Diese Arbeit wird durch einen Zuschuss von US-amerikanischen National Science Foundation an Christoph Benning unterstützt.

1. Lipidextraktion <ol><li> Begin Lipidextraktion durch die Ernte 30 mg 4-Wochen alten Arabidopsis Blättern von Pflanzen auf Agar verfestigtem Medium oder Boden und überführen sie in 1,5 ml Polypropylen Reaktionsrohre. Frische Blätter können in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C. </li><li> Geben Sie 300 ul Extraktionsmittel Methanol zusammen, Chloroform und Ameisensäure (20.10.01, v / v / v) zu jeder Probe. Kräftig schütteln (mit einem Farbschüttler oder ähnliches) für 5 Minuten. </li><li> Fügen Sie 150 ul 0,2 M Phosphorsäure (H 3 PO 4), 1 M Kaliumchlorid (KCl) und kurz vortexen. </li><li> Zentrifuge bei 13.000 xg bei Raumtemperatur für 1 Minute. Lipide in der unteren Chloroformphase aufgelöst wird auf DC-Platten entdeckt werden. </li></ol> 2. Dünnschicht-Chromatographie (TLC) 15 <ol><li> Zur Vorbereitung DC-Platten, vorgeschla-20cmx20cm Kieselgels DC-Platte mit dem Laden Streifen für 30 sec in 0,15 M Ammoniumsulfat ((NH 4) 2 SO 4)-Lösung, nach dem Untertauchen für 30 Sekunden, trocknen Sie die Platte für mindestens 2 Tage in einem abgedeckten Behälter. Während der Aktivierung der Sublimation von Ammonium hinterlässt Schwefelsäure, die Phosphatidylglycerin, die für ihre Trennung von anderen Glycerolipide protoniert. </li><li> Am Tag des Experiments, TLC aktivieren Platten durch Backen im Ofen bei 120 ° C für 2,5 Stunden. </li><li> Nach dem Abkühlen der aktivierten Platten auf Raumtemperatur, mit einem Bleistift eine gerade Linie (1,5 cm vom Rand der Platte) über die Platte ziehen am Ursprung des Chromatogramms. </li><li> In einem Abzug langsam liefern 3 X 20 ul der Lipid-Extrakt in der unteren Chloroformphase mit einer 20 ul Pipette mit 200 ul gelbem Kunststoff Tipps unter einem langsamen Strom von N 2. Zu diesem Zweck ist ein Tygon Schlauch an den Regler des N 2 Tank verbunden. Halten Sie die Stelle kleiner als 1 cm im Durchmesser. Jede Platte kann bis zu 10 Proben (wenn nachfolgende GLC-Analyse geplant ist). </li><li> Da die Lipid-spots ganz trocken in der Abzugshaube, bereiten den Entwicklungsländern Lösungsmittel Aceton, Toluol, Wasser (91 mL: 30 mL: 7,5 mL) zusammen. Wenn die Umgebungstemperatur relative Luftfeuchtigkeit ist hoch, könnte Trennung betroffen sein. In diesem Fall Wasser sollte reduziert (91 mL: 30 mL: 7,0 mL) geben werden, um die gewünschte Trennung zu erreichen. </li><li> Gießen Sie 80 mL der Entwicklung in eine verschließbare TLC Entwicklung Kammer (L: H: W = 27,0: 26,5: 7,0, cm / cm / cm) Lösungsmittel und legen Sie die Platte in den Tank mit der Probe Ende nach unten zeigt. Seal den Tank mit der Klemme. Das