Diese Arbeit wurde vom NIH gewährt DE018304, R01DE018281 unterstützt. KT wird durch T32 GM07092-34 und durch einen Zuschuss an die University of North Carolina at Chapel Hill vom Howard Hughes Medical Institute (HHMI) durch die Med in Grad Initiative unterstützt. PC wird durch T32 CA009156 unterstützt.

Der qPCR pre-miRNA Profiling Arrays können so eingerichtet werden, wie voll ausgestattet mit einem Tecan Freedom EVO-Roboter (A) oder von Hand mit der Matrix elektronischen Mehrkanalpipette (B) automatisiert. 1) Vorbereiten des Master-Mix, Primer-Platten und Proben. <ol><li> Primer-Platten mit 186 Primerpaare in 96-well-Format (insgesamt 2 Platten) am 12.05 sollte bei -80 ° C gelagert werden Thaw Platten bei Raumtemperatur, vortexen, zentrifugieren kurz vor Gebrauch. </li><li> Zur Vorbereitung der Master-Mix, auftauen SYBR Green 2x PCR Mix bei Raumtemperatur. Jede Reaktion verwendet 8ul Master-Mix mit 2UL Primer. Die Zusammensetzung des Mastermix pro Reaktion ist 4ul SYBR-Mix, 3UL PCR-Wasser und 10-20 ng Proben-DNA oder cDNA. </li><li> Für die Einrichtung eines jeden 96-Well-Platte Primer werden vier Master-Mix Rohre benötigt werden. Die Proben können bis zu 4 Proben pro Platte (singlicate), 2 Proben pro Platte (doppelte) oder einer einzigen Probe in vierfacher Ausfertigung ausgeführt werden. </li><li> Bereiten Master-Mix durch die Kombination von SYBR-, Wasser-und Probe in jedem der 4-2ml Eppendorf-Röhrchen. Jedes Rohr sollte genug Mastermix für ca. 100 Reaktionen, so dass überschüssige zum Pipettieren Abfall. Vortex mischen. </li></ol> A. Aufbau der pre-miRNA-Assays unter Verwendung der Freedom Tecan Evo Roboter. <ol><li> Nach der Initialisierung des Roboters und das Laden des EVOware Programm, spülen dreimal mit 30mls je System von Luftblasen, die mit Pipettiergenauigkeit stören klar. </li><li> Richten Sie die Roboter-Plattform, die folgendes beinhalten: <ul><li> Labeled 384-Well-Platte </li><li> 96-well-Primer Platte (1) </li><li> Master-Mixes </li><li> Eine Wanne mit 2% Bleichmittel </li><li> Ein gefüllter System Fluidbehälter </li><li> Leere Abfallbehälter </li></ul></li><li> Begin automatisierten Roboter ausführen, indem Sie &quot;Run&quot; zweimal. </li><li> Am Ende des Programms, zu entfernen 384-Well-Platte und Dichtung mit LightCycler 480 Dichtfolie und kurz zentrifugieren. Ort versiegelt 384-Well-Platte in Position 1 des Hotels. </li><li> Gehe zu 2,2 Step &amp; Repeat für Primer 2 mit neuen Master-Mixes und ein neues 384-Well-Platte. <ol><li> Ort versiegelt Platte in Position 2 des Hotels. </li></ol></li><li> Öffnen Sie ein neues EVOware Programm für Laden der Lightcycler vom Hotel, und wählen Sie &quot;Run&quot; zweimal. <ol><li> Freedom Evo wird automatisch geladen jede Platte in den LightCycler und führen Sie den folgenden SYBR-Green I / HRM PCR-Programm: Pre (1 Zyklus): 50 ° für 5 Minuten an der Rampe von 4,8 ° / sec 95 ° für 5 Minuten an der Rampe von 4,8 ° / sec Amp (45 Zyklen): 95 ° für 15 Sekunden an der Rampe von 4,8 ° / sec 62 ° für 30 Sekunden an der Rampe von 2,5 ° / sec (Single Datenerfassung während dieses Schritts) Schmelzkurve: 95 ° für 5 sec an der Rampe von 4,8 ° / sec 60 ° für 1 Minute bei Anstieg von 2,5 ° / sec 95 ° kontinuierlich