Collaborative Research Agreement zwischen NCI und Calidris Therapeutics;; American Cancer Society Zuschuss IRG 97-152-17 auf OT und Bundesmittel aus dem Diese Arbeit wurde teilweise durch die Interne Research Program des NIH, National Cancer Institute, Center for Cancer Research unterstützt National Cancer Institute, NIH, unter Vertrag HHSN26120080001E.

1. Herstellung von Cell Lysate Dieses Protokoll wird für adhärente Zellen, die keine GFP-Fusionsprotein bestimmt. Benötigte Zellzahl kann von so niedrig wie 10 6 bis zu 20 x 10 6 Zellen je nach dem Niveau der Proteinexpression. Zum Beispiel wurde Lysat von HEK-Zellen überexprimiert GFP-STAT3 durch Behandlung von Zellen in 10 T75-Flaschen gezüchtet nahe 70% Konfluenz mit 1 ml Lysepuffer. Dies hatte jedoch Lysat verdünnt 150-fache auf optimale Niveau der Fluoreszenz für MST Experiment zur Verfügung zu stellen. Zell-Lyse-Protokoll hängt stark von den Eigenschaften und der intrazellulären Lokalisation des Proteins ab. Bei der Verwendung von Reinigungsmitteln ist wegen der Instabilität Protein unerwünscht, Beschallung unten beschrieben, könnte die beste Wahl sein. Verschiedene Additive zum Lysepuffer Proteinmodifizierung Reaktionen verhindern kann hinzugefügt werden: EDTA verhindert die Phosphorylierung hemmt Natriumvanadat Protein-Tyrosin-Phosphatasen, sodium Fluorid ist ein Inhibitor der Serin / Threonin-Phosphatasen. <ol><li> Bereiten Lysepuffer. Für einfach zu extrahieren zytoplasmatische Proteine ​​der folgenden Zusammensetzung funktioniert gut: 25 mM Tris HCl, pH 8,0, und Proteaseinhibitorcocktail 100-fach verdünnt (Sigma-Aldrich P2714, bestehend aus 2 mM AEBSF, 0,3 uM Aprotinin, 130 pM Bestatin, 1 mM EDTA, 14 pM E-64, 1 uM Leupeptin). Alternativ kann für weniger lösliche Proteine, kann man kommerzielle RIPA-Puffer mit Protease-Inhibitoren-Cocktail und nichtdenaturierenden Reinigungsmittel verwenden. Halten Sie den Puffer auf Eis. </li><li> Waschen der Zellen kurz mit eiskaltem PBS mit 10 ml Puffer pro T75-Flasche. Halten Zellen auf Eis für 5 min, oder bis die Zellen beginnen Lösen aus dem Kolben. Kratzen Zellen mit Zellschaber zu lösen, wenn nötig. </li><li> Die Zellen in 10 ml eiskaltem PBS und Transfer zu einem vorgekühlten 14 ml Rundkolben Zentrifugenröhrchen. </li><li> Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 400-600 g bei 4 ° C für 5 min. Kombinieren Sie mehrere Zellen aus Kolben an diesem Punkt if benötigt. </li><li> Entfernen PBS Überstand und Pellet in 200 ul eiskaltem Lysepuffer Übertragung Suspension auf eine pre gekühlt 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Halten Zellen auf Eis, um lokale Überhitzungen zu minimieren. Lyse Zellen mit 3x 10 sec Impulse Beschallung bei 30% Amplitude, mit einem 2-3 mm vorgekühlt Spitze. Halten Sie die Spitze unter der Oberfläche zu minimieren Aufschäumen. Lassen Sie diesen Schritt bei der Verwendung von Reinigungsmittel-haltigen Puffer und Inkubation auf Eis für 30 min statt. </li><li> Korrigieren Sie die Lysatlösung auf physiologische Salzkonzentration (100 mM NaCl) bei Bedarf unter Verwendung von 5 M NaCl enthalten. </li><li> Sammeln Lysate durch Zentrifugation bei etwa 26.000 × g bei 4 ° C für 10 min. </li><li> Bestimmen Sie die optimale Verdünnung Lysat (wie in Abschnitt 3 beschrieben) und Menge des Lysats für eine Titration (in der Regel rund 300 ul vorverdünnte Lysat) benötigt. </li><li> Aliquot das Lysat und an einem geeigneten Temperatur für das Protein untersucht (-80 ° C, in den meisten Fällen). </li> &lt;/ Ol&gt; 