Lösungsmittel wird wieder aufsteigen der Platte und Lipiden getrennt werden. Die Entwicklungszeit beträgt etwa 50 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Wenn das Lösungsmittel vor hat 1 cm vom oberen Rand der Platte erreicht, entfernen Sie vorsichtig die Platte aus dem Tank und vollständig trocknen in den Abzug, der für etwa 10 Minuten. </li><li> Lipide durch TLC getrennt werden kann entweder reversibel kurz mit Jod für eine quantitative Analyse oder irreversibel gefärbt mit Schwefelsäure oder α-Naphthol gefärbt. <ol><li> Schwefelsäure Verkohlung: Sprühen Sie den Teller mit 50% iger Schwefelsäure in Wasser in einem Glas-Sprühflasche in der Abzugshaube und backen bei 120 ° C für 15 Minuten (Abbildung 2A). </li><li> α-Naphthol Färbung für Glykolipide: Sprühen Sie den Teller mit 2,4% (w / v) α-Naphthol in 10% (v / v) Schwefelsäure, 80% (v / v) Ethanol und backen bei 120 ° C für 3-5 Minuten, bis Glycolipid Bands gefärbt rosa oder violett (Abbildung 2B). Übertherapie wird aller Lipide aufgrund des Vorhandenseins von Schwefelsäure im Reagenz Verkohlung führen. </li><li> Iodfärbung: in einer Abzugshaube wird die Platte in einen geschlossenen Behälter mit TLC Iodkristalle (in einem Fach auf der Unterseite führen zur Sättigung der Atmosphäre mit Joddampf bis Lipide sichtbar sind). Setzen Sie die Platte an Jod zu lange Jod kann kovalent modifizieren mehrfach ungesättigten Fettsäuren (Abbildung 2C). Alternativ zu vermeiden Oxidation von Lipiden, nur Standard-Spuren mit Proben Spuren durchsetzt gebeizt sollte mit einem Glaswolle gesteckt Pasteurpipette mit Jod Kristalle, durch die N 2 über einzelne Standard-Bahnen geblasen wird. </li></ol></li></ol> 3. Fatty Acyl Methylester (FAME) Reaktion 16 <ol><li> Entfernen Kieselsäure Umgebung identifiziert Lipid-Spots aus der DC-Platte mit einer Rasierklinge. Kratzen Sie die Lipid-Gehalt an Kieselsäure und übertragen Sie die Silica-Pulver mit einem Trichter in ein Glasrohr mit einem Teflon (PTFE)-gesäumten Schraubverschluss. </li><li> 1 ml 1 N Salzsäure (HCl) in wasserfreiem Methanol zu jeder Probe durch Glaspipette. </li><li> Geben Sie 100 ul 50 ug mL -1 Pentadecansäure (15:0) mit 200 ul Pipette zu jeder Probe als interner Standard mit einem 200-ul-Pipette mit 200 ul gelbe Spitze aus Kunststoff. Halten Sie ein Rohr mit nur pentadecenoic Säure in methanolischer HCl als Kontrolle. Close Glasröhren dicht mit Teflon ausgekleideten Kappen. </li><li> Inkubieren glass Röhrchen in einem 80 ° C Wasserbad für 25 Minuten. Tubes müssen abgedichtet werden, so dass das Lösungsmittel nicht verdampft. </li><li> Nach Rohre abgekühlt haben, fügen Sie 1 mL 0,9% Natriumchlorid mit 1 mL Hexan und kräftig vortexen gefolgt. Centrifuge Proben bei 1000xg für 