auf eine Übertragung des Virus zu demonstrieren) <ol><li> Entziehen Sie Mücken Zucker Quelle für 24 h vor zu füttern. </li><li> Entfernen Sie Beine und Flügel </li><li> Um eine 50 ul Kapillare, die erhitzt wurde, zog und schnitt an einem Ende, fügen Sie 3-5 ul der Cargille Typ B Immersionsöl oder 10% Serum-Saccharose-Lösung. </li><li> Legen Sie den Rüssel in die Röhre. Bei der Verwendung von Öl, wird Tröpfchen Speichel gesehen vom Rüssel ausstrahlen werden. Ein ul einer 1% igen pilocarbine Lösung in PBS und 0,1% Tween 80 kann auf den Thorax zu stimulieren angewendet werden. </li><li> Nach 60-90 Minuten, entfernen Mücken und speichern für die Virusisolierung, falls erforderlich. </li><li> Entfernen Sie aus dem Glas durch Zentrifugation in ein Röhrchen mit 100 ul 20% FBS-PBS. </li><li> Sterilfilter das Inokulum durch einen 0,2 um Spritzenfilter und verwenden Sie dann das gefilterte das Inokulum zu kultivierten Zellen zu infizieren. </li></ol> Biosafety Hinweis: Dieses Protokoll beschreibtein Verfahren zur Erzeugung, Identifizierung und Überwachung von infizierten Mücken. Basierend auf Ihren Einrichtungen (dh eine Chill-Tabelle, Containment-Anlage, etc.) und IBC Genehmigung, können Sie auf deren Prüfung erst nach Entfernen Flügel und Beine, um eine Flucht zu verhindern begrenzt werden. SINV-basierte ATS erzeugt und verwendet werden in einem BSL2 Umwelt. Der Einsatz von ATS ist auf anderen Alphaviren wie Chikungunya-Virus oder westlichen Pferdeenzephalitis-Viren basieren erfordert BSL3 Einrichtungen. 7. Repräsentative Ergebnisse Eine Übersicht der Expression eines Marker-Gen (GFP) mit dem ATS 5&#39;dsMRE16 / GFP ist in Abbildung 1 dargestellt. Expression von GFP in BHK-21 und C6/36 (Aedes albopictus)-Zellen ist in Abbildung 2 zu bestimmten Zeiten nach der Infektion von Zellen mit 5&#39;dsMRE16 / GFP-Virus bei 0,01 Multiplizität der Infektion gezeigt. Abbildung 3 gibt einen Überblick über Alphavirus und ATS-Virus-Infektion in der Mücke, wenn das Virus durch einen infektiösen Blutmahlzeit geliefert wird. Abbildung 4 zeigt die Herstellung einer Blutmahlzeit mit ~ 10 7 pfu / ml ATS-Virus durch orale Infektion von Aedes aegypti gefolgt. Ganzkörper-Ansicht von infizierten Mücken und ausgewählte Körperteile bei 10 Tagen nach der Infektion mit dem Epifluoreszenzmikroskop (Abbildung 5). Detektion von GFP und DsRed in Mitteldärmen von infizierten Mücken nach Infektion mit ATS 5&#39;dsMRE16 Viren Ausdruck jedes fluoreszierenden Markergen (Abbildung 6). Transmission Test unter Verwendung von Moskitos mit 5&#39;dsMRE16 / GFP ATS-Virus (Abbildung 7) infiziert. Tabelle 1. ATS ist derzeit für die Genexpression in Mücken entwickelt. <table border="1"><tbody><tr><td>&nbsp; Alphavirus </td><td> ATS </td><td> Mücke </td><td> Referenz </td></tr><tr><td> Sindbis Virus </td><td> TE / 3&#39;2J und TE / 5&#39;2J </td><td> Aedes aegypti </td><td> 12 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Ochlerotatus triseriatus </td><td> 13 </td></tr><tr><td></td><td> 3&#39;dsMRE16 und 5&#39;dsMRE16 </td><td> A. aegypti </td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Culex tritaeniorhynchus </td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td> 5&#39;dsTR339 </td><td> A. aeg ypti </td><td> 2 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chikungunya-Virus </td><td> 3&#39;dsCHIKV und 5&#39;dsCHIKV </td><td> A. aegypti / A. albopictus </td><td> 20 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> O&#39;nyong nyong Virus </td><td> 