an der Rampe Rate von .11 ° / sec mit 5 Akquisitionen pro ° C Cool: 50 ° für 30 Sekunden an der Rampe von 25 ° / sec </li></ol></li></ol> B. Aufbau der pre-miRNA-Assays unter Verwendung der Matrix elektronischen Mehrkanalpipette: <ol><li> Legen Sie Inhalte des Master-Mix Röhre 1 in ein Reservoir. </li><li> Stellen Sie die elektronische Pipette absaugen 16ul des Master-Mix mit 2-8ul verzichten Schritte von einem Spülschritt gefolgt. </li><li> Für Master-Mix 1, verzichten 8ul in jeden anderen auch der 384-Well-Platte (Set auf 384-well Spitze Abstand), beginnend mit gut A1. (Dh Brunnen A1, C1, E1, etc.) Für das zweite 8ul verzichten, gehen Sie zu Spalte 3 (dh Brunnen A3, C3, E3, etc.), dann purge über einen Abfallbehälter und entsorgen Tipps. </li><li> Folgen Sie diesem Muster für die restlichen 5 Zyklen, bis Sie auch A23 zu erreichen. </li><li> Wiederholen Sie dies für Master-Mix 2, (beginnend mit gut A2, C2, E2, etc.); Master-Mix 3 (Anfang an gut B1, D1, F1, etc.); Master-Mix 4 (ab B2, D2, F2, usw. .). </li><li> Für Aliquotierung der Primer Platte, setzen elektronische Pipette absaugen und 2UL verzichten 2UL mit einem Spülschritt folgenden. Dispense 2UL von Primern aus Spalte 1 der 96-Well-Platte Primer (AH) in den 384-Well-Platte, Brunnen A1, C1, E1, etc. Purge über einen Abfallbehälter und entsorgen Tipps. Wiederholen Sie für Brunnen A2, C2, E2, B1, D1, F1, und B2, D2, F2, etc. </li><li> Wiederholen Sie für die Zeilen 2-12 der 96-Well-Primer, schwebte über alle 2 Spalten für jeden Primer Spalte bis zur vollständigen 384-Well-Platte wurden aliquotiert hat. </li><li> Seal-Platten mit einem LightCycler Dichtfolie und kurz zentrifugieren. </li><li> Legen Platten in eine LightCycler 480 und radeln die Platten nach der folgenden Einstellungen mit dem SYBR Green I / HRM Erkennung Format: Pre (1 Zyklus): 50 ° für 5 Minuten an der Rampe von 4,8 ° / sec 95 ° für 5 Minuten an der Rampe von 4,8 ° / sec Amp (45 Zyklen): 95 ° für 15 sec bei Anstiegsgeschwindigkeitvon 4,8 ° / sec 62 ° für 30 Sekunden an der Rampe von 2,5 ° / sec (Single Datenerfassung während dieses Schritts) Schmelzkurve: 95 ° für 5 sec an der Rampe von 4,8 ° / sec 60 ° für 1 Minute bei Anstieg von 2,5 ° / sec 95 ° kontinuierlich an der Rampe Rate von .11 ° / sec mit 5 Akquisitionen pro ° C Cool: 50 ° für 30 Sekunden an der Rampe von 25 ° / sec </li><li> Wiederholen Sie die Verwendung von Primer Platte 2, Aliquotierung in ein frisches 384-Well-Platte mit frisch zubereiteten Mastermixen. </li></ol> Geheimnisse zum Erfolg: Ein wichtiges Merkmal bei der Gestaltung PCR-Arrays ist, dass Alle 186 Primerpaare die gleiche Annealingtemperatur haben, so dass die Platte bei der gleichen optimalen PCR-Lauf-Programm-Einstellungen können ausgeführt werden. Jede neue Array sollte mithilfe drei Kontrollen vor dem Ausführen von Proben. Diese Kontrollen sind: 1 laufen alle Primer mit Wasser oder .1 x TE ausführen, um auszuschließen, Primer Kontamination. 1 von wechselnden Wasser / TE und der positiven Kontrolle laufen, keine Verschleppung zu gewährleisten. 