この作品は、国立衛生研究所（NIH R01 AI46435）とRMRCE（NIH AI065357）によってサポートされています。

次のプロトコルは、シンドビスウイルスMRE16に基づいてATSの生産と使用のために書かれています。 ATSは蚊ベクトルネッタイシマカでGFPを発現するように設計されています。アルファウイルスの数のcDNA感染クローン（シンドビスウイルス、チクングニヤウイルス、O&#39;nyong -寧ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス）は、ATSの（表1）として設計されている現在利用可能です。最良の結果を得るにはプラスミドDNAは、ウイルスcDNAの不要な再結合と損失を回避するために、そのようなSURE有能な細菌などのバクテリア（Stratagene社/アジレントテクノロジー）で増幅される。すべての感染性クローンのプラスミドは、流出の転写のために最後の即時の5&#39;3の全長ゲノムRNAとユニークな制限エンドヌクレアーゼの転写のためのウイルスcDNAの終わり&quot;で、バクテリオファージT7またはSP6プロモーターを持っている。それぞれのATSの場合、ユーザーは適切なバクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼとウイルスRNAゲノムのin vitro転写のためのユニークな制限エンドヌクレアーゼを使用する必要があります。 1。 cDNAクローンから感染性RNAの生成。 <ol><li> 100μL反応におけるXhoI制限酵素20単位の（p5&#39;dsMRE16 / GFP）プラスミド感染性クローンの5μgを線形化する。 37 2 - 3時間インキュベート° C </li><li> 50μLのRNaseフリー水を用いてスピンカラムからDNAを溶出する、キアゲンQIAprep Spin Miniprepキット代替精製プロトコールを用いて線状化DNAを精製する。プラスミドの濃度は約1.0μg/μLのはずです。 </li><li> RNaseフリーの0.2 mLをPCRチューブに、プロトコルごとにアンビオンMAXIscriptキットを用いて50μLの転写反応は以下のようなセットアップ。 <ul><li> 22.5μLRNaseフリーのdH 2 O <ul><li> 5.0μL線形DNAのテンプレート（1.0μg/μLの） </li><li> 2.5μL10mMのATP </li><li> 2.5μL10mMのCTP </li><li> 2.5μL10mMのUTP </li><li> 2.5μL1mMのGTP </li><li> 2.5μL10mMのキャップアナログ（M 7 G（5&#39;）pppは（5&#39;）G） </li><li> 5.0μL10X転写バッファー</li><li> 5.0μLT7またはSP6ポリメラーゼミックス</li></ul></li><li> 50.0μL合計</li></ul></li><li> 37℃で1時間転写反応をインキュベート℃にインキュベーション後、反応はBHK - 21細胞のエレクトロポレーションのために直ちに使用する必要があります。エレクトロポレーションのためのBHK - 21細胞の調製は、インキュベーションの転写反応の間に開始する必要があります。 </li></ol> 2。感染性RNAからウイルスの世代<ol><li>コンフルエント150センチメートル2（T - 150）ATSあたりフラスコBHK - 21細胞two 70〜80％をトリプシン処理。 </li><li> 15 mLのコニカル遠心チューブにすべてのセルを転送します。 </li><li> 2000rpmで遠心分離によってペレットは、細胞、10分、一般的な卓上遠心機で4℃。 </li><li>滅菌PBSで再懸濁し、細胞マグネシウムなし+ +とCa + +。細胞をPBSで3回洗浄されるまで、手順2.3と2.4を繰り返します。 </li><li> 10％FBSを含むペレット化した細胞を0.5mLのMEMを再懸濁します。 </li><li> 10％FBSを90μLMEMで10μLの細胞を希釈し、血球計でカウント。もしMEM、10％FBSを含むと2.5〜12.5 × 10 7細胞/ mLのに必要な、希薄な細胞。 </li><li>氷冷0.2センチメートルのエレクトロポレーションキュベットに、400μLの細胞懸濁液および20μLの転写反応を追加。キュベットから結露を拭いてください。 </li><li>二回キュベットをパルス：450V、1200Ω、150μFを。我々は、電気セルのマニピュレータ、ハーバード装置モデルECM630を使用してください。 </li><li> 10％FBSを5mLのMEMを含む25cm 2の組織培養フラスコにキュベットの内容全体を配置。 </li><li> 5％CO 2で37℃でインキュベートフラスコ（秒）。 </li><li>日常の感染症を監視する適切なフィルターセット（例えば、GFPフィルター付倒立蛍光顕微鏡を使用して：励起波長= 460〜490 nmの発光波長= 510〜550 nmの、またはDsRedフィルター：励起波長= 460〜560 nmの発光波長=&gt; 590nmで）。 </li><li>蛍光は、感染がコンフルエントと/またはCPEはフラスコ全体で表示されているであることを示唆する場合は、-80必要な、そしてストアとして、アリコートを、フラスコの内容を収集する30パーセントFBSを追加℃に必要に応じて、細胞溶解物を遠心分離（2000 rpm、10分、4℃）により、FBSを添加する前にクリアすることができます。 </li><li>少なくとも一回の細胞の新しいフラスコを通過するには、ウイルス、後続の吸血アッセイのためのウイルスの力価を増加させる。 </li></ol> （3）蚊のOS感染あたり <ol><li>血液（通常はデfibrinated羊の血を購入）し、ステップ2.13からの細胞培養由来のウイルス懸濁液を一緒に混ぜる。血液の食事の最後のウイルス力価は、一般的に蚊の効率的な腸の感染症のために〜1 × 10 7プラーク形成単位（PFU）/ mLのはずです。 、満腹にさせる5&#39; -三リン酸（ATP）をアデノシンに蚊を刺激する0.02Mの最終濃度まで添加することができます。 </li><li>蚊年5月人工フィーダから効率的に血液の供給にそれらを刺激するために感染する前に水と砂糖を奪われなければならない。剥奪の期間は、以前は死亡率を最小限にするために確立されるべきである。タイムズ紙は、蚊の種、出発点として、昆虫館等の湿度に依存する前のフィードへの砂糖の24時間と水の12Hを削除します。このプロトコルは、循環37℃の水で水ジャケット付きガラスfeeders17を使用しています。ブタ腸管膜は（つまり、徹底的にほとんどの食料品店で入手可能なケーシングソーセージを洗浄）フィーダーの口の上に配置されており、食事は、チャンバー内にピペットで入れる。様々なデザイン、膜およびプロトコルは、さまざまなベクトル型に対して利用可能です。 </li><li>蚊が血で充血だけ蚊を選択するためにソートされます。充血した蚊は、上にオーガンジーで箱に転送され、蚊は28℃でインキュベートされる° C、75〜80パーセントの相対湿度GFPの発現のために処理されるまで。 </li></ol> 4。蚊の胸腔内接種胸腔内接種は節足動物に感染するための代替方法です。腸を介して普及が必要とされていないときに、このメソッドが使用されます。 （方法は以下に説明するが、技術はこの視覚実験で示されていません）。 <ol><li>蚊（5-10）の少数は、プラスチック製の保持チューブに保持するケージから吸引される。 15分は蚊を冷却する為、℃でのために密封された保持管を4に配置されます。 </li><li> 2 5蚊は、氷の上で休んでガラスのペトリ皿の上にチューブから流出される。使用していない場合や、蚊が移動し始める時にペトリ皿にふたをし。蚊の取り扱い時には、注意が操作されている蚊の数のトラックをカウントし、維持するために注意しなければなりません。蚊が寒さのテーブルの上にこぼしたされているように、合計数は、実験室のカウンターに記録されます。 </li><li>針はNanoject特定のガラスと針のプラーを使用してキャピラリーチューブを融解することによって調製される。 </li><li> 69 NL接種の配信については、製造元の指示に従ってNanoject IIマイクロインジェクターを設定します。針が破損していないように針に接種を描画するときに注意が必要です。 </li><li>解剖顕微鏡を使って、蚊の胸部に針を挿入して、接種のためのNanojectをアクティブにします。針が完全に蚊に浸透し、蚊のそれに続く死に至る、反対側を終了しないように蚊を接種するときは注意が必要。接種材料は、針から取り外す前に入ったことを確認するために、各蚊を確認してください。 </li><li>蚊がまだ針にimpaledている間に接種した後、、他のすべての時間で、綿やコルク栓で接続されている側の小さな穴を通して紙持株カートンに入れてください。 </li><li>蚊は、蚊の偶発的な放出を防止するために設けられている、テープコルクを慎重に、（最大約50カートンごとに）カートンに接種し、配置しているときに。 28 ° Cおよび80％相対湿度での昆虫館でさらにインキュベーションの前に安全な保持ビンでカートンを置きます。 </li></ol> 5。蚊のモニタリング感染<ol><li> ° Cで約15分間蚊を固定するために4で紙保持カートンを置きます。 </li><li>蛍光顕微鏡での使用に適合チルのテーブルに蚊の数が少ない（一度に5-10）転送する。 </li><li>蛍光の有無に基づいて、蚊を調べて、並べ替える。さらに、蛍光強度は、感染のプロキシ定量的な測定として使用することができる。