2. MST Buffer Auswahl und Vorbereitung <ol><li> Da die Protein-Ligand-Wechselwirkungen abhängig Pufferbedingungen sind, ist MST Puffer Zusammensetzung basierend auf den Eigenschaften eines bestimmten Systems gewählt. Im allgemeinen ist es vorteilhaft, mindestens zwei unterschiedlichen Puffern testen. </li><li> Bereiten 2 5x MST Puffer. Wir hatten gute Erfahrungen mit diesen beiden Kompositionen: HEPES (250 mM HEPES, pH 7,4; 25 mM MgCl 2; 500 mM NaCl; 0,25% NP-40) und Tris HCl (250 mM Tris HCl, pH 7,4; 750 mM NaCl; 50 mM MgCl 2, 0,05% Tween-20). Die Zugabe von BSA (5% in der endgültigen verbindlichen Mischung) kann verhindern, Adhäsion von Proteinen an Kunststoffrohren und Glaskapillaren. NaN 3 (0,5 mm), können ebenfalls enthalten, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern. </li></ol> 3. Bestimmung der optimalen Lysate Dilution <ol><li> Wählen Sie die LED Anregungsquelle mit der Wellenlänge λ = 470 nm auf der MST Instrument. </li><li> Legen Kapillaren mit der cell extrahieren verdünnt 2 und 10x mit MST-Puffer. </li><li> Führen Sie &quot;Find Kapillaren&quot; Operation Control Software von MST Instrument. Der optimale Bereich Fluoreszenz in verdünnten Lysats von 400 bis 1.500 Fluoreszenzeinheiten. </li></ol> 4. Bestimmung der optimalen Ligandkonzentrations Reichweite <ol><li> Die höchste Konzentration des Liganden sollte mindestens 20x höher als die erwartete Dissoziationskonstante. </li><li> Die niedrigste Konzentration Ligand sollte niedriger sein als molare Konzentration des fluoreszierenden Proteins. </li></ol> Finden Sie in der NanoTemper Technologies Konzentration Finder-Tool für den Liganden Konzentrationsbereich Schätzung. 5. Herstellung von Cell Lysate und Ligand Verdünnungen <ol><li> Setzen Sie ein Rohr Rack mit einer benötigten Anzahl (in der Regel 10-16) von 0,5 ml LoBind Zentrifugenröhrchen auf Eis. Je 25 ul MST Puffer auf der Unterseite jedes Röhrchen. In 25 ul des Liganden Stammlösung zur ersten Wannee (# 1, Ligand höchste Konzentration) und führen seriellen zweifachen Verdünnung des Liganden mit dem Rest der Rohre. Halten Sie das Rack mit Liganden Proben auf Eis. </li><li> Thaw Zelllysat langsam auf Eis. </li><li> Verdünnen Zelllysat mit MST Puffer, um den optimalen Wert des fluoreszierenden Zielprotein in der Bindungsreaktionen zu stellen. Endproteinkonzentration sollte nahe erwarteten K D oder niedriger. Es sollte eingestellt werden, um notwendige Anzahl von Fluorescence Counts in der Endlösung zu erhalten. Für die Bestimmung der GFP-STAT3-Konzentration im Lysat wurde das Instrument mit einer Hilfe von Fluorescein kalibriert. Die molare Konzentration von GFP in dem Lysat wurde unter Verwendung des Verhältnisses von Fluorescein und EGFP Quantenausbeuten, 0,85 und 0,61 sind. 15 </li></ol> 6. Microscale Thermophorese Bindungsstudien <ol><li> Wählen Sie die LED Anregungsquelle mit λ = 470 nm auf der MST Instrument. </li><li> Platz 0,5 ml LoBind Röhrchen in der tube Rack gegenüber Röhren mit Liganden Reihenverdünnung Proben. Vorsichtig 15 ul des Zelllysats an der Unterseite jedes Röhrchen. Versuchen Sie nicht, Röhrenwände berühren, um Probe zu vermeiden. </li><li> In 15 ul des Liganden Probe mit der höchsten Konzentration (# 1) in das entsprechende Röhrchen Nummer 1 mit dem Zelllysat. Gut mischen und verändern einer Pipettenspitze. Diesen Schritt mit dem Rest der Rohre mit Ausnahme des letzten, das keinen Liganden enthalten sollte. </li><li> In 15 ul MST Puffer zur letzten Röhre und gut mischen. </li><li> Füllen Sie ca. 2/3 