3 Minuten. </li><li> In der Abzugshaube, entfernen Sie die Hexan / obere Schicht der Probe mit Pasteurpipette und legen Sie sie in eine neue 13x100 mm Glasrohr. </li><li> Dampft Hexan unter einem langsamen Strom von N 2 ohne Trocknung vollständig. </li><li> Lösen Sie die resultierende Fettacyl Methylester s in 60 ul Hexan. Transfer-Proben in Autosampler-Vials und fest verschließen. Die Proben können bei 4 ° C für die kurzfristige und -20 ° C für ein paar Tage gelagert werden. </li></ol> 4. Gas-Flüssigkeits-Chromatographie (GLC) 10 <ol><li> Vor Beginn der GLC, sicher, dass das Helium, Wasserstoff und Luft Flaschen gefüllt werden. </li><li> Ausreichende Hexan müssen, um das Lösungsmittel-Reservoir aufgenommen werden und die Abfallbehälter müssen leer sein. Für Fettacyl Methylester Trennung, fügen Sie eine DB-23 Säule an der Maschine. </li><li> Legen Flaschen in den Autosampler. Starten Sie den Chemstation Software für GLC auf dem System Computer. </li><li> Stellen Sie die Vorlauftemperatur bei 250 ° C mit Helium Durchfluss mit 48,6 mL min -1 und der Druck bei 21,93 psi. Das Teilungsverhältnis beträgt 30,0: 1. </li><li> Die Ofentemperatur wird zunächst bei 140 ° C für 2 min eingestellt und raiste auf 160 ° C mit einer Rate von 25 ° C min -1. Dann die Temperatur auf 160 ° C ansteigen zu 250 ° C mit einer Rate von 8 ° C min -1 und halten bei 250 ° C für 4 min durch einen Rückgang um 140 ° C mit einer Rate von 38 ° C min - 1. Ein Run dauert ca. 21 Minuten. </li><li> Die Temperatur der Flammenionisationsdetektor ist 270 ° C mit einem Wasserstoff-Volumenstrom von 30,0 mL min -1, Luftdurchsatz von 400 mL min -1 und Helium Durchfluss bei 30,0 mL min -1. </li><li> Geben Sie die Anzahl der Fläschchen und Probe Namen in der Ablaufreihenfolge Tisch. Stellen Sie die 10 l Injektor zu 2 ul Probe pro Flasche zu injizieren. </li><li> Wenn das Instrument fertig ist, starten Sie die Ablaufreihenfolge. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Beispiele für irreversible Verfärbung der TLC-Trennung Lipide aus 4-Wochen alten Arabidopsis-Keimlinge sind in Abbildung 2 dargestellt. Die Schwefelsäure gebeizt Lipiden (Abbildung 2A) sind verkohlt und erscheinen als braune Flecken. α-Naphthol wird bevorzugt, Glycolipide wie MGDG Fleck, DGDG, SQDG etc. Glycolipide mit α-Naphthol tragen eine rosa-lila Farbe, während andere polare Lipide Fleck gelb (Abbildung 2B) gefärbt. Das Jod-Färbung ist reversibel und ermöglicht Lipide eine gelbliche Farbe, die über einen kurzen Zeitraum wie Jod verdunstet (Abbildung 2C) verschwinden. Kurz Jod gefärbt Lipide können zur GLC-Analyse unterzogen werden, obwohl ungefärbten Lipide vorzuziehen reduzieren Abbau von Lipiden sind. Wenn dies geschehen ist erfolgreich, wird