このようなmidguts、唾液腺などの蚊の組織、脂肪体は、蛍光のために切開し、監視することができます。 </li><li>適切な場合、感染した蚊のインキュベーションを継続する紙のカートンに選択された蚊を返します。 </li></ol> 6。伝送アッセイ（ウイルス伝播のデモを強制唾液分泌） <ol><li>供給する前に24時間糖源の蚊を奪う。 </li><li>脚と翼を削除する</li><li>一方の端で、加熱引っ張らとsnippedされて50μLキャピラリーチューブに、CargilleタイプBのイマージョンオイルまたは10％血清糖溶液の3〜5μLを加える。 </li><li>チューブに口吻を挿入します。オイルを使用している場合は、唾液の滴が口吻からしみ出さに見られます。 1％のpilocarbineのPBS中の溶液および0.1％ツイーン80の一つμLを刺激するために胸部に適用することができます。 </li><li> 60〜90分後、蚊を削除し、必要に応じてウイルス分離のための店。 </li><li> 100μLの20％FBS - PBSを含むチューブで遠心してチューブから溶液を除去。 </li><li>その後、滅菌フィルター0.2μmのシリンジフィルターを介して接種し、培養細胞に感染するフィルタリング接種を使用してください。 </li></ol> 生物学的安全性の注意：このプロトコルは、説明します、生成、識別、および感染した蚊を監視するための方法。あなたの施設（チルのテーブル、すなわち、封じ込め施設、等）とIBCの承認に基づいて、あなたはたったの脱出を防ぐために、翼と脚を除去した後、それらを検査するために制限されることがあります。 SINVベースのATSのが生成され、BSL2環境で使用することができます。このようなチクングンヤ熱ウイルスや西部ウマ脳炎ウイルスのような他のアルファウイルスに基づいて、ATSのの使用は、BSL3施設が必要になります。 7。代表的な結果 ATS 5&#39;dsMRE16 / GFPを用いてマーカー遺伝子（GFP）の発現の概要を図1に示されています。 BHK - 21およびC6/36（ ヒトスジシマカ ）の細胞でGFPの発現は、感染の0.01多重度で5&#39;dsMRE16 / GFPウイルスによる細胞の感染後に特定のタイミングで、図2に示されています。図3は、ウイルスが感染血液の食事を介して配信されている蚊のアルファウイルスとATSウイルス感染の概要です。図4は、 ネッタイシマカの経口感染が続くATSのウイルスの〜10 7 PFU / mLの血液の食事の準備を示しています。感染した蚊と落射蛍光顕微鏡（図5）を使用して10日後に感染症で、選択された身体部分の全身のビュー。 GFPの検出および各蛍光マーカー遺伝子（図6）を発現するATS 5&#39;dsMRE16ウイルス感染後、感染した蚊のmidgutsにDsRedタンパク質。 5&#39;dsMRE16 / GFP ATSウイルス（図7）に感染した蚊を使って送信アッセイ。 表1。ATSは現在、蚊の遺伝子発現のために設計されている。 <table border="1"><tbody><tr><td>&nbsp; アルファウイルス </td><td> ATS </td><td> 蚊 </td><td> リファレンス </td></tr><tr><td>シンドビスウイルス</td><td> TE / 3&#39;2JとTE / 5&#39;2J </td><td> ネッタイシマカ </td><td> 12 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Ochlerotatus triseriatus </td><td> 13 </td></tr><tr><td></td><td> 3&#39;dsMRE16と 5&#39;dsMRE16 </td><td> A.ネッタイシマカ </td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> コガタアカイエカ </td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td> 5&#39;dsTR339 </td><td> A. AEG ypti </td><td> 2 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>チクングンヤ熱ウイルス</td><td> 3&#39;dsCHIKVと 5&#39;dsCHIKV </td><td> A.ネッタイシマカ/ A.ヒトスジシマカ </td><td> 20 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> O&#39;nyong寧ウイルス</td><td> 5&#39;dsONNV </td><td> ハマダラカ </td><td> 1,9 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>西部ウマ脳炎ウイルス</td><td> 5&#39;dsWEEV。