der ersten Kapillare mit der Bindung Mischung aus Rohr # 1, kippen, um die Lösung in Richtung Zentrum bewegen, und legen Sie die Kapillare an der Kapillare Fach auf die Position # 1 (die nächste Position auf dem Tablett Öffnung) . Wiederholen Sie diesen Schritt mit dem Rest Kapillaren. Kapillar-Enden mit Wachs für mehr Experimente gesteckt werden. </li><li> Setzen Sie das Fach in der MST Instrument, und schließen Sie das Instrument Tür. </li><li> Führen Sie &quot;Find Kapillaren&quot;Befehl, damit das Instrument genauen Positionen der Kapillaren und messen Fluoreszenz der Proben. </li><li> Basierend auf dem Fluoreszenzsignalintensität, passen Sie die LED-Leistung (10 bis 100%), um es in 400-1,500 Einheiten Intervall zu bringen. </li><li> Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Start&quot;, um die Thermophorese Experiment durchzuführen. Mehr als ein IR-Laserleistung für den Versuch ausgewählt werden, um den optimalen Temperaturgradienten für das jeweilige System zu finden. Sammeln von Daten 2-3 Läufe für den gleichen Satz von Kapillaren, um die Reproduzierbarkeit der Messungen zu gewährleisten. Es dauert 10-12 min zu einem Satz von 16 Kapillaren ausgeführt. </li></ol> 7. Microscale Thermophorese Data Analysis <ol><li> Öffnen Sie die Analyse-Software. </li><li> Laden Sie das Projekt Ordner. Im Run-Viewer erschien Informationen zu einem bestimmten IR Laserleistung thermophoretische Kurven gesammelt wählen. Es gibt eine Option der Eröffnung alle thermophoretische Spuren unter verschiedenen Bedingungen wie IR Laserleistung gesammelt, LED-power, Temperatur, Konzentration, etc.. auf einmal auswählen und dann alle Kurven für die Analyse, indem er sie ein und aus (auf das Experiment den Namen klicken). </li><li> In die Beurteilung Punkte Graph Fenster, wählen Sie die Thermophorese oder Thermophorese mit T-Sprung. Stellen Sie sicher, dass blaue und rote Linien korrekt positioniert sind. Um die gemittelten Punkte mit Standardabweichungen zu erhalten, wählen Sie &quot;Durchschnitt&quot; oder &quot;Unterscheiden läuft&quot; für Läufe. </li><li> Um eine Dissoziationskonstante fit plotten, wählen Sie &quot;Average&quot;, geben und fixieren Sie die markierten Molekül Konzentration Wert (überprüfen Sie die &quot;Konzentration&quot; Quadrat in einem Anfall Fenster-Menü), und passen Sie die Kurve. Die K D-Wert mit seiner Standardabweichung wird in einem separaten Informationen Popup-Fenster. Um eine Anpassung mithilfe Hill Verfahren plotten, wählen Sie &quot;Average&quot;, Hill Verfahren, und dann passen die Kurve. Der EC 50-Wert mit seiner Affinität Standardabweichung wird in diesem Fall gezeigt. Das Merkmal der K D oder Hill &quot;border&quot; kann auch genutzt werden, wenn Sättigung werdenin einem gebundenen Zustand nicht erreicht wird. </li><li> Speichern Sie die durchschnittliche fit Daten in einer Textdatei und Transfer zu Excel. </li><li> Plot F norm (normalisierte Fluoreszenz), AF Norm (Differenz in normalisierten Fluoreszenz, wenn verschiedene Experimente verglichen werden), oder die Fraktion gebunden (siehe Formel unten) als Funktion des unmarkierten (titriert)-Molekül Konzentration. </li></ol> Gebundene Fraktion (Fraktion der Moleküle in einem Komplex) = (Therm (C)-ungebunden) / (gebundene-ungebunden), wo Therm (C) ist Thermophorese für die Konzentration C gemessen wird, ist ungebunden Thermophorese für die ungebundenen Zustand (wenn Moleküle sind nicht in einem Komplex) und gebunden ist Thermophorese für den vollständig gebundenen Zustand.

