Diese Technik verwendet Instrumente, die in den meisten Laborumgebungen üblich sind, und ermöglicht die gleichzeitige Analyse mehrerer Proben. Diese Methode kann wichtige Erkenntnisse darüber liefern, wie Fettstoffwechselenzyme in einem zellulären Kontext und in verschiedenen genetischen Hintergründen reguliert werden. Impfen Sie eine Kolonie von einer Hefekulturplatte in 20 Milliliter SC-Medien mit 2% Dextrose und inkubieren Sie bei 30 Grad Celsius für die Nacht mit Schütteln bei 200 U / min.
Am nächsten Tag die Kultur in 50 Millilitern frischem Medium auf einen endverabschnenden ZÄHLER von 0,2 verdünnen und 24 Stunden lang züchten, bis die stationäre Phase erreicht ist. Bereiten Sie für jede Probe zwei 20-Milliliter-Aliquoten Abschreckpuffer vor und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Bereiten Sie gleichzeitig Radiomarkierungsmedien vor, indem Sie Essigsäure-Natriumsalz zu dextrosefreien SC-Medien in einer Endkonzentration von 10 Mikrocurie pro Milliliter hinzufügen.
Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 4.100 x g für 10 Minuten. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Zellpellet einmalig mit 20 Millilitern dextrosefreien SC-Medien. Sammeln Sie die Zellen wieder auf, indem Sie fünf Minuten lang bei 4.100 x g zentrifugieren und mit dextoren freien Medien in ein markiertes zwei Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
Zentrifugieren Sie die Zellen für weitere zwei Minuten. Resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern dextrosefreier SC-Medien und beginnen Sie die Radiomarkierungsphase, indem Sie schnell 500 Mikroliter Radiomarkierungsmedien zu jeder Zellsuspension hinzufügen. Inkubieren Sie die Röhrchen in einem rotierenden Inkubator bei 30 Grad Celsius für 20 Minuten.
In der Zwischenzeit die für 50 Milliliter konische Röhrchen ausgerüstete Zentrifuge auf minus 10 Grad Celsius vorkühlen und einen 20 Milliliter Aliquots Abschreckpuffer auftauen. Nach Ablauf der Radiomarkierungszeit wird die gesamte Ein-Milliliter-Probe mit einer Pipette in einen aufgetauten Abschreckpuffer auf Eis getaucht. Sammeln Sie das Zellpellet, indem Sie es in einer vorgekühlten Zentrifuge bei 5.000 x g für drei Minuten drehen und 20 Milliliter frischen Kaltabschreckpuffer hinzufügen.
Wirbeln Sie die Proben aus und schütteln Sie sie vollständig im Abschreckpuffer und zentrifugieren Sie die Proben erneut, um die Zellen zu sammeln. Sobald die Zellen pelletiert sind, entfernen Sie gründlich alle Abschreckpuffer aus den Proben, indem Sie den Überstand abgießen und den Überschuss mit einer Pipette entfernen. Lagern Sie die Röhrchen bei minus 80 Grad Celsius zur Weiterverarbeitung.
Wiegen Sie 0,3 Gramm säuregewaschene Glasperlen für jede Probe und lagern Sie sie in zwei Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Entfernen Sie die Zellpellets aus dem minus 80 Grad Gefrierfach und legen Sie sie auf Eis. Dann fügen Sie 350 Mikroliter Methanol und 700 Mikroliter Chloroform zu jeder Probe hinzu und resuspendieren Sie die Zellen.
Geben Sie sie in Mikrozentrifugenröhrchen mit vorgewogenen Glasperlen. Lyse der Zellen durch Dreitexen für eine Minute, mit 30 Sekunden Inkubation auf Eis zwischen den Agitationen. Gießen Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Glaszentrifugenröhrchen und beschriften Sie das Röhrchen als Röhrchen A.Waschen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Milliliter Methanol, wirbeln Sie es ein und gießen Sie das Methanol in Rohr A.Fügen Sie zwei Milliliter Chloroform hinzu, gefolgt von 400 Mikrolitern Wasser in Rohr A für ein endgültiges Probenvolumen von 4,45 Millilitern.
Wirbeln Sie die Proben für eine Minute vor, gefolgt von einer fünfminütigen Zentrifugation bei 1000 x g, um die wässrigen und organischen Phasen mit Zelltrümmern an der Grenzfläche klar zu trennen. Sammeln Sie mit einer Glasweidepipette die organische Phase in einem neuen Glaszentrifugenröhrchen mit der Bezeichnung B und fügen Sie einen Milliliter eines molaren Kaliumchlorids hinzu. Fügen Sie ein Milliliter Methanol und zwei Milliliter Chloroform in Rohr A hinzu und wiederholen Sie die Wirbel- und Zentrifugationsschritte.