markante Signale, die verschiedene Fatty Acyl-Methylester nach GLC beobachtet werden (Abbildung 3). Fatty Acyl-Methylester mit kürzeren Kohlenstoffkette und weniger Doppelbindungen haben kürzere Verweildauer mit dem DB-23 Säule. Fatty Acyl-Methylester-Profiling ist ein empfindliches Werkzeug, um Mutanten mit veränderten Lipid-Zusammensetzung zu identifizieren. In Abbildung 4, die MGDG18: ist 3-Fettsäure-Molverhältnis in der tgd4-1-Mutante im Vergleich zum Wildtyp-Typ 18 verringert. Durch die Aufteilung der Mole von Fatty Acyl-Methylester für eine Lipid-Klasse mit der Mole aller Lipidklassen sind das Molverhältnis von jedem Lipid berechnet. Zum Beispiel, um das Molverhältnis von MGDG berechnen: (MGDG) mol% = Σ [FAME (MGDG)] / Σ [FAME (gesamt)] x100% Die daraus resultierenden Molverhältnisse der einzelnen Lipid-Klasse sowohl aus dem Wildtyp und der Mutante verglichen werden kann. Zum Beispiel hat die tgd4-1 Mutante relativen Mengen von MGDG und PG erhöht, sondern verringert Mengen DGDG und PE (Abbildung 5) 18. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Flussdiagramm der polaren Lipid-Analyse unter Verwendung von Arabidopsis-Keimlinge. Insgesamt Lipide sind aus 4-Wochen alten Arabidopsis-Keimlinge entnommen und getrennt durch TLC. Die getrennten Lipide können von DC-Platte für die Umesterung durch GLC-Analyse gefolgt abgekratzt werden. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Trennung von Lipiden auf DC-Platten. Lipid-Extrakte von 35 mg (Frischgewicht) Wildtyp-Keimlingen sind durch TLC getrennt und gefärbt durch Schwefelsäure (A), α-Naphthol (B) oder Joddampf (C). Drei Wiederholungen sind in jeder Färbemethode gezeigt. DGDG, Digalactosyldiacylglycerol; MGDG, monogalactosyldiacylglycerol; PC, Phosphatidylcholin, PE, Phosphatidylethanolamin, PG, phosphatidylglycerol; PI, Phosphatidylinositol; SQDG, sulfoquinovosyldiacylglycerol. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. GLC-Analyse von Fettsäure-Methylester (FAME) aus MGDG des Wildtyp abgeleitet. FAME sind auf einer 30 m Kapillarsäule aufgetrennt und durch Flammenionisationsdetektor. Pentadecansäure (15:0) wird als interner Standard verwendet. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Fettsäure-Profil MGDG im Wildtyp Col2 (weiße Säulen) und die tgd4-1-Mutante (schwarze Säulen). Fettsäuren sind als die Anzahl der Kohlenstoffatome durch die Anzahl der Doppelbindungen, gefolgt vorgestellt. Drei Wiederholungen gemittelt und Standardabweichungen dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Polar Lipide Zusammensetzung des Wildtyp Col2 (weiße Säulen) und die tgd4-1-Mutante (schwarze Säulen). Drei Wiederholungen gemittelt und Standardabweichungen sind durch Fehlerbalken dargestellt.

