Wir danken für die wichtigen Beiträge der Drs. John Anderson, Andrew Main und Shirley Tirrell zu dieser Studie. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus dem Centers for Disease Control and Prevention (U50/CCU116806-01-1) und dem US Department of Agriculture (58-6615-1-218, CONH00768 und CONH00773) unterstützt.

1. Mosquito Sortierung und Identifikation <ol><li> Die folgenden Verfahren basieren auf einer offenen Labortisch in einem dedizierten Biosicherheitsstufe-2 (BSL-2) im Labor von Mitarbeitern, die geschult, damit zu leben Mücken Arbeit durchgeführt werden. A &quot;Kühlkette&quot; ist während des gesamten Verfahrens beibehalten. </li><li> Anesthetize leben Stechmücken, indem Mücke Auffangbeutel in einem -20 ° Gefrierschrank für 5 Minuten. Transfer-Auffangbeutel mit einem isolierten Behälter mit Trockeneis. Schließen Sie den Deckel und setzen Mücken zu Kohlendioxid für 1-3 Minuten, um sicherzustellen, komplette knock-down. </li><li> Tippen Sie auf narkotisierten Mücken auf eine vorgekühlte Pfanne auf einem Bett aus Trockeneis gelegt. Trennen Sie einzelne weiblichen Mücken mit feinen Pinzetten und in Kunststoff Portionsbecher. Deckel mit Deckel und legen Tassen auf nassem Eis. </li><li> Identifizieren Mücken-Spezies unter Verwendung beschreibender taxonomische Tasten auf externen Mücke Morphologie mit Hilfe eines Stereo-Binokular (10-60fach Zoom) basieren, montiert auf einer elektronischen Chill Tisch. </li><li> Kombinieren Sie identifiziert Mückenarten in Pools von ≤ 50 Personen in 2 mL Schnappdeckelgläser mit einer Kupfer-BB. Vials sind mit einer eindeutigen Kennung versehen. </li><li> Nach der Identifizierung aller Mücken sind Fläschchen in beschrifteten Tüten gelegt und in einem Styropor-Kühler mit Trockeneis. </li><li> Shop Moskito-Pools in einem -80 ° C Gefrierschrank bis Virustestverfahren. </li></ol> 2. Biosafety Überlegungen Virus von Stechmücken zu isolieren <ol><li> Die folgenden Verfahren werden in einer Biosicherheitsstufe-3 (BSL-3) im Labor von Personal, das geschult, um auf dieser Ebene der Eindämmung 1 Arbeitsplatz durchgeführt werden. Laboreinrichtungen, Anlagen, Verfahren und Praktiken unterliegen institutionellen, Landes-und Bundesebene die Beaufsichtigung und Inspektion. Suchen Sie die entsprechende Ausbildung und Genehmigung, bevor die folgenden Protokolle. </li><li> Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) für jedes Verfahren wie Einweg-Kittel, Handschuhe, Gesichtsmasken und Atemschutzmasken. </li><li> Desinfizieren Sie Arbeitsflächen mit 70% igem Alkohol vor und nach Abschluss Verfahren. </li><li> Zellkulturen und potenziell infektiösem Material sind in der Klasse II Biosicherheitswerkbank (BSC) behandelt. </li><li> Mosquito-Pools sind in einem Mixer-Mühle, die innerhalb einer BSC gelegt wird homogenisiert. </li><li> Mosquito Homogenate werden in einem aerosoldicht Mikrozentrifuge zentrifugiert. Wenn dieses Verfahren nicht innerhalb einer BSC durchgeführt werden, sollte der Betreiber ein Atemschutzgerät getragen werden, wenn Betriebs-und Abrufen von Proben aus der Zentrifuge. </li><li> Pipetten und Pipettenspitzen Umgang mit Material in der BSC (Biosicherheitswerkbank) sind in 10% Bleiche vor dem Autoklavieren getränkt. Alle Labor-Abfälle werden durch Autoklavieren vor der Entsorgung dekontaminiert werden. </li></ol> 3. Vorbereitung von Vero-Zellen <ol><li> Dekantieren Kulturmedien von einer großen Zellkulturflasche (175 cm 2) der konfluenten Vero-Zellen (Klon E6) in das Abwasser Becherglas mit Bleichmittel. </li><li> Wash Vero-Zellen durch Zugabe einer 5 mL Aliquot PBS und wirbeln über Schicht von Zellen und entlang der Seiten des Kolbens achten Sie darauf, gründlich abdecken gesamten Monoschicht. </li><li> Dekantieren PBS in das Abwasser Becher. </li><li> Fügen Sie 2,5 ml Trypsin-EDTA und wirbeln über Schicht von Zellen und achten Sie darauf gründlich abdecken gesamten Monoschicht. </li><li> Inkubieren Kolben in Inkubator für 5 Minuten bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Schütteln und wirbeln Kolben, um Zellen von unten Oberfläche zu entfernen. Die Zellen sollten abrutschen leicht; inkubieren eine zusätzliche 1-5 Minuten, wenn die Zellen nicht leicht gleiten Sie aus. </li><li> 5 ml Minimal Essential Media (MEM), 5% fötalem