Wir erkennen die Hilfe von Lourdes Delta Arrueta Antequera (Abteilung Entomologie, Ohio State University / OARDC, Wooster, OH) in den Aufbau der Experimente zur Verfügung gestellt. Wir danken Dr. Therese Polen (USDA, Forest Services, NRS) für Sende-EAB Larven Proben. Hilfe zur Verfügung gestellt von Dr. Luis A Canas und Nuris M Acosta mit dem Mikroskop Setup geschätzt wird. Die Finanzierung für dieses Projekt wurde von Staats-und Bundesmittel angeeignet, die Ohio Agricultural Research and Development Center, The Ohio State University zur Verfügung gestellt.

Die vollständige Protokoll mit den unterschiedlichen Schritten in dem Flussdiagramm in Abbildung 1 dargestellt. Einzelne Schritte bilden Dissektion, sind RNA-Extraktion, First Strand cDNA-Synthese und qRT-PCR weiter unten beschrieben. I. Larven Dissection <ol><li> Vor Beginn des Verfahrens, Ort Smaragd Asche borer oder EAB, Larven auf feuchten Papiertüchern bis Dissektionen durchgeführt werden. Halten Sie frisch zubereiteten 1X Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung oder PBS, auf Eis, um den Puffer Kälte während der Zerlegung zu halten. </li><li> Um zu beginnen, fixieren die EAB Larven auf die Zerlegung Platte mit feinen Sezierung Pins. Dann fügen Sie kaltes 1X PBS, um die Zerlegung Platte. </li><li> Zunächst enthaupten Larven mit einem feinen Paar Dissektion Schere. Anschließend entfernen Sie das letzte Abdominalsegment der Larven. </li><li> Mit einem Uhrmacher Pinzette, heben Sie die Nagelhaut von der Larve Karkasse. Dann machen einen Schnitt entlang der Länge der Karkasse mit einer Schere. Achten Sie darauf, nicht zum Bruch des Darms, wie der Schnitt gemacht wird. </li><li> Sorgfältig isolieren Mitteldarm Gewebe aus anderen Geweben wie Fett Organe und Bindegewebe. Dann spülen Sie das Gewebe in frischem 1X PBS-Puffer, um sicherzustellen, dass es keine Verschmutzung der fatbody. Übertragen Sie die isoliert Mitteldarm zu 500 ul der vorgekühlte Trizolreagenz in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Anschließend isolieren das Fett Körpergewebe mit einer Pinzette und übertragen sie in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit 500 ul von gekühlten Trizolreagenz. </li><li> Schließlich trennen die Kutikula Gewebe aus dem Larvenstadium Karkasse durch Verschrottung off anhaftenden Gewebe, kümmert sich nicht um Gewebe Integrität beschädigen. Spülen Sie die isolierte Cuticula Gewebe in frischem PBS-Puffer und überträgt es auf einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit 500 ul gekühlt Trizolreagenz. </li><li> Die isolierte fetten Körper, Haut-und Mitteldarm Gewebe kann bei -80 ° C gelagert werden, bis die RNA-Extraktion. </li><li> In Vorbereitung auf die RNA-Extraktion, sortieren Sie die verschiedenen EAB Proben nach den Entwicklungsstufen. Diese Stufen sind 1st-, 2nd-, 3rd-, und 4. Larvenstadien, prepupae und Erwachsene. </li></ol> II. RNA-Extraktion (nach Herstellerangaben s-Protokoll für die Verwendung von Trizol Reagent) Homogenisierung <ol><li> Zu Beginn RNA-Extraktion, dem ersten Gebrauch Kunststoff Stößel zu den Geweben in der Trizol mit 1,5 mL Eppendorf-Röhrchen zu homogenisieren. Nach der Homogenisierung, bring das Gesamtvolumen jeder Probe zu 1 ml mit dem Trizolreagenz. </li><li> Für die Entwicklungsstadien, homogenisieren ganze Tier in flüssigem Stickstoff mit einem Mörser zerstoßen. Dann fügen Sie einen aliquoten Teil der Homogenat (50 ug) zu 1 ml Trizol. </li></ol> Phasentrennung: <ol start="3"><li> Inkubieren Sie die Probenröhrchen mit 1 mL Trizol für 15 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Nach der Inkubation add 200 ul Chloroform in jedes Röhrchen. Unmittelbar nach Zugabe von Chloroform und schüttelt die Rohre kräftig für etwa 15 Sekunden. Dann die Röhrchen bei Raumtemperatur für weitere 2-3 Minuten. </li><li> Als nächstes Zentrifuge die Proben bei 12.000 xg für 15 Minuten bei 2 ° C. Nach Zentrifugation wird die RNA in der wässrigen Phase. Das Volumen der wässrigen Phase sollte 600 ul oder 60% des gesamten Volumens Trizol werden. </li></ol> RNA Niederschläge <ol start="6"><li> Entfernen Sie vorsichtig nur die wässrige Phase. Vorhandensein von Stoffen unterhalb der wässrigen Phase wird zu einer Kontamination der extrahierten RNA. Dann Transfer der wässrigen Phase in eine entsprechend beschriftete 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Zur Fällung der RNA aus der wässrigen Phase, Mix 0,5 ml Isopropylalkohol in jedes Röhrchen. Inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Nach der Inkubation zentrifugieren bei 12.000 xg für 10 Minuten bei 2 ° C. </li></ol> RNA Wash <ol start="8"><li> Nach der Zentrifugation den Überstand verwerfen aus den Rohren. RNA ist in der gelartigen Pellet am Boden des Röhrchens gebildet. Waschen des Pellets mit 75% Ethanol, Zugabe von