<ol>
	<li>Lea, W. A., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+polarization+assays+in+small+molecule+screening.">Fluorescence polarization assays in small molecule screening.</a> Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).</li><li>Willander, M., Al-Hilli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+biomolecules+using+surface+plasmons.">Analysis of biomolecules using surface plasmons.</a> Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).</li><li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+assays+at+equilibrium:+validation+and+interpretation.">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> Br. J. Pharmacol. 161, 1219-1237 (2010).</li><li>Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+isothermal+titration+calorimetry+in+pure+and+applied+research--survey+of+the+literature+from+2010.">Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010.</a> J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).</li><li>Vuignier, K., Schappler, J., Veuthey, J. L., Carrupt, P. A., Martel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-protein+binding:+a+critical+review+of+analytical+tools.">Drug-protein binding: a critical review of analytical tools.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. , 398-3953 (2010).</li><li>Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+analytical+ultracentrifugation+in+protein+science:+a+tutorial+review.">Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review.</a> Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).</li><li>Duhr, S., Braun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+molecules+move+along+a+temperature+gradient.">Why molecules move along a temperature gradient.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 19678-19682 (2006).</li><li>Zillner, K., Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+thermophoresis+as+a+sensitive+method+to+quantify+protein:+nucleic+acid+interactions+in+solution.">Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution.</a> Methods Mol. Biol. 815, 241-252 (2012).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nat. Commun. 1, 100 (2010).</li><li>Stark, G. R., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK-STAT+pathway+at+twenty.">The JAK-STAT pathway at twenty.</a> Immunity. 36, 503-514 (2012).</li><li>Ehret, G. B., Reichenbach, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+binding+specificity+of+different+STAT+proteins.+Comparison+of+in+vitro+specificity+with+natural+target+sites.">DNA binding specificity of different STAT proteins. Comparison of in vitro specificity with natural target sites.</a> J. Biol. Chem. 276, 6675-6688 (2001).</li><li>Yang, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+unphosphorylated+STATs+in+signaling.">Roles of unphosphorylated STATs in signaling.</a> Cell Res. 18, 443-451 (2008).</li><li>Timofeeva, O. A., Chasovskikh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+unphosphorylated+STAT3+transcription+factor+binding+to+DNA.">Mechanisms of unphosphorylated STAT3 transcription factor binding to DNA.</a> J. Biol. Chem. 287, 14192-14200 (2012).</li><li>Timofeeva, O. A., Tarasova, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+suppresses+transcription+of+proapoptotic+genes+in+cancer+cells+with+the+involvement+of+its+N-terminal+domain.">STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).</li><li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+spectra.">Fluorescent protein spectra.</a> J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben. Der Inhalt dieser Veröffentlichung gibt nicht unbedingt die Ansichten oder Strategien des Department of Health and Human Services, noch Erwähnung von Handelsnamen, kommerziellen Produkten oder Organisationen die Billigung durch die US-Regierung.