3 läuft mit der gleichen positiven Kontrolle, um die Reproduzierbarkeit zwischen den Läufen zu gewährleisten. Master-Mix sollte frisch zubereitet werden, und die Platten sollten innerhalb von 24 Stunden für optimale Ergebnisse ausgeführt werden Primer Platte Folie sollte langsam entfernt werden, um das Risiko von Kontaminationen zwischen den Wells zu reduzieren. Bei Verwendung eines Roboters mit festen Spitzen, 2% Bleichmittel waschen notwendig, um die Spitzen zwischen den einzelnen Pipettierschritt, durch eine Wasserspülung gefolgt waschen. Dies verhindert und beseitigt Verschleppung, die sonst kontaminieren könnten Daten und führen zu eindeutigen Ergebnisse. Nach einer Platte durch die Lightcycler ausgeführt wird, sollte es nicht wieder in die PCR Setup Raum geöffnet werden. Dies verhindert, dass PCR Kontamination. Repräsentative Ergebnisse: qPCR Ergebnisse sind in der Regel durch CT-Werte als von der Lightcycler Analyse-Software ermittelt vertreten. Ein erfolgreicher laufen in der Regel aus einer Reihe von CTs für Proben, in der Regel zwischen 20-35 für Proben, die positiv sind. Die Wasserproben in einem guten Lauf sind immer an einem CT von&gt; 40 und jedes Muster oder spezielle Vertiefungen mit einer CT über 37 sind als negativ oder nicht erkannt. In der Regel werden die Proben wodurch ein CT von &lt;10 auch unzuverlässig und werden von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Es gibt mehrere Möglichkeiten, qPCR-Daten und die Einbindung der internen Kontrollen in unserem Test zu analysieren hilft bei der Kontrolle für die Variation der Probe-Eingang. Die Pre-miR-Array enthält eine U6-Grundierung, die oft als Referenz-Gen auf CT-Werte von verschiedenen Proben zu normalisieren wird. Dieser normierte Wert wird als Delta-CT-Wert (DCT) bezeichnet. Die Ergebnisse werden oft als das rohe CT, die DCT-Wert graphisch dargestellt oder kann weiter auf standardisierte Werte analysiert werden. In Abbildung 1, die Analyse der volle Vor-microRNA Array von vier verschiedenen Proben aus einem Zeitverlauf Experiment ist in Heat Map-Format präsentiert. Die relative Expression jedes pre-miRNA wird gezeigt und drei große, unterschiedliche Cluster entstanden. Die Mehrheit der pre-Mirs analysiert unterzog kleine, unbedeutende Änderungen wie erwartet (Abbildung 1A). Allerdings waren ein kleiner Teil der Pre-microRNAs signifikant verringert (Abbildung 1B) oder dramatisch zugenommen (Abbildung 1C) in der gesamten Zeitverlauf zu experimentieren. Ebenen des Ausdrucks der einzelnen Vor-microRNA wurden die 0h Zeitpunkt (Probe 1) als Grundlage Niveau normalisiert. In einigen Fällen können Sie feststellen, dass einige der Cluster-pre-microRNAs auch Cluster zusammen in der Heatmap-Analyse (ex: let-7a, Abbildung 1B). Je nach Experiment, Cluster entstehen kann, dass abhängig sind Virusinfektion, Zelltyp spezifische Expression von pre-microRNAs oder Pre-Mirs, dass durch ein gemeinsames Molekül oder-Signalweg reguliert werden. Die pre-miRNA-Test, dass wir auch entwickelt haben, enthält eine Reihe von bekannten viralen pre-microRNAs und Gene, die durch das Kaposi-Sarkom assoziierten Herpesvirus (KSHV) und Epstein-Barr-Virus (EBV) in Ergänzung zu den menschlichen Vor-Mirs kodiert. Diese können als positive oder negative Kontrollen verwendet werden, je nach Zelllinie und virale Status der Proben verwendet. In Abbildung 2 sind die