Wir danken danken T. Ragucci, B. Watkins, S. Wong, und B. Wallek an Lynntech, Inc. für die technische Unterstützung und viele hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wurde von der US National Science Foundation (NSF) unter dem Förderkennzeichen CBET-0933688 unterstützt.

1. Basic Design der Convective Thermocycler <ol><li> Wir haben eine einfache konvektive Thermocycling Gerät, bestehend aus auswechselbaren Kunststoff Reaktionskammer &quot;Patronen&quot;, die zwischen zwei Aluminiumplatten, deren Temperaturen unabhängig 7 gesteuert (Abbildung 2) eingeklemmt aufgebaut sind. </li><li> Zylindrischen Reaktor Brunnen sind durch Bearbeitung Arrays von Löchern in Polycarbonat-Blöcke, mit verschiedenen Kombinationen von Durchmesser und Kunststoff Blechdicke eingesetzt, um die gewünschte Seitenverhältnis (Höhe / Durchmesser = h / d) zu erreichen eingebettet. Zwei verschiedene Reaktor Geometrien sind in der hier vorgestellten Ergebnisse betrachtet: h / d = 9: h = 15,9 mm, d = 1,75 mm, 38,2 ul-Volumen; h / d = 3: h = 6,02 mm, d = 1,98 mm, 18,5 ul Volumen. </li><li> Die untere Fläche des Reaktors erhitzt wird mit einem Aluminium-Block mit Heizpatronen Schnittstelle mit einer Mikroprozessorsteuerung angetrieben Temperaturregler. </li><li> Die Temperatur an der Reaktor-Oberfläche reguliert wird mit einem Aluminium-Block verbunden mit einem umlaufenden Wasserbad. </li><li> Der gesamte Aufbau wird zusammen mit Nylon-Schrauben, um die Wärmeleitung zwischen den gegnerischen Blöcken Aluminium Grenze geklemmt. </li></ol> 2. Vorbereitung und Laden des PCR-Reaktionsgemisches <ol><li> Eine typische 100 ul Reaktionsgemisch enthält 10 uL 10x Puffer, 6 &amp;mgr; l 25 mM MgCl 2, 10 ul dNTPs (2 mM), 41,2 ul VE-Wasser, 10 l β-Aktin-Sonde, 10 l β -Aktin Vorwärtsprimer, 10 l β-Aktin-Reverse-Primer, 2 ul der humanen genomischen DNA-Template (10 ng / mL) und 0,8 ul der KOD-DNA-Polymerase (2,5 Einheiten / ul). </li><li> Vor dem Einlegen der Reagenzien, Dichtung der unteren Fläche der PCR-Kammer mit einer dünnen Aluminiumfolie. </li><li> Spülen Sie den Reaktor Brunnen mit einer 10 mg / mL wässrige Lösung von Rinderserumalbumin durch Regen-X Anti-Fog gefolgt. </li><li> Pipette Reagenzien in den Reaktor Brunnen mit langen Gel-loading Pipettenspitzen und Abdichtung der Oberfläche mit FEP Teflon tape. </li></ol> 3. Ausführen der Reaktion in der Convective Thermocycler <ol><li> Vor Beginn der Reaktion, Vorwärmen sowohl Aluminium-Blöcken, um die gewünschte Ober-und Unterseite Temperaturen. </li><li> Sandwich der Kunststoff-Reaktor mit PCR-Reagenzien zwischen den Aluminium Heizblöcke geladen, schnell und klemmen die Montage zusammen mit Nylon-Schrauben. </li><li> Nach der Reaktion für die gewünschte Zeit fortgeschritten ist, schalten Sie die Heizung und setzen Sie den unteren (hot) Oberfläche des Gerätes auf einem gekühlten Metallblock schnell abkühlen und stoppen Sie die konvektive Strömung. </li><li> Entfernen Sie die Kunststoff-Reaktor und Pipette die Produkte aus dem Brunnen (mit dem langen Gelbeladung Tipps) für die spätere Analyse. </li></ol> 4. Performing-Gel-Elektrophorese-Analyse <ol><li> Bereiten Sie eine 2 Gew.