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	<li>Ajjawi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+reverse+genetics+in+Arabidopsis:+case+studies+from+the+Chloroplast+2010+Project.">Large-scale reverse genetics in Arabidopsis: case studies from the Chloroplast 2010 Project.</a> Plant Physiol. 152, 529-529 (2010).</li><li>Andersson, M. X., Kjellberg, J. M., Sandelius, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+cytosolic+lipases+in+converting+phosphatidyl+choline+to+substrate+for+galactolipid+synthesis+in+the+chloroplast+envelope.">The involvement of cytosolic lipases in converting phosphatidyl choline to substrate for galactolipid synthesis in the chloroplast envelope.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1684, 46-46 (2004).</li><li>Awai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phosphatidic+acid-binding+protein+of+the+chloroplast+inner+envelope+membrane+involved+in+lipid+trafficking.">A phosphatidic acid-binding protein of the chloroplast inner envelope membrane involved in lipid trafficking.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, e10817-e10817 (2006).</li><li>Benning, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+lipid+transport+involved+in+organelle+biogenesis+in+plant+cells.">Mechanisms of lipid transport involved in organelle biogenesis in plant cells.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 25, 71-71 (2009).</li><li>Browse, J., McCourt, P. J., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+composition+of+leaf+lipids+determined+after+combined+digestion+and+fatty+acid+methyl+ester+formation+from+fresh+tissue.">Fatty acid composition of leaf lipids determined after combined digestion and fatty acid methyl ester formation from fresh tissue.</a> Anal. Biochem. 152, 141-141 (1986).</li><li>Dormann, P., Balbo, I., Benning, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+galactolipid+biosynthesis+and+lipid+trafficking+mediated+by+DGD1.">Arabidopsis galactolipid biosynthesis and lipid trafficking mediated by DGD1.</a> Science. 284, 2181-2181 (1999).</li><li>Guskov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+photosystem+II+at+2.9-A+resolution+and+the+role+of+quinones,+lipids,+channels+and+chloride.">Cyanobacterial photosystem II at 2.9-A resolution and the role of quinones, lipids, channels and chloride.</a> 16, 334-334 (2009).</li><li>Hartel, H., Dormann, P., Benning, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DGD1-independent+biosynthesis+of+extraplastidic+galactolipids+after+phosphate+deprivation+in+Arabidopsis.">DGD1-independent biosynthesis of extraplastidic galactolipids after phosphate deprivation in Arabidopsis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 10649-10649 (2000).</li><li>James, A. T., MARTIN, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-liquid+partition+chromatography;+the+separation+and+micro-estimation+of+volatile+fatty+acids+from+formic+acid+to+dodecanoic+acid.">Gas-liquid partition chromatography; the separation and micro-estimation of volatile fatty acids from formic acid to dodecanoic acid.</a> Biochem. J. 50, 679-679 (1952).</li><li>Jordan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+cyanobacterial+photosystem+I+at+2.5+A+resolution.">Three-dimensional structure of cyanobacterial photosystem I at 2.5 A resolution.</a> Nature. 411, 909-909 (2001).</li><li>Kobayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type-B+monogalactosyldiacylglycerol+synthases+are+involved+in+phosphate+starvation-induced+lipid+remodeling,+and+are+crucial+for+low-phosphate+adaptation.">Type-B monogalactosyldiacylglycerol synthases are involved in phosphate starvation-induced lipid remodeling, and are crucial for low-phosphate adaptation.</a> Plant J. 57, 322-322 (2009).</li><li>Lu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+ATPase+protein+of+Arabidopsis,+TGD3,+involved+in+chloroplast+lipid+import.">A small ATPase protein of Arabidopsis, TGD3, involved in chloroplast lipid import.</a> J. Biol. Chem. 282, 35945-35945 (2007).</li><li>Ohlrogge, J., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+biosynthesis.">Lipid biosynthesis.</a> Plant Cell. 7, 957-957 (1995).</li><li>Stahl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatography;+methods,+influencing+factors+and+an+example+of+its+use.">Thin-layer chromatography; methods, influencing factors and an example of its use.</a> Pharmazie. 11, 633-633 (1956).</li><li>Stoffel, W., INSULL, W., AHRENS, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-liquid+chromatography+of+highly+unsaturated+fatty+acid+methyl+esters.">Gas-liquid chromatography of highly unsaturated fatty acid methyl esters.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 99, 238-238 (1958).</li><li>Welti, R., Wang, X., Williams, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry+scan+modes+for+plant+chloroplast+lipids.">Electrospray ionization tandem mass spectrometry scan modes for plant chloroplast lipids.</a> Anal. Biochem. 314, 149-149 (2003).</li><li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+trafficking+between+the+endoplasmic+reticulum+and+the+plastid+in+Arabidopsis+requires+the+extraplastidic+TGD4+protein.">Lipid trafficking between the endoplasmic reticulum and the plastid in Arabidopsis requires the extraplastidic TGD4 protein.</a> Plant Cell. 20, 2190-2190 (2008).</li><li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+the+TGD1+chloroplast+envelope+protein+affects+phosphatidate+metabolism+in+Arabidopsis.">Mutation of the TGD1 chloroplast envelope protein affects phosphatidate metabolism in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 17, 3094-3094 (2005).</li><li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+permease-like+protein+involved+in+ER+to+thylakoid+lipid+transfer+in+Arabidopsis.">A permease-like protein involved in ER to thylakoid lipid transfer in Arabidopsis.</a> EMBO J. 22, 2370-2370 (2003).</li></ol>