Proteinexpression und-reinigung ist aufwendig und teuer Schritt, das ist jedoch notwendig, zur Bestimmung der Wechselwirkungen &#39;K D von den meisten derzeit verwendeten Verfahren. Anwendung von MST ermöglicht die Vermeidung Proteinreinigung damit deutlich vereinfacht und beschleunigt quantitative Charakterisierung von Wechselwirkungen. Es stellt besonders deutliche Vorteile bei schwer Expression und Aufreinigung von Proteinen, wie Membranproteine ​​und Transkriptionsfaktoren. <p class="jove_conten...

Quantitative Charakterisierung der Affinität von intermolekularen Wechselwirkungen ist in vielen Bereichen der biomedizinischen Forschung wichtig. Binding Dissoziationskonstante (K D) ist wichtig, nicht nur in der Wirkstoffforschung, sondern ist auch ein wichtiger Parameter bei der Charakterisierung eines binären Wechselwirkung in einem biologischen System. Biochemische Methoden zum Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen eingesetzt werden, wie Immunpräzipitation und Hefe-Zwei-Hybrid-Screens, uns nicht informieren, wie eng sind diese Wechselwirkungen, während Affinität definiert, ob diese besondere Komplex unter gegebenen Bedingungen in vivo vorliegt. In Drug Discovery-Prozess, ist bindend Assay-Entwicklung eine der notwendigen und häufig den zeitaufwendigen Schritte. Die am häufigsten verwendeten Methoden der K D Bestimmung gehören Fluoreszenz Polarisation, 1 Oberflächen-Plasmon-Resonanz (SPR)-Technologie, 2 Radioligandenbindung, 3 isothermen Titrationskalorimetrie, 4 Gleichgewichtsum Dialyse (ED), 5 Ultrafiltration (UF), 5 und Ultrazentrifugation (UC). 6 Alle von ihnen erfordern erhebliche Mengen von gereinigtem Zielprotein. Microscale Thermophorese (MST) ist eine sich schnell entwickelnde Verfahren die gerichtete Bewegung von Molekülen in einem mikroskopischen Temperaturgradienten ermittelt. Änderungen der Hydrathülle von Biomolekülen zu einer relativen Änderung der Bewegung entlang des Temperaturgradienten. 7 MST wird verwendet, um Bindungsaffinitäten zu bestimmen und ist für die Untersuchung Ligandenbindung an fluoreszenzmarkierten Proteinen oder fluoreszierenden Liganden an ein Zielprotein angewendet. 8, 9 MST ermöglicht die Messung von Wechselwirkungen direkt in Lösung ohne die Notwendigkeit der Immobilisierung auf einer Oberfläche (Immobilisierung-freie Technik). Praktisch ist jede Bindung durch eine Änderung in der MST-Signal begleitet, obwohl die Größe der Veränderung unterscheidet sich von System zu System deutlich. Für den Nachweis von Molekülen durch Bewegung MST, haben sie zu fluoreszierennt. Diese wesentliche Einschränkung des Verfahrens kann in einen Vorteil ausgeschaltet werden. Wenn ein Protein als ein GFP-Fusionsprotein in einem System exprimiert wird, wird es das einzige fluoreszierende Molekül sein und kann somit ohne Isolierung aus dem Zelllysat oder zellfreies Expressionssystem untersucht werden. Generierung von Zelllysaten, die für die Bindung Bedingungen erlauben mit minimalen Artefakten ist die große Herausforderung. Hier beschreiben wir ein Protokoll Zelllysat Vorbereitung und MST Experiment, das für viele lösliche und Membranproteinen verwendet werden können. STAT-Proteine ​​zytoplasmatischen Transkriptionsfaktoren Tyrosinphosphorylierung in Reaktion auf extrazelluläre Signale aktiviert sind latent und werden in vielen biologischen Prozessen einschließlich Immunität, Hämatopoese, Entzündung und Entwicklung. 10 In Säugetieren beteiligt besteht der STAT-Familie STAT 1, 2, 3, 4 5A, 5B und 6. Alle aktivierten STATs bekannt sind, um zu der gleichen DNA-Sequenz zu binden, sogenannten GAS-Motiv, IFN-gamma-Sequenz aktiviert. Allerdings ist die transcriptional Auswirkungen verschiedener STATs sind sehr unterschiedlich. 11 Trotz der Beteiligung an vielen pathologischen Prozessen und umfangreiche Untersuchungen was als 17.000 Publikationen wurden die K D von STAT Wechselwirkungen mit anderen DNA-Sequenzen nicht bestimmt worden. Nur relative Affinität von verschiedenen STATs Varianten von GAS Motiv charakterisiert worden. Schwierigkeiten in 11 Proteinexpression und-reinigung sind die größten Hindernisse bei der Charakterisierung von STATs &#39;DNA-Bindung Selektivität. Obwohl die Mehrzahl der Studien über die Rolle der &quot;aktivierten&quot; stats, die ein Synonym für Tyr-phosphorylierten Transkriptionsfaktor wurde, die Rolle der nicht-phosphorylierten STATs (U-Stats) bei der Regulation der Transkription konzentriert haben sich rasch. Jedoch 12, Diese Mechanismen werden kaum verstanden, und es war unklar, ob U-STATs tatsächlich an DNA binden oder wirken durch Wechselwirkungen mit anderen Transkriptionsfaktoren. Wir haben kürzlich gezeigt, dass U-STAT3 an DNA binden sequences anders GAS Motive mit noch höherer Affinität. 13. Der Befund hat erhebliche Auswirkungen für unser Verständnis der biologischen Funktionen dieses wichtigen Proteins. Wir haben Mikrobereich Thermophorese zu relativen Affinitäten von STAT3 zu GAS bestimmen aufgebracht und AT-reiche Oligonukleotid S +100 (Abbildung 4). Nahezu identische Protokoll wurde für K D Bestimmung wurde für die Bindung von einem anderen STAT3 Ligand, ein Lipopeptid-Hemmer. 14 keine Bindung an eine verbundene Transkriptionsfaktor, GFP-STAT1, das als negative Kontrolle verwendet wurde nachgewiesen werden konnte bestätigt damit die Selektivität der Wechselwirkung werden. 14