5&#39;dsONNV </td><td> Anopheles gambiae </td><td> 1,9 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Westlichen Pferde-Enzephalitis-Virus </td><td> 5&#39;dsWEEV. McMillan </td><td> Culex tarsalis </td><td> Stauft et al., Unveröffentlichte </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Vorteile / Nachteile der Verwendung von ATS ist für die Genexpression in Mücken. <table border="1"><tbody><tr><td> Vorteile: </td></tr><tr><td> Schnelle Herstellung von High-Titer-Virus </td></tr><tr><td> Breites Wirtsspektrum (SINV) </td></tr><tr><td> Hohe RNA-Replikation Rate </td></tr><tr><td> Hohe Transgenexpression Ebenen </td></tr><tr><td> Relative Leichtigkeit der Genmanipulation </td></tr><tr><td> Stabile, anhaltende Genexpression in Insekten </td></tr><tr><td> Minimal Pathologie in Insekten </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> Nachteile: </td></tr><tr><td> Kurzfristige Ausdruck Modus in Zellen von Wirbeltieren </td></tr><tr><td> Starke zytopathischen Wirkungen auf Zellen von Wirbeltieren </td></tr><tr><td> Gene Größenbeschränkungen (&lt;1 KB, im Idealfall) </td></tr><tr><td> Einige Alphaviren erfordern BSL3 Containment </td></tr></tbody></table><img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1: Übersicht über ATS Virus-Produktion in BHK-21 Zellen mit p5&#39;dsMRE / GFP SINV, die GFP. Nach in-vitro-Transkription ist die genomische ATS-RNA in BHK-21 Zellen, in denen Virus ist gerettet elektroporiert. Die ATS-Virus kann dann verwendet werden, um Mücken zu infizieren. SGP = subgenomische Promotor. Drei ATS RNA-Spezies sind in die cel transkribiertls, die genomische, subgenomische 1 und 2 subgenomische RNAs. C (Kapsid), E2-und E1-Glykoproteine ​​mit ATS Genom versammelt, um infektiöse Viren zu generieren. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2: Expression von GFP in Mücke (C6/36) Zellen nach Infektion mit SINV 5&#39;dsMRE16 / GFP-Virus. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3: Übersicht der ATS-Virus-Infektion in Mücken was zu Virusübertragung. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4: ATS SINV 5&#39;dsMRE16 Infektion durch Aussetzen Mücken zu einer infektiösen Blutmahlzeit. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5: ATS SINV 5&#39;dsMRE16 / GFP-Infektion bei 10 Tagen nach der Infektion. Die Ganzkörper-Detektion von GFP zeigt, dass Virus hat den Mitteldarm entkommen und verbreitet, um sekundäre Gewebe. Abbildung zeigt auch die GFP-Expression in ausgewählten Körperteile, die auch ein Hinweis auf eine disseminierte Infektion. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6: ATS SINV 5&#39;dsMRE16 / GFP und 5&#39;dsMRE16 / dsRED Infektion Mitteldärmen zu bestimmten Zeiten nach der Infektion. Mitteldärmen haben in der Regel deutliche Infektionsherde früh nach Einnahme einer Blutmahlzeit mit Viren, die in den hinteren Mitteldarm zu späteren Zeitpunkten nach der Infektion ausbreitet. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig7.jpg" alt="Abbildung 7" /> Abbildung 7: Erkennung von ATS 5&#39;dsMRE16 / GFP in Mücke Speichel bereits nach 8 Tagen nach der Infektion. Assay wurde entwickelt, um die Übertragung der ATS-Virus und zeigt, dass die 5&#39;dsMRE16 / GFP-Virus stabil exprimieren können GFP während der extrinsischen Inkubationszeit in der Mücke zu zeigen. Die linke Tafel zeigt eine Mücke salivating in ein Kapillarrohr, zeigt das Zentrum Panel C6/36 Zellen mit Speichel an 1 Tag und rechte Tafel 3 Tage nach der Infektion infiziert.