durchschnittlichen CTs von einem KSHV-negative Probe in vierfacher Ausführung gezeigt. Wichtig ist, dass KSHV LANA nicht in diesem Beispiel durch die hochsensitive qPCR-Arrays detektiert. Allerdings U6 - unsere internen Kontroll-und let-7a - waren ein hoch exprimierten humanen Pre-microRNA, in nachweisbaren Mengen exprimiert. Schließlich, wie erwartet, hat die negative Kontrolle der PCR-grade Wasser nicht zu einem qPCR Produkt. Ein weiterer Indikator für eine erfolgreiche qPCR laufen ist ein guter Schmelzkurvenanalyse, die Einblick in die mögliche Kontamination in den Proben geben kann. Um eine Schmelztemperatur wird die Platte langsam nach der PCR ist komplett beheizt. Da die DNA-Stränge zu trennen, wird SYBR green veröffentlicht und Fluoreszenz-Signal abnimmt. Die Temperatur, bei der diese drop auftritt, ist grafisch dargestellt, und ist als die Schmelztemperatur der Probe bekannt. Abhängig von der DNA-Sequenz, Proben bei verschiedenen Temperaturen voneinander und aus dem Wasser negative Kontrolle, die nicht über eine Schmelztemperatur, da keine DNA vorhanden ist, zu schmelzen. Die PCR-Produkte von jedem Primerpaar sollte bei ähnlichen Temperaturen schmelzen. Zum Beispiel zeigt Abbildung 3 a Schmelzkurvenanalyse für zwei verschiedene Primer mit der gleichen Probe in zweifacher Ausfertigung. Es ist klar, dass die Schmelztemperatur für die beiden Primerpaare ist aber die Probe auf die exakt gleiche Temperatur schmelzenden für jede Wiederholung. Anzeichen für eine schlechte oder potenziell kontaminierten Probe kann mehrere Schmelzpeaks, was auf die Anwesenheit von zwei verschiedenen Quellen der Eingabe. <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Pre-microRNA Signaturen entstehen durch Profilierung mit einem neuartigen qPCR-basierte Arrays. Die durchschnittliche deltaCTU6 wurde berechnet und standardisierte Werte wurden in ArrayMinerTM Software geladen, was zu 3 verschiedene Cluster als Heatmaps angezeigt. (A) Pre-microRNAs mit kleinen Veränderungen in der Expression gezeigt werden. Pre-microRNAs, deren Pegel deutlich zurückgegangen (B) oder erhöht (C) sind ebenfalls dargestellt. Blau entspricht unteren Ebenen des Ausdrucks, während rote Expression erhöht ist. <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Einbeziehung der internen Kontrollen in der qPCR-basierte Pre-microRNA Array. Die rohen CT-Werte für 3 verschiedene Gene und keine Vorlage Kontrolle angezeigt. U6 wird als interne positive Kontrolle verwendet, während PCR H2O dient uns als negative Kontrolle. Let-7a-1-1 ist eine microRNA normalerweise in vielen verschiedenen Zelltypen exprimiert, während KSHV LANA entweder eine positive oder negative Kontrolle, auf die virale Status der Zelllinie oder Gewebe verwendet Basis verwendet werden können. <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Schmelzpeak Analyse der Vor-microRNA Primer und der Mangel an Probenkontamination. Schmelzkurven wurden mit dem Tm Aufruf Analyse in der LightCycler-Software. Zwei verschiedene Primer (Primer A und B) für die gleiche Probe in zweifacher Ausführung gezeigt. Die Schmelztemperatur für jedes Primerpaar unterscheidet. Allerdings hat die Probe nur einen Peak, was die mangelnde Probenkontamination.