Rinderserum (FBS), mit einer serologischen Pipette und pipettieren up-and-down 10-20 mal zum Aufbrechen der Klumpen von Zellen. </li><li> Hinzufügen eines zusätzlichen 15 mL MEM, 5% FBS mit einem Gesamtvolumen von 22,5 ml und gut mischen. </li><li> Platz 40 kleine Zellkulturflaschen (25 cm 2) aufrecht in zwei Racks (20 Flaschen / Rack). </li><li> Legen Sie die Racks mit Flaschen in der Biosicherheitswerkbank und entfernen Kolben Mützen, Kappen Platzierung direkt vor der Flaschen. </li><li> Dispense 4 ml MEM, 5% FBS in jeder Flasche mit einer serologischen Pipette. </li><li> Dispense 0,5 ml suspendierten Zellen in jedem Kolben (~ 1.06 Teilungsverhältnis) Ersetzen Kolben caps. </li><li> 50 ml MEM, 5% FBS wieder auf den ursprünglichen großen Zellkulturflasche mit den restlichen Zellsuspension (~ 2,5 ml) und zurück Kolben in den Inkubator. Das gleiche große Zellkulturflasche kann bis zu 5 Passagen wieder verwendet und dann eine neue Flasche sollte so eingestellt, dass sie zu ersetzen. </li><li> Legen Sie kleine Zellkulturflaschen in Stapeln auf Tablett. Swirl das Fach, um sicherzustellen, dass die Medien gleichmäßig bedeckt den Boden des Flaks. </li><li> Legen Sie kleine Flaschen in den Brutschrank bei 37 ° C, 5% CO 2 und wachsen, bis 80-90% konfluent Nacht. </li></ol> 4. Vorbereitung der Moskito-Pools <ol><li> Keep Moskito-Pools kalt während Testverfahren. Verwenden Sie vorgekühlteGefriergestelle und Mixer-Mühle Kassetten, eiskalten Reagenzien und einer Kühlzentrifuge bei der Verarbeitung von Moskito-Pools. </li><li> Die Röhrchen mit Moskitos in eine vorgekühlte Gefrierschrank Rack und fügen 1 bis 1,5 mL PBS-G in jedes Röhrchen von Mücken. </li><li> Abrufen Mixer-Mühle Kassetten aus der Tiefkühltruhe. Platz 24 Röhren in jeder Kassette und dann sicher in der Mixer-Mühle. </li><li> Homogenisieren die Proben für 4 min bei 25 Zyklen / Sekunde. Die Schwingmühle schüttelt die Rohre mit hoher Geschwindigkeit und einem Metall BB Inneren jeder Röhre stört die Mücke Gewebe. </li><li> Zentrifugenröhrchen für 6 Minuten bei 7.000 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Die Röhrchen wieder in Gefriergestelle bis in Vero-Zellen geimpft. </li></ol> 5. Inokulation von Vero-Zellen mit Moskito-Pool Homogenaten <ol><li> Prüfen Sie mindestens eine Zellkulturflasche aus jeder Serie unter inversen Mikroskop angemessene Konfluenz und Zell-Gesundheit zu gewährleisten; erwarten etwa 80-90% Deckung. </li><li> Line up 20 kleine Zellkulturflaschen in einem Rack-und Label-Kolben mit entsprechenden Zugangsnummern aus jeder Mücke Pool. </li><li> Lösen Kappen und dekantieren die meisten Medien aus Zellkulturflaschen in Abfällen Becher. Lassen Sie genügend Medien in den Kolben vollständig Mantel Zellmonolayer. </li><li> Aliquot 100 &amp;mgr; Überstand aus jeder verarbeiteten Moskito-Pool in die entsprechende Zellkulturflasche. </li><li> Ersetzen Sie und ziehen Sie Kulturflasche Kappe. </li><li> Lay Kulturflaschen flach auf Schüttler für 5 Minuten (Raumtemperatur) bei 35-40 min. </li><li> Rendite 20 Zellkulturflaschen in die aufrechte Position im Rack und in die BSC. </li><li> Entdecklungsmesser 3 Zellkulturflaschen zu einer Zeit, zu verzichten 4 mL Wachstum Medien in jeder Flasche mit einer serologischen Pipette ersetzen caps. </li><li> Achten Sie darauf, dass die Pipettenspitze nicht in Kontakt mit der Kulturflasche Nacken oder auf die Lippe. Ändern Pipettenspitzen als notwendig, wenn Kontakt mit dem Kolben hergestellt wird. </li><li> Inkubieren Zellkulturflaschen bei 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> 6. Screening Vero-Zellen für Viruswachstum <ol><li> Bildschirm geimpft Zellkulturflaschen Anzeichen für eine virale Infektion, zytopathischen Effekts (CPE), 3 bis 7 Tage nach der Impfung. </li><li> Sichtprüfung Zellkulturen für CPE und / oder Verschmutzung durch Kippen des Flakons und der Prüfung der Medien, die Pools im Boden des Kolbens. Die Medien erscheint trüb wie die Zellen während der CPE verschlechtern oder durch das Wachstum von Hefe-, Pilz-oder Bakterienbefall. </li><li> Erneut zu prüfen, Zellkulturen, die trüb Medien zeigen unter einem inversen Mikroskop. Viren verursacht Zellen zu verformen und wird losbrechen von den Kulturflaschen. Zellkulturen mit sichtbaren Verunreinigungen, z. B. Hefe, andere Bakterien, Pilze oder schwere Mücke Trümmer sind, indem die ursprüngliche Moskito-Pool durch einen 0,22 &amp;mgr; m Spritzenfilter erneut getestet. </li><li> Aseptischen Bedingungen verzichten 1-2 ml Medium aus virus-positiven Zellkulturen in etikettierte Kryoröhrchen mit einer serologischen Pipette. </li><li> Virus Kulturen werden bei -80 ° C bis identifiziert mit den entsprechenden diagnostischen Tests. </li></ol> 7. Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> MEM, 5% FBS. Lösen 37,6 g Pulver MEM in einem Gesamtvolumen von 4 l dd H 2 0. Dispense-Lösung in 500 mL Aliquots in Medien Flaschen und Autoklaven. Als Lösung abgekühlt ist, aseptisch hinzufügen 26 ml hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, 5,2 mL L-Glutamin, 5,2 mL anti-biotic/mycotic, und 10,4 ml 7,5% Natriumbicarbonat auf jeder Flasche. Lagerung bei 4 ° C. </li><li> PBS-G. Lösen Sie 16 g NaCl, 0,4 g KCl, 2,3 g Na 2 HPO 4, 0,4 g KH 2 PO 4 und 4 ml 0,5% Phenolrot in 1000 mL dd H 2 0. Der pH-Wert auf 7,1-7,4 mit 2 N NaOH (falls erforderlich). In einem separaten Becherglas, Wärme 600 ml H 2 0 zum Kochen bringen. Remove from hot-Platte, 10 g Gelatine, und lösen. Add gelöste Gelatine Lösung für die PBS-Lösung und passen Endvolumen bis 2 L mit dd H 2 O. Jeweils 100 mL der Lösung in Flaschen und Autoklaven. Als Lösung abgekühlt ist, aseptisch hinzufügen 42,8 ml hitzeinaktiviertem Kaninchenserum und 1,4 mL anti-biotic/mycotic. Lagerung bei 4 ° C. </li><li> PBS Zelle zu waschen. Dann werden 50 ml 10x Dulbecco PBS auf 400 ml dd H 2 O. Der pH-Wert auf 7,1 mit 2 N NaOH. Passen Endvolumen von 500 mL mit dd H 2 O. Filter-Lösung mit 0.2uM Vakuum Filtereinheit. Dispense in 5 ml Aliquots in 8 ml mit Schraubverschluss Röhrchen. Lagerung bei 4 ° C. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse Neun verschiedene Viren aus 4 taxonomische Familien wurden von Mücken im laufenden landesweiten Überwachung in Connecticut 1997-2010 (Tabelle 1) gesammelt und verwertet. Fünf dieser Viren sind bekannt für die menschliche Krankheit, die wichtigsten Krankheitserreger West-Nil-Virus und östlichen Pferde-Enzephalitis-Virus verursacht. Neue Entdeckungen sind: die erste Isolierung von WNV aus Stechmücken gesammelt inNordamerika in 1999 2, die erste Trennung von Potosi Virus in Nordosten der USA im Jahr 2000 3, und die erste Trennung von La Crosse Virus in New England im Jahr 2005 4. <table border="1"><tbody><tr><td> Virus </td><td> Familie </td><td> No-Isolate </td><td> Nr. Standorten </td><td> Nein Jahren gemessen </td><td> Krankheit beim Menschen </td><td> Refs. </td></tr><tr><td> West-Nil-Virus </td><td> Flaviviridae </td><td> 1.002 </td><td> 94 </td><td> 12 </td><td> Mittelschwere bis schwere, Fieber, Enzephalitis </td><td> 2,5 </td></tr><tr><td> Eastern equine-Enzephalitis-Virus </td><td> Togaviridae </td><td> 292 </td><td> 41 </td><td> 10 </td><td> Schwere, Enzephalitis </td><td> 6,7 </td></tr><tr><td> Highlands J-Virus </td><td> Togaviridae </td><td> 178 </td><td> 39 </td><td> 11 </td><td> Nicht bekannt </td><td> 6 </td></tr><tr><td> Jamestown Canyon-Virus </td><td> Bunyaviridae </td><td> 305 </td><td> 74 </td><td> 14 </td><td> Leichte bis moderate, Fieber, Meningitis </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Potosi Virus </td><td> Bunyaviridae </td><td> 259 </td><td> 76 </td><td> 4 </td><td> Nicht bekannt </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Cache Valley-Virus </td><td> Bunyaviridae </td><td> 114 </td><td> 51 </td><td> 8 </td><td> Leichte bis schwere, Fieber, neurologische Erkrankung in zwei dokumentierte Fälle </td><td></td></tr><tr><td> Trivittatus Virus </td><td> Bunyaviridae </td><td> 83 </td><td> 21 </td><td> 11 </td><td> Nicht bekannt </td><td></td></tr><tr><td> La Crosse Virus </td><td> Bunyaviridae </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> Mittelschwere bis schwere, Enzephalitis </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Flandern-Virus </td><td> Rhabdoviridae </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 2 </td><td> Nicht bekannt </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Viren in Feld-gesammelt Mücken durch Vero-Zellkultur-Test nachgewiesen. Moskitos waren während der landesweiten Überwachung in Connecticut from 1997-2010 gesammelt.