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+double+subgenomic+chikungunya+virus+infectious+clone+to+express+heterologous+genes+in+Aedes+aegypti+mosquitoes.">Development and characterization of a double subgenomic chikungunya virus infectious clone to express heterologous genes in Aedes aegypti mosquitoes.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 35, 1162-1162 (2005).</li><li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+inducing+or+inhibiting+apoptosis+on+Sindbis+virus+replication+in+mosquito+cells.">Effects of inducing or inhibiting apoptosis on Sindbis virus replication in mosquito cells.</a> J. Gen. Virol. 89, 2651-2651 (2008).</li></ol>

Die hier vorgestellten Methoden ermöglichen es den Forschern, um die Infektion eines Alphavirus in Mücke Zellkultur und die erwachsenen weiblichen Mücken folgen. Die Vor-und Nachteile der Verwendung von ATS-Viren sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Ein ATS infektiösen Klon kann genetisch manipuliert werden, um jede israelische Regierung zum Ausdruck bringen und wurden verwendet, um single chain Antikörper, Suppressoren von RNAi, Antisense-RNAs Targeting endogenen Gene und pro-apoptotische Proteine ​​zu exprimieren. Wenn ein Reporter nicht verwendet wird, dann ist die Bildgebung Teil dieser Methode ist nicht relevant. Allerdings sind viele der gleichen Protokolle, die für ATS-Virus zu retten, die Ausbreitung und Moskito-Infektion. Es gibt Einschränkungen in der maximalen Größe des Transgens, wenn sie in ein Alphavirus transduzierenden System eingefügt. Die Größenangaben variieren je nach der elterlichen Stammes verwendet, um die ATS zu generieren, sind aber in der Regel etwa 1kb obwohl größere Reportergene wie Glühwürmchen-Luciferase in Bau ATS für den Einsatz in Mücken verwendet worden sein. Forschungslabors mit einem bescheidenen Betrag der Virologie Hintergrund sollte in der Lage sein ATS folgenden Protokolle verwenden. Eine Reihe von Forschungslabors haben bereits so mit SINV-basierte ATS getan hat.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>27104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MAXIscript Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AB1312</td>
<td>Be sure to use a kit containing the appropriate polymerase for your construct.</td>
</tr>
<tr>
<td>Cap Analogue (m7G(5')ppp(5')G)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM8050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nanoject II nanoliter injector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond Scientific</td>
<td>3-000-204</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electro Cell Manipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>ECM 630</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

alphavirus transducing system:  tools for visualizing infection in mosquito vectors