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	<li>Bustin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+Guidelines:+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Real-Time+PCR+Experiments.">The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments.</a> Clinical Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Fr&#233;geau, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Processing+of+Forensic+Casework+Samples+using+Robotic+Workstations+Equipped+with+Nondisposable+Tips+-+Contamination+Prevention.">Automated Processing of Forensic Casework Samples using Robotic Workstations Equipped with Nondisposable Tips - Contamination Prevention.</a> J. Forensic Sci. 53 (3), 53-533 (2008).</li><li>O'hara, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-micro+RNA+Signatures+Delineate+Stages+of+Endothelial+Cell+Transformation+in+Kaposi+Sarcoma.">Pre-micro RNA Signatures Delineate Stages of Endothelial Cell Transformation in Kaposi Sarcoma.</a> PLoS Pathog. 5 (4), e1000389-e1000389 (2009).</li></ol>

QPCR ist ein hochempfindliches Verfahren, die zur Genexpression zwischen den Proben vergleichen in einer Studie werden können, sowie Positivität im Falle von Viren zu bestimmen. Der Vorteil der Verwendung von qPCR-Arrays ist die Fähigkeit, viele Primer (in unserem Fall, 186 Primerpaare) für jede Probe laufen in einem kurzen Zeitraum. Mit einem Pipettierroboter wie die Tecan Freedom EVO, der viel Zeit benötigt, um ein Experiment zu weiter reduziert werden kann, festgelegt, und die Genauigkeit und Konsistenz des Robo...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Freedom Evo 150</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tecan</td>
<td>30017587</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Matrix Electronic Multichannel Pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>2001-MTX</td>
<td>(or any comparable Thermo Scientific multichannel that can pipette the volumes described above)</td>
</tr>
<tr>
<td>Matrix Integrity Filter Tips, Sterile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>7435</td>
<td>(or comparable tip for multichannel used)</td>
</tr>
<tr>
<td>Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>04 707 516 001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lightcycler 480 Instrument II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>05015243001</td>
<td>384-well version</td>
</tr>
<tr>
<td>Lightcycler 480 Multiwell Plate 384, white</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>04729749001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LightCycler 480 Sealing Foil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>04729757001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LightCycler 480 Multiple Plate Analysis Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>05075122001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eliminase Decontaminant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Decon Laboratories</td>
<td>04-355-31</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