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RIPA buffer</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>20-188</td>
 <td>Other manufacturer's buffers work as well</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease inhibitors cocktail</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P2714</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>G008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Capillary Tray</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>T001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>K002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Control software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>2.0.2.29</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Analysis software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>1.4.27</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Table-top refrigerated centrifuge</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>5417R</td>
 <td>Other microtube refrigerated centrifuges</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protein LoBind Tube 0.5 ml</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>22431064</td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis

Quantitative Charakterisierung von Protein-Wechselwirkungen ist wichtig, in praktisch jedem Bereich der Biowissenschaften, insbesondere der Wirkstoffforschung. Die meisten der derzeit verfügbaren Methoden der K D Bestimmung benötigen Zugriff auf gereinigtes Protein von Interesse, die Erzeugung von denen zeitaufwändig und teuer werden kann. Wir haben ein Protokoll, das zur Bestimmung der Bindungsaffinität von mikroskaligen Thermophorese (MST) ermöglicht ohne Reinigung des Zielproteins aus Zelllysaten entwickelt. Das Verfahren beinhaltet die Überexpression des GFP-Fusionsprotein und Zell-Lyse in nicht-denaturierenden Bedingungen. Anwendung des Verfahrens zur STAT3-GFP transient in HEK293 Zellen erlaubt erstmals die Affinität der gut untersuchten Transkriptionsfaktors an Oligonukleotide mit verschiedenen Sequenzen bestimmen ausgedrückt. Das Protokoll ist einfach und kann eine Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten für auf Interaktionen von Proteinen mit kleinen Molekülen, Peptiden, DNA, RNA haben und proteins.

Messung der Affinität der nicht-phosphorylierten STAT3-Protein-Bindung an Oligonukleotide. HEK293-Zellen, die STAT3-GFP wurde als eine Quelle von fluoreszenzmarkierten STAT3 für DNA-Bindungstest verwendet. Zelllysate wurden unter Verwendung RIPA Puffer (20x10 6 Zellen / ml). Für Bindungsstudien wurden die Lysate verdünnt 150x mit MST DNA-Bindungspuffer auf das optimale Niveau des fluoreszierenden Proteins in der Bindungsreaktion (etwa 20 nm) zu liefern. Nicht-tra...

Watch this Scientific Journal Video about Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis at JoVE.com

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Microscale Thermophorese (MST) kann in weiten Bereichen zur Bestimmung der Bindungsaffinität werden ohne Reinigung des Zielproteins aus Zelllysaten. Das Protokoll umfasst die Überexpression des GFP-Fusionsprotein, Zell-Lyse in nicht-denaturierenden Bedingungen, sowie Erkennung MST Signal in der Gegenwart von variierenden Konzentrationen des Liganden.