TLC gekoppelt mit GLC bietet eine robuste und schnelle Werkzeug für die quantitative Analyse von polaren Lipiden in Pflanzen. Kleine Veränderungen in Lipid-Zusammensetzung identifiziert werden können, daher hat diese Methode für große Screening von Mutanten in polaren Lipid-Stoffwechsel 1,20 beeinträchtigt worden. Diese Methode wird auch häufig für die Überwachung der Aktivitäten der Enzyme nutzen polaren Lipiden als Substrat verwendet. 2,6,7 Neben verlässt, kann die Lipid-Zusammensetzung von anderen pflanzlichen Geweben wie Wurzeln und Samen oder subzellulären Fraktionen wie Chloroplasten und Mitochondrien auch in der gleichen Weise bestimmt werden. Das Lösungsmittel-System (Aceton, Toluol, Wasser) ist hier für die Trennung von Glycolipiden und Phospholipiden in Pflanzen optimiert. Doch in tgd1, 2,3,4-Mutanten und isolierten Chloroplasten läuft TGDG zusammen mit PE während tetragalactosyldiacylglycerol läuft mit PC. In diesem Fall wird ein Lösungsmittel mit Chloroform, Methanol, Essigsäure und Wasser (85: 20: 10: 4, v / v / v / v) wird 13 verwendet. Manchmal zweidimensionale TLC mit zwei verschiedenen Lösungsmittel-Systeme ist es, weitere separate Glycolipide und Phospholipide 19 durchgeführt. Darüber hinaus können pflanzliche Gewebe direkt auf die FAME Reaktion durch GLC gefolgt, um den gesamten Fettsäuregehalt Profil ohne anfängliche Trennung auf TLC 5 zu bestimmen unterzogen werden. Neben dem Beweis TLC-GLC System, ist eine weitere Methode für die Lipid-Profile genutzt, auf direktem Elektrospray-Tandem-Massenspektrometrie 17 beruht. Bei dieser Methode wird die erste chromatographische Trennung von Lipiden in der Extrakt wird weggelassen. Allerdings erfordert diese Methode teure Ausrüstung und erfahrenes Personal, das es weniger nützlich für Routine-Analysen im Labor oder für Mutanten-Screening macht.