マクミラン</td><td> アカイエカ瞼板 </td><td> Stauft ら 、未発表</td></tr></tbody></table> 表2。蚊の遺伝子発現のためにATSのを使用してのメリット/デメリット。 <table border="1"><tbody><tr><td> 利点： </td></tr><tr><td>高力価のウイルスの急速な生産</td></tr><tr><td>広い宿主範囲（SINV） </td></tr><tr><td>高いRNA複製率</td></tr><tr><td>高い導入遺伝子の発現レベル</td></tr><tr><td>操作する遺伝子の相対的な容易さ</td></tr><tr><td>昆虫の安定した、持続的な遺伝子発現</td></tr><tr><td>昆虫の最小限の病理学</td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> 短所： </td></tr><tr><td>脊椎動物細胞における短期的な表現のモード</td></tr><tr><td>脊椎動物細胞に強い細胞変性効果</td></tr><tr><td>遺伝子の大きさの制限（&lt;1KB、理想的に） </td></tr><tr><td>いくつかのアルファウイルスはBSL3の封じ込めが必要です</td></tr></tbody></table><img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig1.jpg" alt="図1" /> 図1：p5&#39;dsMRE / GFP SINV表現GFPを用いたBHK - 21細胞におけるATSのウイルスの生産の概要。 in vitro転写に続いて、ゲノムATS RNAは、ウイルスが救助されたBHK - 21細胞に電気穿孔されています。 ATSのウイルスは、蚊に感染するために使用することができます。 SGPは=サブゲノムプロモーター。三ATS RNA種がセルに転写さLS、ゲノム、サブゲノム1とサブゲノム2 RNAを。 C（カプシド）、E2とE1糖蛋白質が感染性ウイルスを生成するためにATSゲノムが組み込まれます。 <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig2.jpg" alt="図2" /> 図2：SINV 5&#39;dsMRE16 / GFPウイルス感染後蚊におけるGFPの発現（C6/36）細胞。 <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig3.jpg" alt="図3" /> 図3：ウイルス感染につながる蚊におけるATSのウイルス感染の概要。 <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig4.jpg" alt="図4" /> 図4：感染性の血液の食事に蚊を公開することによって、ATS SINV 5&#39;dsMRE16感染。 <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig5.jpg" alt="図5" /> 図5：10日後に感染症でATS SINV 5&#39;dsMRE16 / GFP感染。 GFPの全身の検出は、そのウイルスが中腸をエスケープして二次的組織に散在していることを示しています。図には、また播種性感染の指標となる選択された体の部分でGFPの発現を示しています。 <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig6.jpg" alt="図6" /> 図6：ATS SINV 5&#39;dsMRE16 / GFPと5&#39;dsMRE16 /特定の時間後感染でmidgutsのDsRedの感染。 Midgutsは通常、後の時代に、感染後に後部中腸全体に広がるウイルスを含む血液の食事を摂取後早期の感染症の明確な焦点を持っている。 <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig7.jpg" alt="図7" /> 図7：8日、感染後早ければATS 5&#39;dsMRE16 /蚊唾液中のGFPの検出。アッセイは、ATSのウイルスの感染と5&#39;dsMRE16 / GFPウイルスは安定的に蚊の外因性の潜伏期間を通じてGFPを発現できることを示して表示するように設計されています。左側のパネルには、キャピラリーチューブによだれ蚊を示し、中央のパネルは、1日と右側のパネル3日後の感染で唾液で感染C6/36細胞を示しています。