mindestens 1 ml 75% Ethanol pro 1 ml Trizol. Durch Vortexen mischen. Dann zentrifugieren bei 7500Xg für 5 Minuten bei 2 ° C. </li></ol> RNA Elution <ol start="9"><li> Verwerfen Sie den Überstand aus den Rohren. Zentrifugieren wieder in dem kleinen Tisch-Zentrifuge für 1 Minute. Entfernen Sie überschüssiges Überstand aus der Tube durch vorsichtiges Pipettieren. Verlassen Sie die Röhre öffnen und das Pellet an der Luft trocknen für 5-10 Minuten. Achten Sie darauf, über trockene Pellet, da dies deutlich sinken wird seine Löslichkeit. </li><li> Nach Lufttrocknung, das Pellet in <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/Diethylpyrocarbonate">Diethylpyrocarbonat</a> oder DEPC, behandeltes Wasser. Die Menge des Wassers verwendet werden, um das Pellet resuspendieren hängt von der Größe des Pellets ab. Verwenden Sie 50 ul DEPC behandeltem Wasser für eine smAlle Pellet oder 100 ul für eine große Pellets. Lassen Sie das Pellet vollständig in DEPC behandeltem Wasser auflösen, indem Sie die Pipettenspitze nach oben und unten mehrere Male. </li><li> Sobald das Pellet gelöst hat, legen Sie die Probe bei 55 ° C für 10 Minuten. </li><li> Dann messen die Konzentration der einzelnen RNA-Probe mit einem Nanodrop Spektralphotometer (2 ul der RNA-Probe). </li><li> Bewahren Sie die RNA-Proben bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung. </li></ol> III. First-Strand cDNA-Synthese (nach Herstellerangaben s-Protokoll mit SuperScript Erststrangsynthese Kit von Invitrogen.) <ol><li> Für jede RNA-Probe fügen Sie die folgende in einem PCR-Röhrchen: <table border="0"><tbody><tr><td> RNA </td><td> x ul </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP-Mix M </td><td> 1μl </td></tr><tr><td> Oligo (dt) (0,5 ug / ul) </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> DEPC behandeltem Wasser </td><td> (8-x) ul </td></tr><tr><td> Gesamtvolumen: </td><td> 10 pl </td></tr><tr><td colspan="2"> Hinweis: x ist das Volumen der RNA für die cDNA-Synthese eingesetzt. Je nach Konzentration der RNA, wird 2-3 pg RNA für jede Reaktion eingesetzt werden und das Gesamtvolumen der jeweiligen Reaktion sollte 10 pl werden. </td></tr></tbody></table></li><li> Legen Sie die obige Reaktion Mix in einem Thermocycler bei 65 ° C für 4 Minuten. </li><li> Entfernen Sie die Schläuche von der theromocyler und legen sie auf Eis sofort für mindestens 2 Minuten. </li><li> Bereiten Sie den ersten Strang Master-Mix, indem Sie die folgenden: <table border="0"><tbody><tr><td> 10x RT-Puffer </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> 25mM MgCl 2 </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> 0,1 M DTT </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> RNase aus </td><td> 1 ul </td></tr></tbody></table></li><li> Add 9 ul Mastermix in jedes Röhrchen mit der RNA-Probe, mischen Sie durch Pipettieren und Zentrifugieren der Mischung kurz. </li><li> Legen Sie die Rohre zurück in den Thermocycler und inkubieren für 2 Minuten bei 42 ° C. </li><li> Halten Sie den Thermocycler und fügen 1 ul Superscript II Reverse Transkriptase (Invitrogen) in jedes Röhrchen. Dieser Schritt sollte schnell erledigt werden. </li><li> Inkubieren Sie die Proben bei 42 ° C für 1,5 Stunden. </li><li> Beenden Sie die Reaktion bei 70 ° C für 15 Minuten. </li><li> Entfernen Sie das Röhrchen aus dem Thermocycler und legen sie auf Eis. </li><li> Add 1 ul RNase H zu jedem Röhrchen und legen Sie sie zurück in den Thermocycler bei 37 ° C für 20 Minuten. </li><li> Nach Entnahme der Proben aus dem Thermocycler, fügen Sie 20 ul Nuklease-freies Wasser in jedes Röhrchen. Das Volumen jeder Probe wird in dieser Phase verdoppelt. </li><li> Überprüfen Sie die Konzentration der einzelnen Proben unter Verwendung von 2 ul der Probe. Nehmen Aliquot jeder Probe, um die Konzentration von 20ng/μl für den Einsatz in qRT-PCR zu machen. Die Menge des Wassers, um die Proben auf eine Konzentration von 20ng/μl wird auf die anfängliche Konzentration der cDNA synthetisiert ab. </li></ol> IV. qRT-PCR: Primer Design und Bestimmung der Referenz-Gen <ol><li> Design-Primer mit einer Schmelztemperatur (Tm) von 60 ° C und ein Produkt Größe von ~ 100 bp. </li><li> AP-PERI1 ist als das Gen von Interesse für dieses Experiment verwendet. Ein Verweis Gen oder interne Kontrollsystem ist für eine spätere Analyse und Normalisierung der Daten benötigt wird. Ribosomalen Protein (AP-RP1) wird als Referenz-Gen für dieses Experiment verwendet. </li><li> Bereiten 5um arbeiten Aktien der Primer, die verwendet werden, einschließlich Ihrer Referenz-Gen. </li></ol> Vorbereitung der Standards <ol start="4"><li> Um die Effizienz der Primer verwendet Standards vorgenommen werden sollten berechnen. </li><li> Machen Sie eine Mischung aus der cDNA aus den verschiedenen Proben, die getestet werden. </li><li> Machen 