Wirbel- und Zentrifugenröhrchen B zur Trennung der wässrigen und organischen Phase. Entfernen Sie die obere wässrige Schicht und sammeln Sie die gesamte untere organische Schicht in einem vier Milliliter Glasfläschchen. Das Lösungsmittel aus den Lipidextrakten durch Trocknen unter Inertgas vollständig verdampfen und einen Ofen auf 145 Grad Celsius vorheizen, um die TLC-Platte zu erhitzen.
Bestimmen Sie die relativen Mengen an Radiomarkierung, die von den Zellen aufgenommen werden, bevor Sie sie auf die TLC-Platte laden. Rekonstituieren Sie die Probenlipide in 40 bis 50 Mikroliter Chloroform und Methanol, die im Verhältnis eins zu eins gemischt werden, indem Sie fünf Minuten lang vortexen. Bereiten Sie 101 Milliliter des mobilen Phasenlösungsmittels in einem Glasmesszylinder vor.
Dann gießen Sie das Lösungsmittel in eine Glas-TLC-Kammer, die ein 20 x 20 TLC-Sättigungspad und einen eng anliegenden Deckel enthält. Bereiten Sie eine kanalisierte 20 x 20 Kieselgel-60G-Platte vor und markieren Sie eine Linie 1,5 Zentimeter über dem Boden der Platte mit einem Bleistift. Sobald die Platte ausreichend erhitzt und das TLC-Sättigungspad mit Lösungsmittel gesättigt ist, entfernen Sie die TLC-Platte aus dem Ofen und fahren Sie sofort mit dem Laden fort.
Mit einer Pipette fünf Mikroliter Proben auf den Ursprung jeder Spur, die sich 1,5 Zentimeter über dem Boden der TLC-Platte befindet, und wiederholen Sie die Belastung, bis 20 bis 40 Mikroliter Proben in jede Spur geladen wurden. Sobald der Standard und die Proben geladen wurden, legen Sie die Platte in die Entwicklungskammer und warten Sie, bis das Lösungsmittel die Oberseite der Platte erreicht hat. Wenn die Platte vollständig entwickelt ist, entfernen Sie sie aus der Kammer und lassen Sie sie 20 Minuten im Abzug trocknen.
Nachdem die Platte getrocknet ist, bedecken Sie sie mit Kunststofffolie und legen Sie sie in eine Entwicklungskassette mit einem Autoradiographie-Bildschirm. Entfernen Sie den Bildschirm von der Entwicklungskassette und legen Sie ihn in einen Phosphor-Imager. Besprühen Sie die TLC-Platte mit p-Anisaldehyd-Reagenz, bis die Kieselsäure gesättigt ist, und backen Sie sie dann in einem 145-Grad-Ofen für fünf Minuten oder bis Bänder aufgetreten sind.
Um Lipidspezies zu quantifizieren, kratzen Sie das Kieselgel, das einzelne Lipidspezies enthält, und übertragen Sie sie auf Glasszintillationsfläschchen. Fügen Sie sechs Milliliter Szintillationsflüssigkeit hinzu und wirbeln Sie kräftig, bis das Kieselsäureband auf kleine Stücke reduziert wurde. Legen Sie das Rack mit den Szintillationsfläschchen in einen Szintillationszähler und zählen Sie, indem Sie die Zählzeit auf zwei Minuten pro Durchstechflasche einstellen.
Die Phosphorbildgebung ermöglicht die Visualisierung des Autoradiogramms von markierungsfreien Fettsäuren, Triacylglycerin, Diacylglycerin, Cholesterin und Squalan. Es wurde gezeigt, dass gereinigte Lipidspezies bei dieser Methode abgetrennt und anschließend durch Besprühen der TLC-Platte mit p-Anisaldehyd-Reagenz visualisiert werden können. Zu den visualisierten Arten gehören neben sterilen Estern auch alle zuvor genannten Lipide.
Durch die Anwendung einer 10-minütigen Verfolgungsperiode in radioaktiven Medien nach dem Puls wurde beobachtet, dass am Hauptpool von Squalan verschwand und das Gesamtcholesterin erhöht wurde. In ähnlicher Weise korrelierte das Auftreten von Diacylglycerin in der Verfolgungsperiode mit einer Abnahme des Signals der freien Fettsäuren. Vor der Durchführung des vollständigen Protokolls ist es wichtig zu bestimmen, ob die Zellen die Essigsäure-Radiomarkierung im Wachstumszustand und im genetischen Hintergrund von Interesse aufnehmen.