% Agarosegel durch Erhitzen von 10 g Agarose mit 500 ml 1x Puffer auf einer Heizplatte unter Rühren, bis die Lösung klar wird. </li><li> Laden Sie das Agarosegel in die Gelträger und den Kamm einsetzen. Lassen Sie das Gel-Set für ~ 30 min. </li><li> Entfernen Sie den Kamm und fügen 1x TAE-Puffer, bis das Gel getaucht. </li><li> Fluoreszierend gefärbten DNA-Proben enthalten 2 ul 100x SYBR Green I-Lösung, 2 ul DNA-Probe, 2 ul 6x orange Loading Dye und 4 ul TAE-Puffer. </li><li> Fügen Sie die DNA-Proben in die Vertiefungen und führen Sie die Trennung bei 60 V für 1 h mit einer 100 bp DNA-Leiter Sizing-Marker. </li><li> Entfernen Sie das Gel, es fotografieren und unter UV-Licht, um das Ergebnis zu erhalten. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Optimale Gestaltung der konvektiven Thermocycler beinhaltet die Auswahl der richtigen Reaktorgeometrie, dass eine Zirkulationsströmung transportieren kann Reagenzien durch die wichtigsten Temperaturen in den PCR-Prozess beteiligten generieren wird. Die geometrischen Parameter, die in den zylindrischen Reaktoren als hier variiert werden kann, sind die Höhe (h) und Durchmesser (d), oder äquivalent das Seitenverhältnis (h / d). Wir haben die 3-D Strömungsfelder in konvektiven PCR Reaktoren über eine Reihe von verschiedenen Bildformaten mit Computational Fluid Dynamics (CFD) untersucht und festgestellt, dass unerwartet komplexe Muster entstehen können. Noch wichtiger ist, hat unsere Analyse eine Teilmenge dieser komplexen Strömungsfelder, die erheblich beschleunigen die Reaktion 12 aufgedeckt. Diese geometrischen Auswirkungen können eindeutig durch einen Vergleich der Strömungsfelder in Reaktoren bei hohen und niedrigen Seitenverhältnisse zu sehen. In den hohen Seitenverhältnis Fall (h / d = 9; ein großer, magerer Zylinder), sind fließend Elemente entlang Trajektorien Tracing-Pfade, die im Wesentlichen Schleifen geschlossen advehiert, und sie sind locked-in, um die gleichen Wege für lange Zeiträume verfolgen Zeit (Abbildung 3a). Folglich gibt es wenig Gelegenheit für den Austausch zwischen fniedrigen Flugbahnen, die Reagenzien aussetzen, um die optimale Abfolge der thermischen Bedingungen für die PCR (oszillierend zwischen den Glüh-und Denaturierung Extremen am Reaktor der Ober-und Unterseite) und der viel größeren Ensemble von restlichen Bahnen, die nicht zu einer Verstärkung beitragen (näher an der Mitte lokalisierten des Reaktors). Das Strömungsfeld ist ganz anders in einem kleineren Bildformat (h / d = 3; einen kürzeren, breiteren Zylinder), immer chaotisch in dem Sinne, dass das flüssige Element Bahnen nicht mehr folgen geschlossene Pfade (Abbildung 3b). So, obwohl Reagenzien zu einem komplexeren Temperaturprofil ausgesetzt sind, sind fließend Elemente in der Lage, eine viel breitere Palette von Trajektorien zu erkunden, so dass mehrere der Reagenzvolumen hat eine Chance, um eine optimale thermische Profile Erfahrung. Diese Ergebnisse legen nahe, dass counterintuitively während einzelne Strömungstrajektorien bei h / d = 9 zu sein scheint günstiger für die PCR durch die Produktion Temperaturprofile, &quot;Look&quot; ähnlich wie in einem herkömmlichen Thermocycler, die chaotische Natur des Strömungsfeldes bei h / Arbeitnehmer d = 3 letztlich dominiert auf globaler Ebene durch die Förderung verstärkter Austausch, so dass Reagenzien nicht eingeklemmt werden in ungünstigen Trajektorien für sehr lange. Um diese Hypothese zu prüfen und festzustellen, welche Reaktorgeometrie günstiger für die PCR war, haben wir beide zu PCR-Replikation von einem 295 bp Ziel mit der β-Aktin-Gen aus einer humanen genomischen DNA-Template zugeordnet wird. Bemerkenswert ist, dass wir routinemäßig erreicht Verstärkung der richtigen Ziel-Produkt in nur 10 min bei h / d = 3 (Abbildung 4a), während die gleiche Reaktion benötigt mindestens 20 min vor nachweisbare Produkte h / d beobachtet = 9 (Abbildung 4b) . Die Reaktion Spezifität ist auch viel größer bei h / d = 3, wo ein einziges PCR-Produkt erhalten wird, während mehrere unspezifische Produkte zu h erzeugt / d = 9, wo das Strömungsfeld Fallen Fluidelemente in ungünstigen thermischen Trajektorien für längere Zeit. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Thermische Konvektion in einer zylindrischen Kammer, deren Ober-und Unterseite befinden sich in verschiedenen festen Temperaturen gehalten. Wenn die Temperatur an der Unterseite höher ist als an der Spitze, ist eine vertikale Dichtegradienten innerhalb des eingeschlossenen Flüssigkeit, geeignet zur Erzeugung einer Zirkulationsströmung Muster ist etabliert. Mit der richtigen Wahl der geometrischen Parameter (Höhe h und Durchmesser d), kann die Konvektionsströmung Bereich genutzt werden, um PCR Thermocycling betätigen, wenn die Ober-und Unterseite in der Nähe Glüh-und Denaturierung Temperaturen, bzw. (Schwerkraft wirkt senkrecht nach unten) sind manintained werden. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. (A) Die wichtigsten Komponenten einer Konvektionsströmung PCR Thermocyclers. Ein Reaktor Kartusche besteht aus einem Polycarbonat-Block mit einer Reihe von zylindrischen Kammern. Der Block wird zwischen einer oberen Platte zur Verbindung mit einem zirkulierenden Wasserbad und einer Bodenplatte Einbeziehung embedded Heizungen angeschlossen werden eingeklemmt. (B) Die PCR-Reagenzien beladen und versiegelt im Inneren des Reaktors Patrone, nach der das Gerät montiert wird, um die Reaktion durchzuführen. Nach der Fertigstellung können die procucts leicht pipettiert werden aus für die spätere Analyse. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Computersimulationen von 3-D Konvektionsströmung Felder in zylindrischen Reaktoren mit Temperaturen von 53 und 96 ° C erzeugt an der Ober-und Unterseite verhängt, jeweils. Die Ergebnisse werden auf Seitenverhältnisse von (a) gezeigt h / d = 9 (38,2 ul Reaktorvolumen) und (b) h / d = 3 (18,5 ul Reaktorvolumen). Eine repräsentative Trajektorie durch eine flüssige Element Reise durch die 3D-Strömungsfeld gefolgt ist gezeigt, die zusammen mit Ober-und Seitenansicht Projektionen der Weg nach links, die entsprechende Kurve der Temperatur-Zeit-im Anschluss an eine flüssige Element ist an der rechten Seite angezeigt. Die thermische Profil bei h / d = 9 erscheint nahe dem eines herkömmlichen Thermocycler, aber die chaotischen Feld h / d = 3 ist counterintuitively günstiger für PCR. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. DNA-Replikation Ergebnisse in den Reaktor Geometrien in Abbildung 3 (Ober-und Unterseite wurden bei 53 und 96 ° C gehalten, bzw.) gezeigt erhalten. (A) PCR ist sehr besorgt h / d = 3 beschleunigt, da offensichtlich durch starke Produkte sichtbar nach nur 10 min Reaktionszeit (M: 100 bp Leiter, Spuren 1-4: Produkte aus Reaktionen parallel in 4 verschiedenen zylindrischen Kammern). (B </strong&gt;) Die gleiche Reaktion bei h / d = 9 durchgeführt benötigt mindestens 20 min vor dem sichtbaren Produkten beobachtet werden, und mehrere Bänder sind offensichtlich zeigt die Replikation von nicht-spezifische Ziel-DNA neben dem gewünschten Produkt (M: 100 bp Leiter, Spuren 1-2: Produkte aus Reaktionen parallel in 2 verschiedenen zylindrischen Kammern).

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Das Wechselspiel zwischen Fluss und chemische Reaktion kann dramatisch verändern unter dem Einfluss der chaotischen Advektion. Aber diese komplexen Strömungs-Staaten sind schwierig zu untersuchen, insbesondere in realistischen Geometrien, wo 3D-Effekte wichtig werden. Rayleigh-Benard-Konvektion in h / d&gt; 1 bietet nicht nur eine bequeme Plattform, um diese Phänomene zu erforschen, deren Anwendung auf PCR durchführen ermöglicht auch die Kopplung zwischen Strömung und chemischen Reaktionen untersucht werden. Diese einzigartige Fähigkeit macht es möglich, optimale Strömung Staaten, in denen chaotische Effekte handeln (counterintuitively) die Rate der DNA-Replikation zu beschleunigen, um zu wählen.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>KOD DNA Polymerase kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Novagen</td>
<td>71085-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TaqMan &beta;-actin Control Reagents kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>401846</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aluminum tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axygen, Inc.</td>
<td>PCR-AS-200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine serum albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A2153</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rain-X Anti-Fog</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SOPUS Products</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Long Gel-loading Pipette Tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>05-408-151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FEP Teflon tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>7562A17</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Agarose gel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>161-3107</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TAE running buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>141-0743</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SYBR Green I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
<td>S7563</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6x Orange Loading Dye</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fermentas</td>
<td>R0631</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 bp DNA ladder sizing marker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>170-8202</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

rapid pcr thermocycling using microscale thermal convection

Viele molekularbiologische Tests hängen in irgendeiner Weise auf der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), um eine zunächst verdünnt Ziel-DNA-Probe, um eine nachweisbare Konzentration zu verstärken. Aber auch das Design der konventionellen PCR Thermocycling Hardware, vor allem auf massive Metall Heizblöcke, deren Temperatur durch thermoelektrische Heizungen geregelt, schränkt die erreichbare Reaktionsgeschwindigkeit 1. Erhebliche elektrische Energie wird auch benötigt, um wieder heizen und kühlen die Reagenz-Mischung, mit denen die Fähigkeit, diese Instrumente in ein portables Format bereitgestellt werden. Thermische Konvektion ist als eine vielversprechende Alternative Thermocycling Ansatz, der das Potenzial, diese Einschränkungen zu überwinden 2-9 entstanden. Konvektive Strömungen sind an der Tagesordnung in eine Vielfalt von Einstellungen von der Erdatmosphäre, die Ozeane, und Interieur, dekorative und bunte Lavalampen. Fluid-Bewegung ist in der gleichen Weise in jedem Fall eingeleitet: einen Auftrieb getrieben Instabilität entsteht, wenn eine beschränkte Volumen der Flüssigkeit, um eine räumliche Temperaturgradienten ausgesetzt ist. Die gleichen Phänomene bieten eine attraktive Möglichkeit, PCR Thermocycling durchzuführen. Durch Anlegen eines statischen Temperaturgradient über eine entsprechend ausgebildete Reaktorgeometrie, kann eine kontinuierliche Zirkulationsströmung festgestellt, dass wird wiederholt Transport PCR Reagenzien durch Temperaturzonen mit der Denaturierung, Annealing und Ausbaustufen der Reaktion (Abbildung 1) in Verbindung gebracht werden. Thermocycling kann daher in einer pseudo-isotherme Weise durch einfaches hält zwei gegenüberliegenden Flächen zu festen Temperaturen betätigt werden, vollständig entfällt die Notwendigkeit, immer wieder heizen und kühlen das Gerät. Eine der größten Herausforderungen für Design konvektiven Thermocycler ist die Notwendigkeit zur präzisen Steuerung der räumlichen Geschwindigkeits-und Temperaturverteilung innerhalb des Reaktors zu gewährleisten, dass die Reagenzien nacheinander besetzen die richtigen Temperaturzonen für einen ausreichenden Zeitraum 10,11. Hier beschreiben wir Ergebnisse unserer Bemühungen um die volle 3-D Geschwindigkeit und Temperatur-Verteilungen in mikroskaligen konvektiven Thermocycler 12-Sonde. Unerwarteterweise haben wir eine Teilmenge der komplexen Strömungstrajektorien, die sehr günstig sind für die PCR durch eine synergistische Kombination von (1) kontinuierlicher Austausch zwischen Fließwege, dass eine erweiterte Möglichkeit bietet für Reagenzien das gesamte Spektrum der optimalen Temperatur-Profile Probe zu entdecken, und ( 2) erhöhten Zeitaufwand in der Verlängerung Temperaturzone der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der PCR. Extrem schnelle DNA-Vervielfältigung Zeiten (unter 10 min) sind erreichbar in Reaktoren entwickelt, um diese Ströme zu erzeugen.

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Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Wir beschreiben eine neuartige Methode zur DNA-Replikation über die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchführen. Thermische Konvektion ist die kontinuierliche Shuttle Reagenzien zwischen Denaturierung, Annealing und Extension Bedingungen durch die Aufrechterhaltung gegenüberliegenden Oberflächen des Reaktors bei konstanter Temperatur genutzt. Dieses an sich einfache Design verspricht, um eine schnelle PCR mehr zugänglich.

Rapid PCR Thermocycling mit Microscale thermische Konvektion

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

rapid-pcr-thermocycling-using-microscale-thermal-convection

Research

JoVE Journal

Biology

22.6K Aufrufe.  Texas A&M University. Wir beschreiben eine neuartige Methode zur DNA-Replikation über die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchführen. Thermische Konvektion ist die kontinuierliche Shuttle Reagenzien zwischen Denaturierung, Annealing und Extension Bedingungen durch die Aufrechterhaltung gegenüberliegenden Oberflächen des Reaktors bei konstanter Temperatur genutzt. Dieses an sich einfache Design verspricht, um eine schnelle PCR mehr zugänglich.

Serie: Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is determined. Conventional preparation of tissues for PCR-ready DNA often take several hours to days, depending on the tissue sample. The genotype of the sample may thus be delayed for several days, which is not an option for many different types of experiments. Here we demonstrate the complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR Kit. First, we demonstrate the fifteen-minute extraction of DNA from the tissue sample. Then, we demonstrate the real time read-out of the PCR amplification of the sample, which allows for the identification of a positive sample as it is being amplified. Together, the rapid extraction and real-time readout allow for a prompt identification of genotype of a variety different types of tissues through the reliable method of PCR.

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma&#039;s Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

The complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, is done in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR kit.

Schnelle Genotypisierung von Maus Tissue Mit Sigma Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is ...

Forschung

Biologie

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Quantitative Real-Time PCR unter Verwendung der Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Schnelle Homogene Detektion von biologischen Assays mit magnetischen Modulation Biosensorik-System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer ( Agrilus planipennis) Mittels quantitativer Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Profiling von Pre-micro RNAs und microRNAs mittels quantitativer real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Bestimmung genetischer Expressionsprofile in C. elegans Verwenden Microarray-und Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. Although mycoplasma do not usually kill contaminated cells, they are difficult to detect and can cause a variety of effects on cultured cells, including altered metabolism, slowed proliferation and chromosomal aberrations. In short, mycoplasma contamination compromises the value of those cell lines in providing accurate data for life science research.
The sources of mycoplasma contamination in the laboratory are very challenging to completely control. As certain mycoplasma species are found on human skin, they can be introduced through poor aseptic technique. Additionally, they can come from contaminated supplements such as fetal bovine serum, and most importantly from other contaminated cell cultures. Once mycoplasma contaminates a culture, it can quickly spread to contaminate other areas of the lab. Strict adherence to good laboratory practices such as good aseptic technique are key, and routine testing for mycoplasma is highly recommended for successful control of mycoplasma contamination.
PCR-based detection of mycoplasma has become a very popular method for routine cell line maintenance. PCR-based detection methods are highly sensitive and can provide rapid results, which allows researchers to respond quickly to isolate and eliminate contamination once it is detected in comparison to the time required using microbiological techniques. The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit is highly sensitive, with a detection limit of only 2 genomes per &mu;l. Taking advantage of the highly specific JumpStart Taq DNA Polymerase and a proprietary primer design, false positives are greatly reduced. The convenient 8-tube format, strips pre-coated with dNTPs, and associated primers helps increase the throughput to meet the needs of customers with larger collections of cell lines.
Given the extreme sensitivity of the kit, great care must be taken to prevent inadvertent contamination of samples and reagents. The step-by-step protocol we demonstrate highlights the precautions and practices required for reliable mycoplasma detection. We also show and discuss typical results and their interpretation. Our goal is to ensure the success of researchers using the LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit.

The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit utilizes the polymerase chain reaction (PCR), which is established as the method of choice for highest sensitivity in the detection of Mycoplasma, Acholeplasma, and Ureaplasma contamination in cell cultures and other cell culture derived biologicals.

Optimierte PCR-basierten Nachweis von Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Protein Purification-freie Methode der Bindungsaffinität Bestimmung durch Microscale Thermophorese

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Schnelle und effiziente Verwendung von Zebrafisch-Genotypisierung PCR mit Hochauflösende Schmelzanalyse

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to humans through the bite of infected Ixodes ticks. The primary etiological agent in North America is Borrelia burgdorferi sensu stricto. As geographic risk regions expand, it is prudent to support robust surveillance programs that can measure tick infection rates, and communicate findings to clinicians, veterinarians, and the general public. The molecular technique of nested polymerase chain reaction (nPCR) has long been used for this purpose, and it remains a central, inexpensive, and robust approach in the detection of Borrelia in both ticks and wildlife. 
This article demonstrates the application of nPCR to tick DNA extracts to identify infected specimens. Two independent B. burgdorferi targets, genes encoding Flagellin B (FlaB) and Outer surface protein A (OspA), have been used extensively with this technique. The protocol involves tick collection, DNA extraction, and then an initial round of PCR to detect each of the two Borrelia-specific loci. Subsequent polymerase chain reaction (PCR) uses the product of the first reaction as a new template to generate smaller, internal amplification fragments. The nested approach improves upon both the specificity and sensitivity of conventional PCR. A tick is considered positive for the pathogen when inner amplicons from both Borrelia genes can be detected by agarose gel electrophoresis.

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Nested PCR is a sensitive, specific, and straightforward technique that can be applied to tick DNA extracts to probe for Borrelia burgdorferi, the causative agent of Lyme disease. The initial PCR experiment uses gene-specific primers to generate long amplicons, which then become templates for a subsequent reaction using internal primers.

Das Lyme Krankheit Spirochete, Borrelia Burgdorferiin Zecken mit verschachtelten PCR zu erkennen

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to ...