<ol>
	<li>Chosewood, L. C., Wilson, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , (2007).</li><li>Anderson, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+West+Nile+virus+from+mosquitoes,+crows,+and+a+Cooper's+hawk+in+Connecticut.">Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper's hawk in Connecticut.</a> Science. 286, 2331-2333 (1999).</li><li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolations+of+Potosi+virus+from+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae)+collected+in+Connecticut.">Isolations of Potosi virus from mosquitoes (Diptera: Culicidae) collected in Connecticut.</a> J Med Entomol. 42, 875-881 (2005).</li><li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+genetic+variant+of+La+Crosse+virus+(Bunyaviridae)+isolated+from+New+England.">A new genetic variant of La Crosse virus (Bunyaviridae) isolated from New England.</a> Am J Trop Med Hyg. 75, 491-496 (2006).</li><li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Vossbrinck, C. R., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+West+Nile+virus+in+Connecticut,+USA:+a+five+year+analysis+of+mosquito+data+1999-2003.">Epidemiology of West Nile virus in Connecticut, USA: a five year analysis of mosquito data 1999-2003.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 4, 360-378 (2004).</li><li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Tirrell-Peck, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+isolations+of+eastern+equine+encephalitis+and+highlands+J+viruses+from+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae)+during+a+1996+epizootic+in+southeastern+Connecticut.">Multiple isolations of eastern equine encephalitis and highlands J viruses from mosquitoes (Diptera: Culicidae) during a 1996 epizootic in southeastern Connecticut.</a> J Med Entomol. 35, 296-302 (1998).</li><li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eastern+equine+encephalitis+virus+in+mosquitoes+and+their+role+as+bridge+vectors.">Eastern equine encephalitis virus in mosquitoes and their role as bridge vectors.</a> Emerg Infect Dis. 16, 1869-1874 (2010).</li><li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Armstrong, P. M., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolations+of+Jamestown+Canyon+virus+(Bunyaviridae:+Orthobunyavirus)+from+field-collected+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae)+in+Connecticut,+USA:+a+ten-year+analysis,+1997-2006.">Isolations of Jamestown Canyon virus (Bunyaviridae: Orthobunyavirus) from field-collected mosquitoes (Diptera: Culicidae) in Connecticut, USA: a ten-year analysis, 1997-2006.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 8, 175-188 (2008).</li><li>Beaty, B. J., Calisher, C. H., Shope, R., Lennette, E. H., Lennette, D. A., Lennette, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11.">Chapter 11.</a> Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial, and Chlamydial Infections. , 189-212 (1995).</li><li>Karabatsos, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> International Catalogue of Arboviruses Including Certain Other Viruses of Vertebrates. , (1985).</li><li>Lanciotti, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+west+nile+virus+from+human+clinical+specimens,+field-collected+mosquitoes,+and+avian+samples+by+a+TaqMan+reverse+transcriptase-PCR+assay.">Rapid detection of west nile virus from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay.</a> J Clin Microbiol. 38, 4066-4071 (2000).</li><li>Lambert, A. J., Martin, D. A., Lanciotti, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+North+American+eastern+and+western+equine+encephalitis+viruses+by+nucleic+acid+amplification+assays.">Detection of North American eastern and western equine encephalitis viruses by nucleic acid amplification assays.</a> J Clin Microbiol. 41, 379-385 (2003).</li></ol>