Alphavirus transduzierenden Systeme (ATS) sind wichtige Werkzeuge zur Expression von Genen von Interesse (GOI) während der Infektion. ATS aus cDNA-Klone von Moskitos übertragene RNA-Viren (; Familie Togaviridae Gattung Alphavirus) abgeleitet. Die Alphavirus Gattung enthält etwa 30 verschiedene Moskitos übertragene Virusarten. Alphaviren sind umhüllte Viren und enthalten einsträngige RNA-Genome (~ 11,7 Kb). Alphaviren transkribieren ein subgenomische mRNA, dass die strukturellen Proteine ​​des Virus für die Enkapsidierung des Genoms und die Reifung des Virus erforderlich kodiert. Alphaviren sind in der Regel hoch lytische in Zellen von Wirbeltieren, aber beharrlich zu infizieren anfällig Stechmückenzellen mit minimalem Zytopathologie. Diese Eigenschaften machen sie zu ausgezeichneten Werkzeugen für die Genexpression in Moskito-Vektoren. Die häufigsten ATS in Verwendung sind aus Sindbis-Virus (SINV) abgeleitet. Die breite Arten Tropismus SINV ermöglicht Infektion von Insekten-, Vogel-und Säugetier-cells8. Allerdings haben ATS aus anderen Alphaviren sowie 9,10,20 abgeleitet. Ausländische Genexpression wird durch die Einfügung eines zusätzlichen viralen RNA subgenomische Initiationsstelle oder Promotor. ATS, in denen eine exogene Gen-Sequenz 5 &#39;positioniert ist, um das virale Strukturgene ist für einen stabilen Protein-Expression in Insekten eingesetzt. ATS, in denen eine Gensequenz 3 &#39;positioniert ist, um die strukturellen Gene, wird verwendet, um RNAi und Stille Expression dieses Gens in das Insekt auslösen. ATS haben sich als wertvolle Instrumente für das Verständnis der Vektor-Pathogen-Interaktionen, molekularen Details der viralen Replikation und Wartung infektiösen Zyklen 3,4,11,19,21 werden. Insbesondere hat der Ausdruck Fluoreszenz-und Biolumineszenz Reporter maßgeblich die Verfolgung der Virusinfektion in den Vektor und eine Übertragung des Virus 5,14-16,18. Darüber hinaus hat der Vektor Immunantwort beschrieben worden mit zwei Stämme von SINV entwickelt, um GFP 2,9 auszudrücken. Hier präsentieren wir eine Methode zur Herstellung von SINV mit einem fluoreszierenden Reporter (GFP) aus der cDNA-infektiösen Klon. Infektiöse, full-length-RNA wird aus den linearisierten cDNA-Klon transkribiert. Infektiöse RNA in permissive Zielzellen durch Elektroporation eingeführt. Transfizierten Zellen zu generieren infektiöse Viruspartikel Ausdruck der indischen Regierung. Geerntet Virus wird von Stechmücken, wie hier beschrieben, oder einem anderen Host Spezies (hier nicht dargestellt) zu infizieren. Vector Kompetenz wird durch den Nachweis Fluoreszenz außerhalb der Mitteldarm oder durch Überwachung Virusübertragung 7 bewertet. Die Verwendung eines fluoreszierenden Reporter als die indische Regierung ermöglicht eine komfortable Bestimmung des Virus verbreitete sich in einer Zellkultur, zur Bestimmung der Ausbreitung der Infektion, Verbreitung in exponierten Mücken, eine Übertragung des Virus von der Mücke und bietet eine schnelle Spur von Vektor-Kompetenz.

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Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Methoden für den Einsatz Alphavirus transduzierenden Systeme fluoreszierenden Reporter in vitro und in der Erwachsenenbildung Mücken Ausdruck beschrieben werden. Diese Technik kann an jede Protein von Interesse anstelle oder zusätzlich zu einem Reporter zu äußern.

Alphavirus transduzierenden System: Werkzeuge für die Visualisierung Infektion in Mosquito Vektoren

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

alphavirus-transducing-system-tools-for-visualizing-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.7K Aufrufe.  Colorado State University. Methoden für den Einsatz Alphavirus transduzierenden Systeme fluoreszierenden Reporter in vitro und in der Erwachsenenbildung Mücken Ausdruck beschrieben werden. Diese Technik kann an jede Protein von Interesse anstelle oder zusätzlich zu einem Reporter zu äußern.

Serie: Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

Ein Protokoll für die Erfassung und Färbung Blutzellen aus dem Gelbfiebermücke Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

Visualizing Dengue Virus durch Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac Transposon-System Modifikation von primären menschlichen T-Zellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Kultivierung Mikroglia aus dem Neugeborenen und Erwachsenen Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

The investigation of the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to understanding the pathogenic mechanisms of diseases caused by these organisms. Here we describe a procedure for protein extraction from Burkholderia species based on mechanical lysis using glass beads in the presence of ethylenediamine tetraacetic acid and phenylmethylsulfonyl fluoride in phosphate buffered saline. This method can be used for different Burkholderia species, for different growth conditions, and it is likely suitable for the use in proteomic studies of other bacteria. Following protein extraction, a two-dimensional (2-D) gel electrophoresis proteomic technique is described to study global changes in the proteomes of these organisms. This method consists of the separation of proteins according to their isoelectric point by isoelectric focusing in the first dimension, followed by separation on the basis of molecular weight by acrylamide gel electrophoresis in the second dimension. Visualization of separated proteins is carried out by silver staining.