5X serielle Verdünnungen für jeden beliebigen Punkt in der Grafik. Vier Verdünnungen sollte genug sein, aber fünf sind sehr zu empfehlen. </li><li> Das Volumen variiert je nachdem, wie viele Punkte und wie viele technische Replikate verwendet werden. Es sollte ausreichen, um einen Standard für jedes Gen wird mit der entsprechenden Referenz-Gen getestet zu machen. </li></ol> Platte Vorlage <ol start="8"><li> Design-Vorlage zeigt den Namen des Samples für jeden gut in der qRT-PCR-Platte. Denken Sie daran, Standards für jedes Gen und mindestens zwei technische Replikate pro Probe sind. </li></ol> Richten Sie das Rad Parameter <ol start="9"><li> Schalten Sie die qRT-PCR-Maschine auf und geben Sie die Rad-Parameter. Die PCR-Parameter für dieses Experiment ist wie folgt: Schritt 1: <ul><li> 1 Zyklus: 95 ° C 3 min </li></ul> Schritt 2: <ul><li> 40 Zyklen: 95 ° C 15 sec, gefolgt von 60 ° C 30 sec (Optional: für die Bestimmung der Schmelzkurve die folgenden Schritte umfassen) </li></ul&gt; Schritt 3: <ul><li> 1 Zyklus: 95 ° C 1 min </li></ul> Schritt 4: <ul><li> 1 Zyklus: 55 ° C 1 min </li></ul> Schritt 5: <ul><li> 81 Zyklen: 55 ° C 30 sec </li></ul></li></ol> Platte einrichten für CFX96 (BioRad) Maschine <ol start="11"><li> Bereiten Sie den Master-Mix für jedes Gen (einschließlich der Referenz-Gen) in separaten Röhrchen. Für jeden gut, besteht der Master-Mix <table border="0"><tbody><tr><td> Nuclease freies Wasser </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> 2,5 x SYBR green </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> Primer nach vorn </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Primer reverse </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Gesamtvolumen </td><td> 8 ul </td></tr></tbody></table></li><li> Während der Vorbereitung der Master-Mix enthalten 1-2 zusätzliche Reaktionen zu berücksichtigen Pipettierfehler. </li><li> Nach den zuvor entworfenen Vorlagen, fügen Sie 2 ul (20 ng / mL) der cDNA in jede Vertiefung. Dann fügen Sie 8 &amp;mgr; l des Master-Mix in jede Vertiefung, was zu einem Gesamtvolumen von 10 ul pro Reaktion. </li><li> Pipette auf und ab (2-3X), um sicherzustellen, wird die Probe gut gemischt. Überprüfen Sie, dass keine Flüssigkeit an der Spitze bleibt. Zur Vermeidung von Kreuzkontaminationen, verwenden Sie einen neuen Tipp für jede Probe. </li><li> Sobald die gesamte Platte eingerichtet ist, die Platte abgedeckt mit optischen Band. Berühren Sie das Band wie die Anwesenheit von Fett die Ablesung beeinträchtigen können. Dann Zentrifuge die Platte bei 500 rpm für 1 Minute, um sicherzustellen, dass alle Produkte in den Vertiefungen an der Unterseite der Platte sind. </li><li> Nach der Zentrifugation zu überprüfen, dass es kein Eis oder Wasser auf der Unterseite der Platte. Schließlich wird die Platte in der qRT-PCR-Maschine und führen Sie das PCR-Programm. </li></ol> V. Schematische Darstellung des Experiments <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1: Flussdiagramm, das die Reihenfolge der Schritte für die Genexpression zu untersuchen. <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2: A) Larven EAB Dissektion zeigt Mitteldarm in der Mitte. B) isoliert Mitteldarm der Larven EAB <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3: A) Mittlere relative Expression Werte (Umdrehungen) für eine peritrophin Gen (AP-PERI1) in verschiedenen Larvenstadien Gewebe einschließlich Cuticula (Cu), Mitteldarm (MG) ​​und Fettkörper (FB). Ein EAB bestimmten ribosomalen Protein (hier benannt, AP-RP1) wurde als interne Kontrolle für die Normalisierung der Daten für das Gen von Interesse, AP-PERI1 erhalten wird. B) Relative fache Änderung der AP-PERI1 in larvalen Geweben. Die Nagelhaut Gewebe zeigten die geringste Ausdruck und wurde deshalb als Kalibrator (1X) Probe (Pfaffl, 2001). <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4: A) Mittlere relative Expression Werte (Umdrehungen) für eine peritrophin Gen (AP-PERI1) in verschiedenen Entwicklungsstadien der EAB einschließlich Larvenstadien (1., 2., 3. und 4.), prepupae (PP) und Erwachsene (A). Ein EAB bestimmten ribosomalen Protein (AP-RP1) wurde als interne Kontrolle für die Normalisierung der Daten für das Gen von Interesse, AP-PERI1 erhalten wird. B) Relative fache Änderung der AP-PERI1 in verschiedenen Entwicklungsstadien. Die PP Probe zeigte die geringste Niveau der mRNA-Spiegel und war daher als Kalibrator (1X Probe) übernommen. VI. Abschluss Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) ist ein wirksames Instrument zur mRNA-Spiegel in verschiedenen Insekten-Geweben und Entwicklungsstadien zu diagnostizieren. Ferner hat qRT-PCR meist das zentrale Instrument, um Daten von hoher Durchsatz Genexpressionsanalysen wie Microarrays und die neue Generation der RNA-Seq generiert validieren.