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利害の衝突は宣言されません。

メソッドは、研究者は蚊細胞培養と大人のメス蚊のアルファウイルスの感染に従うことを可能にするここで紹介。 ATSのウイルスを使用しての長所と短所を表2にまとめた。 ATS感染性クローンは、遺伝的にどんなGOIを表現するために操作することができますし、一本鎖抗体、RNAiの抑制、内因性遺伝子を標的とするアンチセンスRNA、およびアポトーシスタンパク質を発現するために使用されています。レポーターが使用されていない場合、このメソッドの撮像部は関係ありません。しかし、同じプロトコルの多くは、ATSのウイルスの救助、伝播、および蚊の感染に必要です。アルファウイルス形質導入システムに挿入する際の制限が導入遺伝子の最大サイズがあります。サイズの制約は、ATSを生成するために使用される親株によって異なりますが、そのようなホタルルシフェラーゼのような大規模なレポーター遺伝子は、蚊で使用するためにATSを構築するために使用されているものの、約1KB通常です。ウイルス学の背景の適度な量の研究室では、ATSのこれらのプロトコルに従って使用することができるはずです。研究室の数はすでにSINVベースのATSのを使用してのことです。

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		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>27104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MAXIscript Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AB1312</td>
<td>Be sure to use a kit containing the appropriate polymerase for your construct.</td>
</tr>
<tr>
<td>Cap Analogue (m7G(5')ppp(5')G)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM8050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nanoject II nanoliter injector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond Scientific</td>
<td>3-000-204</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electro Cell Manipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>ECM 630</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

alphavirus transducing system:  tools for visualizing infection in mosquito vectors

アルファウイルス形質導入システム（ATS）は、感染時に関心のある遺伝子（GOI）を発現するための重要なツールです。 ATSSは蚊媒介性RNAウイルスのcDNAクローン（;トガウイルス科属のアルファウイルス ）から導出されます。 アルファウイルス属には約30の異なる蚊が媒介するウイルス種が含まれています。アルファウイルスは、エンベロープウイルスであり、一本鎖RNAゲノムを（〜11.7 KB）が含まれています。アルファウイルスは、ウイルスのゲノムと成熟のキャプシド形成に必要なウイルスの構造タンパク質をコードサブゲノムmRNAを転写。アルファウイルスは脊椎動物細胞では通常非常に溶解性であるが、持続的に最小限の細胞病理学に影響を受けやすい蚊の細胞に感染。これらの属性は、それらの蚊の遺伝子発現のための優れたツールとして利用できます。使用中の最も一般的なATSSは、シンドビスウイルス（SINV）から導出されます。 SINVの広範な種指向性は、昆虫鳥類、および哺乳類cells8の感染が可能になります。しかし、ATSSはよく9,10,20のような他のアルファウイルスに由来している。外来遺伝子の発現は、追加のウイルスのサブゲノムRNAの開始部位やプロモーターの挿入によって実現されています。外来遺伝子の配列はウイルス構造遺伝子の5&#39;側に配置されているATSSは昆虫で安定したタンパク質発現のために使用されます。遺伝子配列が構造遺伝子の3&#39;側に配置されているATSSは、RNAiと沈黙昆虫におけるその遺伝子の発現をトリガするために使用されます。 ATSSはベクトル-病原体相互作用、ウイルス複製の分子の詳細とメンテナンス感染サイクル3,4,11,19,21を理解するための貴重なツールであることが証明されている。特に、蛍光と生物発光レポーターの発現は、ベクターとウイルス伝送5,14-16,18でウイルス感染を追跡尽力している。さらに、ベクトル免疫応答は、GFP 2,9を表現するために設計さSINVの二系統を用いて記述されています。 ここで、我々はcDNAの感染性クローンから蛍光レポーター（GFP）を含むSINVの製造方法を示す。伝染性、完全長のRNAは、線形化されたcDNAクローンから転写される。感染性RNAをエレクトロポレーションによって許容標的細胞に導入する。トランスフェクションされた細胞は、GOIを発現している感染性ウイルス粒子を生成する。収穫されたウイルスは、ここで説明する蚊、、または他のホストの種を（ここでは図示せず）に感染するために使用されます。ベクトルの能力は、中腸外蛍光を検出することにより、または監視のウイルスの伝達7によって評価される。 GOIは、感染率の決定のために、細胞培養全体に広がるウイルスの便利な推定、露出蚊の普及、蚊からのウイルスの伝達を可能にするとベクトルの能力の急速なゲージを提供するので、蛍光レポーターを使用してください。