Protein Purification-freie Methode der Bindungsaffinität Bestimmung durch Microscale Thermophorese

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

protein-purification-free-method-binding-affinity-determination

Research

JoVE Journal

Biology

30.3K Aufrufe.  National Cancer Institute. Microscale Thermophorese (MST) kann in weiten Bereichen zur Bestimmung der Bindungsaffinität werden ohne Reinigung des Zielproteins aus Zelllysaten. Das Protokoll umfasst die Überexpression des GFP-Fusionsprotein, Zell-Lyse in nicht-denaturierenden Bedingungen, sowie Erkennung MST Signal in der Gegenwart von variierenden Konzentrationen des Liganden.

Serie: Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

Mikrovolumen Proteinkonzentrationsbestimmung mit dem NanoDrop 2000c Spektrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Forschung

Biologie

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

Die Bedeutung der richtigen Protein-Konzentration für Kinetik und Affinity Bestimmung in Struktur-Funktions-Analyse

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

Isolierung von Labile Multi-Protein-Komplexe durch In vivo Kontrollierte Cellular Cross-Linking und Immuno-magnetische Affinitätschromatographie

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR-Clip - Ein Verfahren zur Transkriptom-weiten die Bindungsstellen des RNA-bindende Proteine ​​Identifizieren

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

Lipidvesikel-vermittelte Affinitätschromatographie unter Verwendung von Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): Eine neue Methode zur Protein-Lipid-Wechselwirkungen Analyze

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Orthogonal Protein Purification von einer kleinen Bispezifische Affinity Tag Facilitated

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identifizierung von Protein Interaktionspartner mittels Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs. Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and specific carrier of vitamin A in the blood. Here we describe an optimized technique to produce and purify holo-RBP and two real-time monitoring techniques to study the transport of vitamin A by the high-affinity RBP receptor STRA6. The first technique makes it possible to produce a large quantity of high quality holo-RBP (100%-loaded with retinol) for vitamin A transport assays. High quality RBP is essential for functional assays because misfolded RBP releases vitamin A readily and bacterial contamination in RBP preparation can cause artifacts. Real-time monitoring techniques like electrophysiology have made critical contributions to the studies of membrane transport. The RBP receptor-mediated retinol transport has not been analyzed in real time until recently. The second technique described here is the real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol release or loading. The third technique is real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol transport from holo-RBP to cellular retinol binding protein I (CRBP-I). These techniques provide high sensitivity and resolution in revealing RBP receptor's vitamin A uptake mechanism.

Here we describe an optimized technique to produce high-quality vitamin A/RBP complex and two real-time monitoring techniques to study vitamin A transport by STRA6, the RBP receptor.

Real-time Analyse von Retinol Transport durch die Membran-Rezeptor von Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

Ein Protokoll für die Phagen-Display-und Affinity Auswahl mit rekombinantem Protein-Köder

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing myocardial infarction (MI) is largely driven by detecting cardiac-specific proteins in patients' serum or plasma as an indicator of myocardial injury. Having recently shown that cardiac myosin binding protein-C (cMyBP-C) is detectable in the serum after MI, we have proposed it as a potential biomarker for MI. Biomarkers are typically detected by traditional sandwich enzyme-linked immunosorbent assays. However, this technique requires a large sample volume, has a small dynamic range, and can measure only one protein at a time.	
Here we show a multiplex immunoassay in which three cardiac proteins can be measured simultaneously with high sensitivity. Measuring cMyBP-C in uniplex or together with creatine kinase MB and cardiac troponin I showed comparable sensitivity. This technique uses the Meso Scale Discovery (MSD) method of multiplexing in a 96-well plate combined with electrochemiluminescence for detection. While only small sample volumes are required, high sensitivity and a large dynamic range are achieved. Using this technique, we measured cMyBP-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I levels in serum samples from 16 subjects with MI and compared the results with 16 control subjects. We were able to detect all three markers in these samples and found all three biomarkers to be increased after MI. This technique is, therefore, suitable for the sensitive detection of cardiac biomarkers in serum samples.

Measuring biomarkers in complex biological samples is increasingly guiding clinical decision-making. We describe a highly sensitive method to simultaneously measure cardiac myosin binding protein-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I in serum samples from subjects with myocardial infarction and healthy control subjects.

Eine empfindliche und spezifische Quantifizierung Methode zur Bestimmung der Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C durch Elektrochemilumineszenz Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...