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	<li>Lehane, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peritrophic+matrix+structure+and+function.">Peritrophic matrix structure and function.</a> Annu Rev Entomol. 42, 525-550 (1997).</li><li>Mittapalli, O., Sardesai, N., Shukle, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cDNA+cloning+and+transcriptional+expression+of+a+peritrophin-like+gene+in+the+Hessian+fly,+Mayetiola+destructor+[Say].">cDNA cloning and transcriptional expression of a peritrophin-like gene in the Hessian fly, Mayetiola destructor [Say].</a> Arc of Insect Bio. 64, 19-29 (2007).</li><li>Pauchet, Y., Wilkinson, P., van Munster, M., Augustin, S., Pauron, D., ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+of+the+midgut+transcriptome+of+the+poplar+leaf+beetle+Chrysomela+tremulae+reveals+new+gene+families+in+Coleoptera.+Ins+Bio+and+Mol.">Pyrosequencing of the midgut transcriptome of the poplar leaf beetle Chrysomela tremulae reveals new gene families in Coleoptera. Ins Bio and Mol.</a> 39, 403-413 (2009).</li><li>Pfaffl, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR.">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2002-2007 (2001).</li><li>Tellam, R. L., Lehane, M. J., Billingsley, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of the Insect Midgut. , 86-114 (1996).</li></ol>

Der Schwellenwert-Zyklen (Ct)-Wert für jede Probe in der qRT-PCR-Platte erhalten. Zur Herstellung der Standardkurve wurde die Ct-Wert für jede Verdünnung erhalten gegen den log der Konzentration aufgetragen. Die Ct-Werte für die experimentellen Proben wurden dann auf dieser Verdünnungsreihe Standardkurve aufgetragen. Ziel Mengen wurden aus separaten Standard-Kurven für jedes Experiment dh Gewebe-und Entwicklungs-Ausdruck erzeugt werden berechnet. Die relative Expression Werte (Umdrehungen) wurden dann durch Divisi...

analysis of gene expression in emerald ash borer (agrilus planipennis) using quantitative real time-pcr

Smaragd Asche borer (EAB,<em&gt; Agrilus planipennis</em&gt;) Ist eine exotische invasive Schädlinge, die Millionen von Eschen getötet hat (<em&gt; Fraxinus</em&gt; Spp) in Nordamerika.<strong&gt;</strong&gt; EAB weiterhin rasant verbreitet und Angriffe Eschen unterschiedlichen Alters, von Bäumchen zu Bäumen. Doch bis heute sehr wenig oder gar keine molekulare Wissen existiert für EAB. Wir sind in der Entschlüsselung der molekularen Basis physiologischer Prozesse im Gewebe interessiert, dass die Beihilfen EAB in eine erfolgreiche Kolonisation von Eschen. In diesem Bericht zeigen wir die effektive Nutzung der quantitativen real-time PCR (qRT-PCR) zu prüfen, mRNA-Spiegel in verschiedenen Larvenstadien Gewebe (einschließlich Mitteldarm Fettkörper und Kutikula) und verschiedene Entwicklungsstadien (davon 1<sup&gt; St</sup&gt; -, 2<sup&gt; Nd</sup&gt; -, 3<sup&gt; Rd</sup&gt; -, 4<sup&gt; Th</sup&gt;-Instars, prepupae und Erwachsene) von EAB. Als Beispiel, ein peritrophin Gen (hier benannt,<em&gt; AP-PERI1</em&gt;) Wird als das Gen von Interesse und einem ribosomalen Protein Beispiel (<em&gt; AP-RP1</em&gt;) Als interne Kontrolle. Peritrophins sind wichtige Bestandteile des peritrophic Membran / Matrix (PM), die die Auskleidung der Insektendarm ist. Der PM hat diverse Funktionen wie Verdauung und mechanischen Schutz der Mitteldarm Epithel.

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Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) ist ein wirksames Instrument zur mRNA-Spiegel in verschiedenen Insekten-Geweben und Entwicklungsstadien zu diagnostizieren. In diesem Bericht zeigen wir die Verwendung von qRT-PCR, um festzustellen mRNA-Spiegel in verschiedenen Larvenstadien Geweben und Entwicklungsstadien der invasiven Insektenarten, Smaragd Asche borer.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer ( Agrilus planipennis) Mittels quantitativer Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

10.6K Aufrufe.  The Ohio State University. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) ist ein wirksames Instrument zur mRNA-Spiegel in verschiedenen Insekten-Geweben und Entwicklungsstadien zu diagnostizieren. In diesem Bericht zeigen wir die Verwendung von qRT-PCR, um festzustellen mRNA-Spiegel in verschiedenen Larvenstadien Geweben und Entwicklungsstadien der invasiven Insektenarten, Smaragd Asche borer.

Serie: Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Bakterielle Gene Expression Analysis Using Microarrays

Forschung

Biologie

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Globale Genexpressionsanalyse Mit einem Zebrafisch Oligonukleotid-Microarray-Plattform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Mit dem Gene Pulser MXcell Elektroporation System zur Primary Cells mit hohem Wirkungsgrad zu transfizieren

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Quantitative Real-Time PCR unter Verwendung der Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Verwendung eines automatisierten Cell Counter zu Genexpressionsstudien Simplify: siRNA Knockdown von IL-4 abhängige Genexpression in Namalwalzellen

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Profiling von Pre-micro RNAs und microRNAs mittels quantitativer real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Bestimmung genetischer Expressionsprofile in C. elegans Verwenden Microarray-und Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...