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Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

in vitroおよび成虫の蛍光レポーターを表現するアルファウイルス形質導入システムを使用するための方法が説明されています。このテクニックは、の代わりに、またはレポーターに加えて、関心の任意のタンパク質を発現するように適合させることができる。

アルファウイルス形質導入システム：蚊で感染を可視化するためのツール

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

alphavirus-transducing-system-tools-for-visualizing-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.7K ビュー.  Colorado State University. in vitroおよび成虫の蛍光レポーターを表現するアルファウイルス形質導入システムを使用するための方法が説明されています。このテクニックは、の代わりに、またはレポーターに加えて、関心の任意のタンパク質を発現するように適合させることができる。

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Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the up- and down-regulation of gene expression rely on the transfection of stably maintained plasmids. While these have increased our understanding of Entamoeba virulence factors, the capacity to integrate exogenous DNA into genome, which would allow reverse genetics experiments, would be a significant advantage in the study of this parasite. The challenges presented by this organism include inability to select for homologous recombination events and difficulty to cure episomal plasmid DNA from transfected trophozoites. The later results in a high background of exogenous DNA, a major problem in the identification of trophozoites in which a bona fide genomic integration event has occurred. We report the development of a negative selection system based upon transgenic expression of a yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyl transferase chimera (FCU1) and selection with prodrug 5-fluorocytosine (5-FC). The FCU1 enzyme converts non-toxic 5-FC into toxic 5-fluorouracil and 5-fluorouridine-5'-monophosphate. E. histolytica lines expressing FCU1 were found to be 30 fold more sensitive to the prodrug compared to the control strain.

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

We report development of a negative selection system in E. histolytica based upon transgenic expression of a chimeric protein (FCU1) and selection with the prodrug 5-fluorocytosine. The FCU1 protein is a fusion of yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyltransferase. Expression of FCU1 resulted in increased E. histolytica sensitivity towards 5-fluorocytosine.

のための負の選択マーカーの開発赤痢アメーバ</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

免疫・感染学

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

のAlexa Fluor ®標識を通じてデング熱ウイルスの可視化

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

プライマリーヒトT細胞のpiggyBacトランスポゾンシステムの変更

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

新生児と大人の中枢神経系から培養ミクログリア

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

The investigation of the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to understanding the pathogenic mechanisms of diseases caused by these organisms. Here we describe a procedure for protein extraction from Burkholderia species based on mechanical lysis using glass beads in the presence of ethylenediamine tetraacetic acid and phenylmethylsulfonyl fluoride in phosphate buffered saline. This method can be used for different Burkholderia species, for different growth conditions, and it is likely suitable for the use in proteomic studies of other bacteria. Following protein extraction, a two-dimensional (2-D) gel electrophoresis proteomic technique is described to study global changes in the proteomes of these organisms. This method consists of the separation of proteins according to their isoelectric point by isoelectric focusing in the first dimension, followed by separation on the basis of molecular weight by acrylamide gel electrophoresis in the second dimension. Visualization of separated proteins is carried out by silver staining.

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Members of the Burkholderia genus are pathogens of clinical importance. We describe a method for total bacterial protein extraction, using mechanical disruption, and 2-D gel electrophoresis for subsequent proteomic analysis.