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<td>&alpha;-naphthol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>N1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methanolic HCL 3N</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>33050-U</td>
<td>Dilute to 1N by methanol</td>
</tr>
<tr>
<td>Si250-PA TLC plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>J.T.Baker</td>
<td>7003-04</td>
<td>With pre-absorbent </td>
</tr>
<tr>
<td>TLC chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>Z266000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Screw cap tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>53283-800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scew caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sun Sri</td>
<td>13-425</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PTFE disk</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sun Sri</td>
<td>200 608</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GLC system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hewlett Packard</td>
<td>HP6890</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
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<td>J&amp;W Scientific</td>
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<td>&nbsp;</td>
<td>Sun Sri</td>
<td>500 132</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Caps of GLC vials</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sun Sri</td>
<td>201 828</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chemstation software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>G2070AA</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

arabidopsis thaliana polar glycerolipid profiling by thin layer chromatography (tlc) coupled with gas-liquid chromatography (glc)

Biologische Membranen einzelner Zellen aus der Umwelt. Aus einer einzigen Zelle zu vielzelligen Pflanzen und Tieren, Glycerolipide, wie Phosphatidylcholin oder Phosphatidylethanolamin, Form-Doppelschicht-Membranen, die sowohl als Grenzen und Schnittstellen für die chemische Austausch zwischen Zellen und ihrer Umgebung zu handeln. Im Gegensatz zu Tieren haben Pflanzenzellen eine spezielle Organellen für die Photosynthese, die Chloroplasten. Die komplizierte Membransystem der Chloroplasten enthält einzigartige Glycerolipide, nämlich Glykolipide fehlt Phosphor: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), Digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) 4. Die Rolle dieser Lipide sind über die reine strukturelle. Diese Glykolipide und andere Glycerolipide wurden in den Kristallstrukturen von Photosystem I und II mit den Engagements von Glycerolipiden bei der Photosynthese 8,11 gefunden. Während Phosphat Hunger, ist DGDG zu extraplastidic Membranen übertragen, um den Verlust von Phospholipiden 9,12 kompensieren. Viel von unserem Wissen über die Biosynthese und Funktion dieser Lipide wurde aus einer Kombination von genetischen und biochemischen Studien mit Arabidopsis thaliana 14 geschlossen wurde abgeleitet. Während dieser Studien wurde ein einfaches Verfahren für die Analyse von polaren Lipiden wurden für das Screening und Analyse von Lipid-Mutanten wesentlich und werden im Detail erläutert werden. Ein Blatt Lipidextrakt wird zunächst durch Dünnschichtchromatographie (TLC) getrennt und Glycerolipide sind reversibel mit Joddampf gefärbt. Die einzelnen Lipide werden aus der DC-Platte abgekratzt und konvertierte zum Fettacyl Methylester (FAME), die durch Gas-Flüssigkeits-Chromatographie mit Flammenionisationsdetektor (FID-GLC) (Abbildung 1) gekoppelt analysiert werden. Diese Methode hat sich bewährt, um eine zuverlässige Werkzeug für Mutanten-Screening werden. Zum Beispiel die tgd1, 2,3,4 endoplasmatischen Retikulum-to-Plastiden Lipid Handels-Mutanten wurden auf Basis der Akkumulation von einer anormalen galactoglycerolipid entdeckt: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) und eine Abnahme in der relativen Menge von 18:3 (Kohlen: Doppel- Anleihen) Fettacylgruppen in Membranlipiden 3,13,18,20. Diese Methode ist auch anwendbar für die Bestimmung enzymatischer Aktivitäten von Proteinen unter Verwendung von Lipiden als Substrat 6.

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Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography TLC Coupled with Gas-Liquid Chromatography GLC

Zusammensetzung der polaren Lipid-Extrakte und der Fettsäure-Zusammensetzung der einzelnen Glycerolipide sind in einem einfachen und robusten Lipid-Profiling Experiment bestimmt. Zu diesem Zweck sind Glycerolipide durch Dünnschicht-Chromatographie isoliert und Transmethylierung ihrer Acylgruppen. Fatty Acyl Methylester durch Gas-Flüssigkeits-Chromatographie quantifiziert.

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling durch Dünnschichtchromatographie (TLC) mit Gas-Flüssigkeits-Chromatographie (GLC) Coupled

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as ...

arabidopsis-thaliana-polar-glycerolipid-profiling-thin-layer

Research

JoVE Journal

Biology

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

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Serie: Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography TLC Coupled with Gas-Liquid Chromatography GLC

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI-Probenvorbereitung: Die Ultra Thin-Layer-Methode

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Forschung

Biologie

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

Untersuchung Tissue-und Organ-spezifische Phytochrom Antworten mit FACS-gestützte zelltypspezifisch Expression Profiling in Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&amp;#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

Floral-dip Transformation von Arabidopsis thaliana Zum Untersuchen PTSO2: β-Glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Effiziente und schnelle Isolierung von Frühphasen-Embryonen aus<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

Histochemische Färbung von<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Sekundärzellwand-Elemente

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light conditions, which are preferably variable in quantity and quality so that studies under different setups can be conducted. These requirements are met by climatic chambers featuring light emitting diodes (LED) lights, which can &#8211; in contrast to fluorescent lights &#8211; be set to different wavelengths. LEDs are energy conserving and emit virtually no heat even at light intensities, which often constitutes a problem with other light sources. The presented protocol provides a step-by-step guidance of how to program a climatic chamber equipped with variable LED lights as well as describing several approaches for in depth analysis of growth phenotypes. Depending on the experimental set-up various characteristics of the growing plants can be observed and analyzed. Here we describe how to determine fresh weight, leaf area, photosynthetic activity, and stomatal density. We demonstrate that in order to obtain reliable data and draw valid conclusions it is mandatory to use a sufficient number of individuals for statistical evaluation. Taking too few plants for this kind of analysis results in high statistical errors and consequently in less clear interpretations of the data.