Vero-Zellkultur-Assay dient als eine effektive Methode zur Dynprofeld-Mücken gesammelt für eine Vielzahl von Viren. Dies steht im Gegensatz zu molekularen Methoden, die gezielt eine oder einige wenige Viren von Interesse. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass Vero-Zellkultur-Assay gleich ist, wenn nicht empfindlicher als RT-PCR 7 und versorgt uns mit Virusisolate, dass in unserer Referenz-Sammlung für zukünftige Studien gespeichert werden. Dennoch kann Zellkultur-Systeme nicht angemessen in vielen ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenz / Ausrüstung </th><th> Firma </th><th> Catalog Number </th></tr><tr><td> Rinderfötenserum </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 16140 </td></tr><tr><td> Anti-biotic/mycotic </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 15240 </td></tr><tr><td> Natriumbicarbonat NaHCO 3, 7,5% Soln. </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 25080 </td></tr><tr><td> L-Glutamin 200 mM 100x </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 25030 </td></tr><tr><td> Pulverförmige minimal essential medium (MEM) </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 11700 </td></tr><tr><td> 10X Dulbecco PBS </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 14080 </td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 15400 </td></tr><tr><td> Kaninchenserum </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 16120 </td></tr><tr><td> Vero-Zellen (Klon E6) </td><td> ATCC </td><td> CRL-1586 </td></tr><tr><td> Kleine Zellkulturflaschen, belüftete Kappen, 25 cm 2 </td><td> Falcon - Becton Dickinson </td><td> 353112 </td></tr><tr><td> Große Zellkulturflaschen, belüftete Kappen, 175 cm 2 </td><td> Falcon - Becton Dickinson </td><td> 353108 </td></tr><tr><td> Verkupferter BB, 4,5 mm </td><td> Crosman </td><td> 0767 </td></tr><tr><td> Schwingmühle </td><td> Retsch </td><td> MM300 </td></tr><tr><td> Isopack Gefriergestelle </td><td> Eppendorf </td><td> 022510240 </td></tr></tbody></table>

detection of infectious virus from field-collected mosquitoes by vero cell culture assay

Mücken übertragen eine Reihe von unterschiedlichen Viren, einschließlich wichtiger menschlicher Krankheitserreger wie West-Nil-Virus, Dengue-Virus, und chickungunya Virus. Viele dieser Viren haben in ihrer endemischen Bereichen intensiviert und ausgebaut, um neue Gebiete, erfordern eine effiziente Überwachung und Steuerung Programme, um diese Bedrohungen zu reagieren. Eine Strategie zur Virus-Aktivität zu überwachen ist das Sammeln von einer großen Anzahl von Moskitos aus endemischen Standorte und testen sie für die virale Infektion. In diesem Artikel beschreiben wir, wie in der Handhabung, Verarbeitung und Display Mücken auf infektiöses Virus von Vero-Zellkultur-Assay-Feld-gesammelt. Mücken werden durch trap Lage und Arten sortiert, gruppiert und in Pools mit ≤ 50 Personen. Pooled Proben werden in Kochsalzlösung mit einem Mixer-Mühle und die wässrige Phase auf konfluente Vero-Zellkulturen (Clone E6) inokuliert homogenisiert. Die Zellkulturen werden für zytopathischen Wirkung vom Tage 3-7 post-Impfung und keine Viren in der Zellkultur gezüchtet durch die entsprechenden diagnostischen Tests identifiziert werden überwacht. Durch die Verwendung dieses Ansatzes haben wir 9 verschiedene Viren aus Moskitos in Connecticut, USA gesammelt isoliert, und unter diesen, 5 ist bekannt, dass Menschen eine Krankheit verursachen. Drei von diesen Viren (West-Nil-Virus, Potosi Virus und La Crosse-Virus) stellen neue Rekorde für Nordamerika oder der New England Region seit 1999. Die Fähigkeit, eine breite Vielfalt von Viren zu erkennen ist entscheidend für die Überwachung sowohl etablierte als auch neu auftretende Viren in der Mücke Bevölkerung.

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Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Wir beschreiben eine Methode zur Prozess-und Screen-Bereich gesammelt Mücken für eine Vielzahl von Viren durch Vero-Zellkultur-Assay. Durch den Einsatz dieser Technik haben wir 9 verschiedene Viren aus 4 taxonomische Familien erkannt in Mücken in Connecticut gesammelt.

Nachweis von infektiösen Viren aus Field-gesammelt Moskitos von Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

detection-infectious-virus-from-field-collected-mosquitoes-vero-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.3K Aufrufe.  The Connecticut Agricultural Experiment Station. Wir beschreiben eine Methode zur Prozess-und Screen-Bereich gesammelt Mücken für eine Vielzahl von Viren durch Vero-Zellkultur-Assay. Durch den Einsatz dieser Technik haben wir 9 verschiedene Viren aus 4 taxonomische Familien erkannt in Mücken in Connecticut gesammelt.

Serie: Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that express fluorescent fusion proteins have enabled real-time visualization of transport and spread of alphaherpes virus infection of neurons. The utility of novel fluorescent fusion proteins to viral membrane, tegument, and capsids, in conjunction with live cell imaging, identified viral particle assemblies undergoing transport within axons. Similar tools have been successfully employed for analyses of cell-cell spread of viral particles to quantify the number and diversity of virions transmitted between cells. Importantly, the techniques of live cell imaging of anterograde transport and spread produce a wealth of information including particle transport velocities, distributions of particles, and temporal analyses of protein localization. Alongside classical viral genetic techniques, these methodologies have provided critical insights into important mechanistic questions. In this article we describe in detail the imaging methods that were developed to answer basic questions of alphaherpes virus transport and spread.

Live cell imaging of alphaherpes virus infections enables analysis of the dynamic events of directed transport and intercellular spread. Here, we present methodologies that utilize recombinant viral strains expressing fluorescent fusion proteins to facilitate visualization of viral assemblies during infection of primary neurons.

Live Cell Imaging von Alphaherpes Virus Anterograde Transport und Aufstrich

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

Organoide als Modell für Infektionskrankheiten: Kultur von humanen und murinen Magen Organoide und Mikroinjektion von Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Zika Virus Infectious Zellkultursystem und die<em&gt; In Vitro</em&gt; Prophylaktische Wirkung von Interferonen

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

Rettung und Charakterisierung des rekombinanten Virus aus einer neuen Welt Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Schnelle, sichere und einfache manuelle am Krankenbett Nukleinsäure-Extraktion für den Nachweis des Virus in Vollblut-Proben

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

Ein Ex-Vivo Huhn Primärkultur Bursitis-Zelle Modell zur Bursitis Infektionskrankheit Virus Pathogenese

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular mechanisms underlying the production of the vast repertoire of antibodies by the acquired immune systems, it has not yet been possible to arrive at a global view of a complete antibody repertoire. In particular, B cell repertoires have been regarded as a black box because of their astronomical number of antibody clones. However, next-generation sequencing technologies are enabling breakthroughs to increase our understanding of the B cell repertoire. In this report, we describe a simple and efficient method to visualize and analyze whole individual mouse and human antibody repertoires. From the immune organs, representatively from spleen in mice and peripheral blood mononuclear cells in humans, total RNA was prepared, reverse transcribed, and amplified using the 5&#39;-RACE method. Using a universal forward primer and antisense primers for the antibody class-specific constant domains, antibody mRNAs were uniformly amplified in proportions reflecting their frequencies in the antibody populations. The amplicons were sequenced by next-generation sequencing (NGS), yielding more than 105 antibody sequences per immunological sample. We describe the protocols for antibody sequence analyses including V(D)J-gene-segment annotation, a bird&#39;s-eye view of the antibody repertoire, and our computational methods.

Here, we describe protocols for the analysis and visualization of the structure and constitution of whole antibody repertoires. This involves the acquisition of vast sequences of antibody RNA using next-generation sequencing.

Identifizierung von Maus und humanen Antikörpers Repertoires durch Sequenzierung der nächsten Generation

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...

Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay (CBA) is a widely used method to detect anti-AQP4 IgG in human serum with high sensitivity and specificity. Briefly, serum anti-AQP4 IgG is captured by AQP4-transfected cell that is fixed on the biochip then detected by a fluorescein-labelled secondary antibody. Fluorescence microscopy is utilized to visualize the fluorescence, and the intensity of fluorescence is evaluated by at least two experienced clinicians. A final diagnosis of NMOSD can be made based on the combination of anti-AQP4 IgG detection results, clinical manifestations, and neuroradiological findings. According to previous studies, CBA is more sensitive and specific than other anti-AQP4 IgG detection methods, and it can be applied to both clinical diagnosis and studies of NMOSD. The method has limitations; for example, an international scale to evaluate serum anti-AQP4 IgG titers is still lacking. Here, a detailed protocol for human serum anti-AQP4 IgG detection using CBA is described.

Cell-based assay is a widely used method to detect serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin G. This method could be applied to clinical diagnosis and scientific researches of neuromyelitis optical spectrum disorders.

Humanem Serum Anti-Aquaporin-4 Immunglobulin G Erkennung durch zellbasierte Assays

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection setting. The presented method is meant to isolate EVs away from virions (i.e., HIV-1), allowing for a higher efficiency and yield compared to conventional ultracentrifugation methods. Our protocol contains three steps: EV precipitation, density gradient separation, and particle capture. Downstream assays (i.e., Western blot, and PCR) can be run directly following particle capture. This method is advantageous over other isolation methods (i.e., ultracentrifugation) as it allows for the use of minimal starting volumes. Furthermore, it is more user friendly than alternative EV isolation methods requiring multiple ultracentrifugation steps. However, the presented method is limited in its scope of functional EV assays as it is difficult to elute intact EVs from our particles. Furthermore, this method is tailored towards a strictly research-based setting and would not be commercially viable.

This protocol isolates extracellular vesicles (EVs) away from virions with high efficiency and yield by incorporating EV precipitation, density gradient ultracentrifugation, and particle capture to allow for a streamlined workflow and a reduction of starting volume requirements, resulting in reproducible preparations for use in all EV research.

Reinigung von hochertragreichen extrazellulären Vesikelpräparaten weg vom Virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

Vektorkompetenzanalysen an Aedes aegypti Mücken mit Zika-Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...