全タンパク質の抽出および2次元ゲル電気泳動法のための<em&gt;バークホルデリア</em&gt;種

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

突然変異体ワクシニアウイルスベクターを構築するためのシンプルで効率的なアプローチ

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

チェンカバーガラスモデルを用いたバイオフィルム開発に関する痰の効果を可視化

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability to role and adhere to the endothelial layer. Visualization of circulating cells by injection of fluorescent dyes or fluorophore-coupled antibodies is commonly used. Alternatively, fluorescent reporter mice can be used. Interactions of leukocytes, in particular lysozyme M+ (LysM+) monocytes, with the vessel wall play pivotal roles in promoting vascular dysfunction and arterial hypertension. We here present the technique to visualize and quantify leukocyte rolling and adhesion in carotid arteries in angiotensin II (AngII)-induced hypertension in mice by IVM.
The implantation of a catheter damages the vascular wall and leads to altered blood cell responses. We compared different injection techniques and administration routes to visualize leukocytes in a LysMCre+IRG+ mouse with widespread expression of red fluorescent protein and conditional expression of green fluorescent protein in LysM+ cells. To study LysM+ cell activation, we used AngII infused mice in which rolling and adhesion of leukocytes to the endothelium is increased. We either injected acridine orange using a jugular catheter or directly though the tail vein and compared the amount of rolling and adhering cells. We found that jugular catheter implantation per se increased the number of rolling and adhering LysM+ cells in sham-infused LysMCre+IRG+ mice compared to controls. This activation was augmented in AngII-infused mice. Interestingly, injecting acridine orange directly through the tail vein did not increase LysM+ cell adhesion or rolling in sham-infused mice. We thereby demonstrated the importance of transgenic reporter mice expressing fluorescent proteins to not interfere with in vivo processes during experimentation. Furthermore, tail vein injection of fluorescent tracers might be a possible alternative to jugular catheter injections.

This manuscript describes the use of transgenic reporter mice and different administration routes of fluorescent dyes in angiotensin II-induced hypertension using intravital video microscopy of blood vessels to evaluate the activation of immune cells and their ability to roll and adhere to the endothelium.

白血球ローリングとアンジオテンシン II に注入されたマウスにおける付着の可視化: 技術と落とし穴

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.

CRISPR/Cas9 組換え鳥ヘルペス ウイルスのベクトルを生成する遺伝子の編集

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has a broad spectrum of applications. Detection of antigens allows for characterization and identification of multiple cell types. Located above the kidneys and encapsulated by a layer of mesenchymal cells, the adrenal gland is an endocrine organ composed by two different tissues with different embryological origins, the mesonephric intermediate mesoderm-derived outer cortex and the neural crest-derived inner medulla. The adrenal cortex secretes steroids (i.e., mineralocorticoids, glucocorticoids, sex hormones), whereas the adrenal medulla produces catecholamines (i.e., adrenaline, noradrenaline). While conducting adrenal research, it is important to be able to distinguish unique cells with different functions. Here we provide a protocol developed in our laboratory that describes a series of sequential steps required for obtaining immunofluorescence staining to characterize the cell types of the adrenal gland. We focus first on the dissection of the mouse adrenal glands, the microscopic removal of periadrenal fat followed by the fixation, processing and paraffin embedding of the tissue. We then describe sectioning of the tissue blocks with a rotary microtome. Lastly, we detail a protocol for immunofluorescent staining of adrenal glands that we have developed to minimize both non-specific antibody binding and autofluorescence in order to achieve an optimal signal.

Here we present a method to isolate adrenal glands from mice, fix the tissues, section them, and perform immunofluorescence staining.

分離、固定およびマウス副腎の蛍光イメージング

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

アルファウイルス形質導入システム：蚊で感染を可視化するためのツール

要約

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のための負の選択マーカーの開発赤痢アメーバ

のAlexa Fluor ®標識を通じてデング熱ウイルスの可視化

プライマリーヒトT細胞のpiggyBacトランスポゾンシステムの変更

新生児と大人の中枢神経系から培養ミクログリア

全タンパク質の抽出および2次元ゲル電気泳動法のための

突然変異体ワクシニアウイルスベクターを構築するためのシンプルで効率的なアプローチ

チェンカバーガラスモデルを用いたバイオフィルム開発に関する痰の効果を可視化

白血球ローリングとアンジオテンシン II に注入されたマウスにおける付着の可視化: 技術と落とし穴

CRISPR/Cas9 組換え鳥ヘルペスウイルスのベクトルを生成する遺伝子の編集

分離、固定およびマウス副腎の蛍光イメージング

アルファウイルス形質導入システム：蚊で感染を可視化するためのツール

要約

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のAlexa Fluor ®標識を通じてデング熱ウイルスの可視化

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突然変異体ワクシニアウイルスベクターを構築するためのシンプルで効率的なアプローチ

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白血球ローリングとアンジオテンシン II に注入されたマウスにおける付着の可視化: 技術と落とし穴

CRISPR/Cas9 組換え鳥ヘルペス ウイルスのベクトルを生成する遺伝子の編集

分離、固定およびマウス副腎の蛍光イメージング

CRISPR/Cas9 組換え鳥ヘルペスウイルスのベクトルを生成する遺伝子の編集