profiling of pre-micro rnas and micrornas using quantitative real-time pcr (qpcr) arrays

Quantitative real-time PCR (qPCR) ist als eine genaue und wertvolle Hilfe in der Profilierung der Genexpression Ebenen entstanden. Einer der vielen Vorteile ist eine untere Nachweisgrenze im Vergleich zu anderen Methoden der Genexpressions-Profiling bei der Verwendung kleiner Mengen von Input für jeden Test. Automatisierte qPCR Setup hat auf diesem Gebiet, indem sie für höhere Reproduzierbarkeit verbessert. Dank der günstigen und schnellen Aufbau ermöglicht Hochdurchsatz-Experimenten, so dass die Profilierung von vielen verschiedenen Genen gleichzeitig in jedem Experiment. Diese Methode zusammen mit internen Platte steuert reduziert auch experimentelle Variablen gemeinsam mit anderen Techniken. Wir haben vor kurzem entwickelte eine qPCR-Assay für die Profilierung von pre-microRNAs (pre-miRNAs) mit einem Satz von 186 Primerpaare. MicroRNAs haben als eine neue Klasse von kleinen, nicht-kodierende RNAs mit der Fähigkeit, viele mRNA-Ziele in der post-transkriptioneller Ebene regulieren entstanden. Diese kleinen RNAs werden zunächst durch RNA-Polymerase II als primäres miRNA (pri-miRNA) Transkript, die dann in die Vorläufer miRNA (pre-miRNA) gespalten wird transkribiert. Pre-miRNAs sind in das Zytoplasma, wo Dicer spaltet die Haarnadelschleife zu reifen miRNAs Ertrag exportiert. Erhöht in miRNA Ebenen können sowohl die Vorstufe und reifen miRNA Ebenen und Profilierung der beiden Formen beobachtet werden kann sinnvoll sein. Es gibt mehrere kommerziell erhältliche Assays für die reife miRNAs, aber ihre hohen Kosten können die Forscher von diesem Profiling-Technik abzuschrecken. Hier diskutieren wir eine kostengünstige, zuverlässige und SYBR-basierte qPCR-Methode des Profiling pre-miRNAs. Änderungen in pre-miRNA Ebenen spiegeln oft reife miRNA Änderungen und kann ein nützlicher Indikator für reife miRNA-Ausdruck sein. Allerdings kann die gleichzeitige Profilierung sowohl pre-miRNAs und reifen miRNAs optimal sein, da sie nicht-redundanten Informationen können dazu beitragen und geben Einblick in microRNA Verarbeitung. Darüber hinaus kann die hier beschriebene Technik erweitert, um die Profilierung der anderen Bibliothek Sets für spezifische Signalwege oder Krankheitserreger umfassen.

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Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Wir zeigen den Aufbau und die Analyse der Vor-microRNA 96-well-Arrays für die qPCR mit einem Roboter als auch von Hand mit einem Thermo Scientific Matrix Mehrkanalpipette.

Profiling von Pre-micro RNAs und microRNAs mittels quantitativer real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

profiling-pre-micro-rnas-micrornas-using-quantitative-real-time-pcr

Research

JoVE Journal

Biology

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

17.2K Aufrufe.  University of North Carolina at Chapel Hill. Wir zeigen den Aufbau und die Analyse der Vor-microRNA 96-well-Arrays für die qPCR mit einem Roboter als auch von Hand mit einem Thermo Scientific Matrix Mehrkanalpipette.

Serie: Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Quantitative Real-Time PCR unter Verwendung der Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Forschung

Biologie

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer ( Agrilus planipennis) Mittels quantitativer Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Bestimmung genetischer Expressionsprofile in C. elegans Verwenden Microarray-und Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base excision repair (BER) molecular beacons. The substrate (beacon) is comprised of a deoxyoligonucleotide containing a single base lesion with a 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) moiety conjugated to the 5'end and a Dabcyl moiety conjugated to the 3' end of the oligonucleotide. The BER molecular beacon is 43 bases in length and the sequence is designed to promote the formation of a stem-loop structure with 13 nucleotides in the loop and 15 base pairs in the stem1,2. When folded in this configuration the 6-FAM moiety is quenched by Dabcyl in a non-fluorescent manner via F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET)3,4. The lesion is positioned such that following base lesion removal and strand scission the remaining 5 base oligonucleotide containing the 6-FAM moiety is released from the stem. Release and detachment from the quencher (Dabcyl) results in an increase of fluorescence that is proportionate to the level of DNA repair. By collecting multiple reads of the fluorescence values, real-time assessment of BER activity is possible. The use of standard quantitative real-time PCR instruments allows the simultaneous analysis of numerous samples. The design of these BER molecular beacons, with a single base lesion, is amenable to kinetic analyses, BER quantification and inhibitor validation and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor cell lysates or with purified proteins. The analysis of BER activity in tumor lysates or tissue aspirates using these molecular beacons may be applicable to functional biomarker measurements. Further, the analysis of BER activity with purified proteins using this quantitative assay provides a rapid, high-throughput method for the discovery and validation of BER inhibitors.

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates. The assay yields rates of DNA Repair activity amenable to kinetic analysis and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor lysates or with purified proteins.

Quantitative, Echtzeit-Analyse der Base Excision Repair Aktivität in Zelllysaten Verwendung läsionsspezifischen Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Profiling Individuelle humanen embryonalen Stammzellen durch quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

Echtzeit-Messungen von Membranprotein: Rezeptor-Wechselwirkungen Mit Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

Sonde-basierte Echtzeit-PCR Ansätze zur quantitativen Messung von microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag Analyse - ein hoher Durchsatz, Echtzeit-PCR-Assay für Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This approach is appropriate for examining physiological changes in target gene expression levels. However, absolute quantification using better statistical analysis is preferable for a comprehensive assessment of gene expression levels. Absolute quantification is still not in common use. This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using RT-qPCR with or without pre-amplification.
A fixed volume (200 &#181;L) of EDTA-plasma was prepared from the blood collected from the femoral vein of conscious cynomolgus monkeys (n = 50). Total RNA was extracted using commercially available system. Plasma miRNAs were quantified by probe-based RT-qPCR assays which contains miRNA-specific forward/reverse PCR primer and probe. Standard curves for absolute quantification were generated using commercially available synthetic RNA oligonucleotides. A synthetic cel-miR-238 was used as an external control for normalization and quality assessment. The miRNAs that showed quantification cycle (Cq) values above 35 were pre-amplified prior to the qPCR step.
Among the 8 miRNAs examined, miR-122, miR-133a, and miR-192 were detectable without pre-amplification, whereas miR-1, miR-206, and miR-499a required pre-amplification because of their low expression levels. MiR-208a and miR-208b were not detectable even after pre-amplification. Sample processing efficiency was evaluated by the Cq values of the spiked cel-miR-238. In this assay method, technical variation was estimated to be less than 3-fold and the lower limit of quantification (LLOQ) was 102 copy/&#181;L, for most of the examined miRNAs.
This protocol provides a better estimate of the quantity of plasma miRNAs, and allows quality assessment of corresponding data from different studies. Considering the low number of miRNAs in body fluids, pre-amplification is useful to enhance detection of poorly expressed miRNAs.

This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using quantitative real-time reverse transcription PCR with or without pre-amplification. This protocol affords better understanding of the quantity of plasma miRNAs and allows qualitative assessment of corresponding data from different studies or laboratories.

Absolute Quantifizierung von MicroRNA-Plasmaspiegel bei Cynomolgus Affen, über Quantitative Real-Time Reverse Transkription PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon its autophosphorylation on Thr288. AURKA abundance peaks in mitosis, where it controls the stability and the fidelity of the mitotic spindle, and the overall efficiency of mitosis. Although well characterized at the structural level, a consistent monitoring of the activation of AURKA throughout the cell cycle is lacking. A possible solution consists in using genetically-encoded F&#246;rster&#8217;s Resonance Energy Transfer (FRET) biosensors to gain insight into the autophosphorylation of AURKA with sufficient spatiotemporal resolution. Here, we describe a protocol to engineer FRET biosensors detecting Thr288 autophosphorylation, and how to follow this modification during mitosis. First, we provide an overview of possible donor/acceptor FRET pairs, and we show possible cloning and insertion methods of AURKA FRET biosensors in mammalian cells. Then, we provide a step-by-step analysis for rapid FRET measurements by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) on a custom-built setup. However, this protocol is also applicable to alternative commercial solutions available. We conclude by considering the most appropriate FRET controls for an AURKA-based biosensor, and by highlighting potential future improvements to further increase the sensitivity of this tool.

The activation of the multifunctional Ser/Thr kinase AURKA is hallmarked by its autophosphorylation on Thr288. Fluorescent probes relying on FRET can discriminate between its inactive and activated states. Here, we illustrate some strategies for probe engineering, together with a rapid FRET protocol to follow the kinase activation throughout mitosis.

Echtzeitüberwachung der Aktivierung der Aurora-Kinase A mit konformationellen FRET-Biosensoren in lebenden Zellen

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...