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Members of the Burkholderia genus are pathogens of clinical importance. We describe a method for total bacterial protein extraction, using mechanical disruption, and 2-D gel electrophoresis for subsequent proteomic analysis.

Gesamtproteinextraktion und 2-D Gelelektrophorese-Methoden für<em&gt; Burkholderia</em&gt; Arten

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

Eine einfache und effiziente Methode zu konstruieren Mutant Vacciniavirusvektoren

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Visualisierung der Auswirkungen von Sputum auf Biofilm-Entwicklung eines Modells mit Kammerdeckgläser

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability to role and adhere to the endothelial layer. Visualization of circulating cells by injection of fluorescent dyes or fluorophore-coupled antibodies is commonly used. Alternatively, fluorescent reporter mice can be used. Interactions of leukocytes, in particular lysozyme M+ (LysM+) monocytes, with the vessel wall play pivotal roles in promoting vascular dysfunction and arterial hypertension. We here present the technique to visualize and quantify leukocyte rolling and adhesion in carotid arteries in angiotensin II (AngII)-induced hypertension in mice by IVM.
The implantation of a catheter damages the vascular wall and leads to altered blood cell responses. We compared different injection techniques and administration routes to visualize leukocytes in a LysMCre+IRG+ mouse with widespread expression of red fluorescent protein and conditional expression of green fluorescent protein in LysM+ cells. To study LysM+ cell activation, we used AngII infused mice in which rolling and adhesion of leukocytes to the endothelium is increased. We either injected acridine orange using a jugular catheter or directly though the tail vein and compared the amount of rolling and adhering cells. We found that jugular catheter implantation per se increased the number of rolling and adhering LysM+ cells in sham-infused LysMCre+IRG+ mice compared to controls. This activation was augmented in AngII-infused mice. Interestingly, injecting acridine orange directly through the tail vein did not increase LysM+ cell adhesion or rolling in sham-infused mice. We thereby demonstrated the importance of transgenic reporter mice expressing fluorescent proteins to not interfere with in vivo processes during experimentation. Furthermore, tail vein injection of fluorescent tracers might be a possible alternative to jugular catheter injections.

This manuscript describes the use of transgenic reporter mice and different administration routes of fluorescent dyes in angiotensin II-induced hypertension using intravital video microscopy of blood vessels to evaluate the activation of immune cells and their ability to roll and adhere to the endothelium.

Visualisierung von Leukozyten Rollen und Haftung bei Angiotensin II-infundiert Mäusen: Techniken und Fallstricke

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.

Generierung von rekombinanten aviären Herpesvirus Vektoren mit CRISPR/Cas9 gen bearbeiten

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of UTI in male and female mice have illustrated the procedures for bacterial inoculation and enumeration in urine and tissues. During an initial bladder infection in C57BL/6 mice, UPEC establish latent reservoirs inside bladder epithelial cells that persist following clearance of UPEC bacteriuria. This model builds on these studies to examine rUTI caused by the emergence of UPEC from within latent bladder reservoirs. The urogenital bacterium Gardnerella vaginalis is used as the trigger of rUTI in this model because it is frequently present in the urogenital tracts of women, especially in the context of vaginal dysbiosis that has been associated with UTI. In addition, a method for in situ bladder fixation followed by scanning electron microscopy (SEM) analysis of bladder tissue is also described, with potential application to other studies involving the bladder.

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

A mouse model of uropathogenic E. coli (UPEC) transurethral inoculation to establish latent intracellular bladder reservoirs and subsequent bladder exposure to G. vaginalis to induce recurrent UPEC UTI is demonstrated. Also demonstrated are the enumeration of bacteria, urine cytology, and in situ bladder fixation and processing for scanning electron microscopy.

Rezidivierende Escherichia coli Harnwegsinfektion, ausgelöst durch Gardnerella vaginalis Blasenexposition bei Mäusen

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...