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Here, we present a protocol for studying plant growth behavior and especially phenotypes in a reproducible manner. We show how to provide variable and at the same time stable light conditions. Proper analyses depend on sufficient sample numbers and valid statistical evaluations.

Analyse von Arabidopsis Thaliana Wuchsverhalten in verschiedenen Licht-Qualitäten

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli (p)ppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

The (p)ppGpp nucleotide functions as a global regulator in bacteria in response to a variety of physical and nutritional stress. It has a rapid onset, in seconds, which leads to accumulation of levels that approach or exceed those of GTP pools. Stress reversal occasions a rapid disappearance of (p)ppGpp, often with a half-life of less than a minute. The presence of (p)ppGpp results in alterations of cellular gene expression and metabolism that counter the damaging effects of stress. Gram-negative and Gram-positive bacteria have different response mechanisms, but both depend on (p)ppGpp concentration. In any event, there is a need to simultaneously monitor many radiolabeled bacterial cultures at time intervals that may vary from 10 seconds to hours during critical stress transition periods. This protocol addresses this technical challenge. The method takes advantage of temperature- and shaker-controlled microtiter dish incubators that allow parallel monitoring of growth (absorbance) and rapid sampling of uniformly phosphate-radiolabeled cultures to resolve and quantitate nucleotide pools by thin-layer chromatography on PEI-cellulose. Small amounts of sample are needed for multiple technical and biological replicates of analyses. Complex growth transitions, such as diauxic growth and rapid (p)ppGpp turnover rates can be quantitatively assessed by this method.

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli pppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

The growth of radiolabeled bacterial cultures in microtiter dishes facilitates high throughput sampling that allows multiple technical and biological replicate assays of nucleotide pool abundance, including that of (p)ppGpp. The effects of growth transitions provoked by sources of physiological stress as well as recovery from stress can be monitored.

Verwenden von Microtiter Dish Radiolabeling für mehrere In-Vivo-Messungen von Escherichia coli (p)ppGpp gefolgt von dünnschichtiger Chromatographie

The (p)ppGpp nucleotide functions as a global regulator in bacteria in response to a variety of physical and nutritional stress. It has a rapid onset, in ...

Raum-zeitliche Untersuchung der ERL1-Dynamik mittels konfokaler Bildgebung

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane system. This includes the secretory transport of newly synthesized proteins to the cell surface or the outside of the cell, the endocytic transport of extracellular cargoes or plasma membrane components into the cell, and the recycling or shuttling transport of cargoes between the subcellular organelles, etc. Membrane trafficking events are crucial to the development, growth, and environmental adaptation of all eukaryotic cells and, thus, are under stringent regulation. Cell-surface receptor kinases, which perceive ligand signals from the extracellular space, undergo both secretory and endocytic transport. Commonly used approaches to study the membrane trafficking events using a plasma membrane-localized leucine-rich-repeat receptor kinase, ERL1, are described here. The approaches include plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup. To monitor the spatiotemporal regulation of ERL1, this study describes the co-localization analysis between ERL1 and a multi-vesicular body marker protein, RFP-Ara7, the time series analysis of these two proteins, and the z-stack analysis of ERL1-YFP treated with the membrane trafficking inhibitors brefeldin A and wortmannin.

Autor im Rampenlicht: Bildbasierte Methoden zur Untersuchung von Membrantransportereignissen in Zellen der Stomata-Linie  

Several commonly used methods are introduced here to study the membrane trafficking events of a plasma membrane receptor kinase. This manuscript describes detailed protocols including the plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup.

Bildbasierte Methoden zur Untersuchung von Membrantransportereignissen in stomatalen Zellen

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane ...