Wir danken Amanda Rychel für die Unterstützung bei der Entwicklung der Zeitraffer-Protokoll und Lynn Pillitteri für den Bau von POLAR :: POLAR-eGFP. Wir sind auch dankbar ABRC für die Bereitstellung der pm-rb konstruieren. Dieses Protokoll wurde durch eine Unterstützung aus dem PRESTO Auszeichnung von Japan Science Technology and Agency entwickelt. Forschung POLAR wurde auch von der University of Washington Royalty Research Fund (RRF-4098) und der National Science Foundation (MCB-0855659) unterstützt. KMP ist ein NSF Graduate Research Fellow (DGE-0.718.124) und KUT ist ein HHMI-GBMF Ermittler.

Ein. Seed Sterilisation <ol><li> Bereiten seed Sterilisationslösung: 33% Bleiche, 0,1% Triton X-100. </li><li> Ort Samen tragenden gewünschten fluoreszierenden Reporter-Konstrukt (en) und Genotyp (en) in 1,7 ml Röhrchen und anwendbar 1 ml Sterilisationslösung. Inkubieren auf Kolbenpendel für 15 min. </li><li> In einer sterilen Haube, verwenden Sie eine Pipette, um eine Sterilisation Lösung von Rohr zu entfernen, so dass Samen hinter sich. Spülen mit 1 ml sterilem Wasser. Wiederholen Sie viermal. </li><li> Inkubieren bei 4 ° C für zwei Tage oder länger. </li></ol> 2. Vorbereitung der Chamber Slide Medien <ol><li> Mix 20 ml 0,5% ige Lösung von Bacto Agar (nicht reine Agarose) in Wasser in einem 200 ml Kolben, und einer Mikrowelle bis gelöst. Seien Sie vorsichtig, wenn Kochen der Lösung. </li><li> Abkühlen der Lösung auf etwa 60 ° C </li><li> Sammeln Sie 1 ml Agar-Lösung mit einer Pipette und langsam auf dem Deckglas in der Kammer Schieber (Lab-Tek II Chambered # 1.5 deutschen Deckglas System) anzuwenden. Lösung which ist zu heiß oder zu schnell kann Leim oder Riss Glasschmelze angewendet. </li><li> Unmittelbar fügen Sie eine zweite ml Agar-Lösung. Agarmedien sollte nun vollständig bedeckt den Boden des Schlittens Kammer. Dies Minimalmedien ausreicht, um die Entwicklung in einer Pflanze Cotyledone, die gespeicherten Nährstoffe für vier bis fünf Tage durch Aufrechterhalten Feuchtigkeit und Ermöglichen Gasdiffusionselektrode enthält unterstützen. </li><li> Cool Slide auf dem Labortisch mit Kammer abgedeckt. Wenn Kolben fest verschlossen wird, kann Lösung gespeichert und erneut erhitzt für zukünftige Verwendung. </li></ol> 3. Seed Dissection <ol><li> Entfernen Rohr steriles Saatgut von 4 ° C Lagerung. </li><li> Legen Sie ein Papiertuch auf der Bühne einem Binokular und befeuchten mit Wasser. Gewebe einzustellen, um eine glatte Oberfläche zu erzeugen. Tissue wird verwendet, um Samen für die Präparation zu stabilisieren. </li><li> Pipet 20-30 Samen aus der Tube auf das Gewebe, wobei darauf geachtet, sie in der Binokular Sichtfeld des platzieren. </li><li> Mit scharfen Pinzette (Roboz, # 5 Biologie Spitze), Entfernen Sie vorsichtig die Samenschale vom Setzling innen. Beide äußeren und inneren Integumenten müssen entfernt werden. </li><li> Beim Abbilden das Keimblatt, ist es vorteilhaft, das Hypokotyl und Würzelchen zu entfernen. Keimblätter enthalten ausreichend Nährstoffe für mehrere Tage unter dieses Protokoll zu entwickeln. Wenn intakten, wird das Hypocotyl begradigen und drastisch verlängern, Bewegen der Cotyledone aus dem Zeitablauf Sichtfeld. Verwenden Sie ein Skalpell, um die Keimblätter frei von der Hypokotyl schneiden. </li><li> Halten seziert Kotyledonen in Wasser getaucht, in ein Mikroröhrchen oder ähnliches. </li><li> Wiederholen 3,4-3,6 bis die gewünschte Anzahl von Cotyledonen erreicht ist. 15-20 erfolgreiche Dissektionen sind vor der Montage empfohlen. </li></ol> 4. Montage Keimblätter in der Chamber Slide <ol><li> Mit einem kleinen (18 mm 2) Deckglas, schneiden durch die Agar-Medien und heben Sie die gesamte Schicht aus der Kammer slide ist durch den Glasboden. </li><li> Pipette seziert Cotyledonen mit einem Minimum an Wasser aus anhältRohr in der Kammer gleiten, unter das angehobene Agarschicht. </li><li> Senken Sie die Agar auf die Keimblätter. Wenn überschüssiges Wasser vorhanden ist, legen Sie ihn weg mit einem Gewebe, darauf achtend, nicht die Keimblätter stören. Die Proben sollten nicht mehr so ​​leicht zu bewegen, wenn Mount abgeschlossen ist. </li><li> Zeigen Abdeckung auf Kammerobjektträgers und bewegen Folie Mikroskoptisch. </li></ol> 5. Time Lapse Imaging <ol><li> Richten invertierten konfokalen Mikroskop zur Abbildung der gewünschten Fluorophor (s). LSM700 Parameter verwendet: für GFP, Anregung bei 488 nm und Sammlung mit einem Bandpassfilter bei 440-530 nm; für RFP, Anregung bei 555 nm und Sammlung mit einem Bandpassfilter bei 570-610 nm aufweist. </li><li> Kontrollieren eingebettete Proben für Schäden. Programmieren Sie die Standorte der intakten, ordnungsgemäß montiert Keimblätter in Mikroskop-Software. Im Zen 2009: Fokus auf einer cotyledon mit 20x-Objektiv und bewegen Ziel Nutzraummitte Folie. Unter Acquisition Mode, ändern Zoom bis 0,5 und Baugröße &lt;/ Em&gt; 48x48 Pixel. Wählen Positionen Checkbox und Scan Übersicht Bild ... Button unter Positionen, dann erhöhen Horizontal und Vertikal tile Nummern 30-35. Wenn der Scan abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Positionen Knopf unter der Registerkarte Dimensionen und Ort Fadenkreuz an jedem cotyledon zu beobachten. </li><li> Richten Sie z-Serie umfasst die cotyledon Epidermis aller samples.In Zen 2009: Klicken Sie auf die Z-Stack aktivieren. Wählen Sie jede Position unter Position Liste und klicken Sie auf Move to-Taste. Konzentrieren Sie sich auf der obersten Ebene des cotyledon Epidermis und klicken Sie auf die Set Erste Schaltfläche unter Z-Stack. Konzentrieren Sie sich auf die niedrigste Position, an der Epidermis ist sinnvoll sichtbar und klicken Sie auf die zuletzt eingestellte Taste. Klicken Sie auf die Schaltfläche neben Optimale, was zeigt, die besten z-Schichtdicke, zu setzen. Überprüfen Sie jede cotyledon zu bestätigen, dass diese Einstellungen alle Proben umfassen, die z-Parameter kann nicht für indiv. eingestellt werdenidual Positionen in Zen 2009. </li><li> Richten Sie Zeitreihen auf die gewünschte Auflösung und Länge. Abständen von 15-30 min für drei Tage gelten für Dynamik von Proteinen in epidermalen Zellteilung. Dieses Intervall kann je nach Bedarf geändert werden. Im Zen 2009: Klicken Sie auf die Time Series Kontrollkästchen. Unter Time Series, eingestellt Cycles für die Anzahl der Bilder, die gewünschte mit dem Schieberegler oder Eingabe in das Textfeld ein. Set Interval bis 30 und das Pull-Down-Menü min wählen. </li><li> Beginnen xyzt Multi-Positions-Scan. Beachten Sie, dass die Anzahl von Positionen, die die Scan-Daten begrenzt werden muß, wenn Gesamtabtastzeit größer ist als das gewünschte Intervall, die Zeitpunkte nicht korrekt sein. Es können maximal sechs gleichzeitige Positionen sind möglich, wenn Bildgebung GFP und RFP bei 59 z-Scheiben in einem 30-Minuten-Intervall mit unserem System. Im Zen 2009: Change Frame Size die gewünschte Auflösung und klicken Sie auf Start Experiment. </li></ol> 6. Video Editing <ol><li> Von der konfokalen Datendatei, machen eine maximale Intensität z-Projektion jedes Mal / Position Kombination und Export als Bild-Dateien in einem verlustfreien Format wie TIFF. Dateinamen sollten in eine Reihe pro Position (zB POLAR-GFP_pos1_0001, POLAR-GFP_pos1_0002, etc., nicht POLAR-GFP_0001_pos1) für die Software, um sie in einem Film zu kombinieren. Im Zen 2009: Verwenden Sie Copy: Subset unter der Registerkarte Verarbeitung Positionen in separate Dateien, dann Maximum Intensity Projection aufgeteilt. Schließlich, als TIFF exportieren (Datei: Export, in höherer Auflösung Bildfenster - Serie). </li><li> Verwenden FIJI 7,8 aufeinanderfolgenden Bildern, indem Sie das bUnwarpJ macro 9 (Plugins: Registrierung: bUnwarpJ) auszurichten. Ändern Registration Mode auf Mono. Alle Erweiterte Optionen können Standardwerte. Für lange Zeitspanne, laden und installieren Sie das Makro &quot;Affine + Konsequente Elastic 2D Image Registration&quot;, das wird bUnwarpJ zu einer Reihe von Bildern automatisch anzuwenden, und öffnen Sie yunsere Daten über Datei: Import: Image Sequence, es zu benutzen. Deaktivieren MOPS Sehenswürdigkeiten Extraktion und Lauf. </li><li> Verwenden FIJI / ImageJ oder Quicktime Pro, um die Reihenfolge der ausgerichteten Bilder öffnen und speichern in das gewünschte Videoformat (AVI ist eine gute Wahl). </li></ol>

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	<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Embryonic+Cell+Lineage+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans.">The Embryonic Cell Lineage of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100, 64 (1983).</li><li>Foe, V., Odell, G., Edgar, B. A., Bate, M., Martinez Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3+Mitosis+and+Morphogenesis:+Point+and+Counterpoint.">Chapter 3 Mitosis and Morphogenesis: Point and Counterpoint.</a> Development of Drosophila melanogaster. , (1993).</li><li>Vincent, C. A., Carpenter, R., Coen, E. 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Plant Physiology. 129 (2), 854 (2002).</li><li>Grandjean, O., Vernoux, T., Laufs, P., Belcram, K., Mizukami, Y., Traas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Analysis+of+Cell+Division,+Cell+Growth,+and+Differentiation+at+the+Shoot+Apical+Meristem+in+Arabidopsis.">In Vivo Analysis of Cell Division, Cell Growth, and Differentiation at the Shoot Apical Meristem in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 16 (1), 74 (2004).</li><li>Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Profiling+of+Stomatal+Meristemoids+Reveals+New+Component+of+Asymmetric+Cell+Division+and+Commonalities+among+Stem+Cell+Populations+in+Arabidopsis.">Molecular Profiling of Stomatal Meristemoids Reveals New Component of Asymmetric Cell Division and Commonalities among Stem Cell Populations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 23 (9), 3260 (2011).</li><li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 36 (2004).</li><li>Arganda-Carreras, I., Sorzano, S. &. #. 2. 2. 5. ;. n. c. h. e. z., Marabini, C. O., Carazo, R., de Solorzano, J. M. O. r. t. i. z. -., C, J., Kybic, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consistent+and+Elastic+Registration+of+Histological+Sections+Using+Vector-Spline+Regularization.">Consistent and Elastic Registration of Histological Sections Using Vector-Spline Regularization.</a> Computer Vision Approaches to Medical Image Analysis, ser. Lecture Notes in Computer Science. 4241, 85-95 (2006).</li><li>Peterson, K. M., Rychel, A. L., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Out+of+the+Mouths+of+Plants:+The+Molecular+Basis+of+the+Evolution+and+Diversity+of+Stomatal+Development.">Out of the Mouths of Plants: The Molecular Basis of the Evolution and Diversity of Stomatal Development.</a> Plant Cell. 22 (2), 296 (2010).</li><li>Czymmek, K. J., Fogg, M., Powell, D. H., Sweigard, J., Park, S. -. Y., Kang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Time-lapse+Documentation+Using+Confocal+and+Multi-Photon+Microscopy+Reveals+the+Mechanisms+of+Invasion+into+the+Arabidopsis+Root+Vascular+System+by+Fusarium+oxysporum.">In vivo Time-lapse Documentation Using Confocal and Multi-Photon Microscopy Reveals the Mechanisms of Invasion into the Arabidopsis Root Vascular System by Fusarium oxysporum.</a> Fungal Genetics and Biology. 44 (10), 1011 (2007).</li><li>Campilho, A., Garcia, B., Toorn, H. V., Wijk, H. V., Campilho, A., Scheres, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Lapse+Analysis+of+Stem-cell+Divisions+in+the+Arabidopsis+thaliana+Root+Meristem.">Time-Lapse Analysis of Stem-cell Divisions in the Arabidopsis thaliana Root Meristem.</a> Plant Journal. 48, 619 (2006).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Diese Zeitraffer-konfokalen Technik erlaubt Längsschnittstudien von fluoreszierend markierte Protein Expression und Lokalisierung in einzelnen Zellen der Arabidopsis Cotyledone Epidermis, die im Fall von polaren und andere dynamisch ändernden Proteinen ist entscheidend für das Verständnis ihrer Funktion. Zuvor hat anhaltende Zeitspanne Bildgebung verwendet worden, um Arabidopsis root Pilzinfektion 11 und Meristem Wachstum 5,12 untersuchen, sondern indem die cotyledon Epidermis...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namen Reagenz </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Bacto Agar </td><td> BD </td><td> 214010 </td><td></td></tr><tr><td> Ein-Kammer-slide </td><td> Nunc (Thermo Scientific) </td><td> 155360 </td><td> Oder Zwei-Kammer (155.379) </td></tr><tr><td> Laser Scanning konfokalen Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> LSM700 </td><td> Zen 2009 Software </td></tr><tr><td> 20x Objektiv </td><td> Zeiss </td><td> 420650-9901 </td><td> NA 0,8, Plan-APOCHROMAT </td></tr><tr><td> Seziermikroskop </td><td> Benz (National) </td><td> 431TBL </td><td> Leuchtet von unten </td></tr><tr><td> Nr. 5 Zangen, Biologie Spitze </td><td> Roboz Surgical Instrument </td><td> RS-4978 </td><td> Sehr feine Spitzensind kritisch </td></tr></tbody></table>

long-term, high-resolution confocal time lapse imaging of arabidopsis cotyledon epidermis during germination

Imaging in vivo Dynamik zellulärer Verhalten während einer Entwicklungsstörung Sequenz kann eine leistungsstarke Technik für das Verständnis der Mechanik des Gewebes Strukturierung sein. Während tierischen Entwicklung treten Schlüssel Zellproliferation und Strukturierung Ereignisse sehr schnell. Zum Beispiel, in Caenorhabditis elegans alle Zellteilungen für die Larven Bauplan erforderlich sind innerhalb von sechs Stunden nach der Befruchtung abgeschlossen, mit sieben mitotische Zyklen 1, die sechzehn oder mehr Mitosen von Drosophila Embryogenese treten in weniger als 24 Stunden 2. Im Gegensatz dazu sind Zellteilungen der Pflanzenentwicklung langsam, typischerweise in der Größenordnung von einem Tag 3,4,5. Dies stellt eine einzigartige Herausforderung und eine Notwendigkeit für die langfristige Echtzeit-Bildgebung für die Dokumentation dynamische Verhalten der Zellteilung und Differenzierung Ereignisse während Pflanzen Organogenese. Arabidopsis Epidermis ist ein hervorragendes Modellsystem zur Untersuchung Signalisierung, das Schicksal der Zelle, und die Entwicklung der Pflanzen. In der cotyledon besteht dieses Gewebe von Luft-und Wasser-resistente Pflaster Zellen mit gleichmäßig verteilten Spaltöffnungen, Ventile sich öffnen und schließen, um den Gasaustausch und Wasserverlust zu kontrollieren. Richtigen Abstand dieser Spaltöffnungen ist entscheidend für ihre Funktion und ihre Entwicklung folgt eine Sequenz von asymmetrischen Teilung und Zelldifferenzierung Schritte, um die organisierte Epidermis (Abb. 1) zu produzieren. Dieses Protokoll ermöglicht die Beobachtung der Zellen und Proteine ​​in der Epidermis über mehrere Tage der Entwicklung. Dieser Zeitrahmen ermöglicht eine präzise Dokumentation der Stammzell-Divisionen und Differenzierung von epidermalen Zellen, einschließlich Spaltöffnungen und epidermalen Pflaster Zellen. Fluoreszierende Proteine ​​können zu interessierenden Proteine ​​fusioniert werden, um ihre Dynamik während der Zellteilung und Differenzierung Prozesse zu beurteilen. Diese Technik ermöglicht es uns, die Lokalisierung eines neuen Proteins, POLAR 6 zu verstehen, während der Proliferation Stadium der Stomata-lineage Zellen in the Arabidopsis Cotyledone Epidermis, wo sie in Zellen asymmetrischen Teilung vorhergehenden Ereignisse und bewegt sich zu einem charakteristischen Bereich des Zellcortex kurz vor Teilung erfolgt exprimiert wird. Bilder können registriert und gestrafft werden Video leicht unter Verwendung Public Domain Software, um dynamische Protein-Lokalisierung und Zelltypen zu visualisieren, wie sie im Laufe der Zeit ändern.

<html> Ein Satz von informativen Zeitpunkten mit diesem Verfahren gesammelt wird in 3 gezeigt. Zellmembranen mit RFP (pm-rb) und GFP ist POLAR Protein unter seinem nativen Promotor fusioniert (POLAR :: POLAR-GFP) 6 Auf der 30-Minuten-Zeitskala markiert sind, sehen wir Zellteilungen zusammen mit den Veränderungen in der Protein-Lokalisierung vor ihnen. Asymmetrische Zellteilungen in der Stomata Abstammungslinie Form Stammzell-Vorstufen wie Stomata genannt meristemoids, die die Fähigk...

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Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Wir beschreiben ein Protokoll mit Kammer-Objektträgern und Medien zu pflanzen Keimblätter für die konfokale Bildgebung der Epidermis über mehrere Tage der Entwicklung immobilisieren, zu dokumentieren stomatal Differenzierung. Fluorophor-markierte Proteine ​​können dynamisch durch Expression und subzelluläre Lokalisation verfolgt werden, das Verständnis ihrer möglichen Rollen bei der Zellteilung und Zelltyp-Differenzierung.

Langfristige, High-Resolution Konfokale Zeitraffer Bildgebung<em&gt; Arabidopsis Cotyledon</em&gt; Epidermis während der Keimung

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

long-term-high-resolution-confocal-time-lapse-imaging-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

13.6K Aufrufe.  University of Washington. Wir beschreiben ein Protokoll mit Kammer-Objektträgern und Medien zu pflanzen Keimblätter für die konfokale Bildgebung der Epidermis über mehrere Tage der Entwicklung immobilisieren, zu dokumentieren stomatal Differenzierung. Fluorophor-markierte Proteine ​​können dynamisch durch Expression und subzelluläre Lokalisation verfolgt werden, das Verständnis ihrer möglichen Rollen bei der Zellteilung und Zelltyp-Differenzierung.

Serie: Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Langfristige Imaging Säugetierzellen mit Wide-Field-Mikroskopie

Forschung

Biologie

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

Visualisierung von Craniofacial Entwicklung in den sox10: kaede transgener Zebrafische Zeile mit Zeitraffer-konfokale Mikroskopie

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories can face is the development and attainment of these methods. Observation of phenotypes in a process of interest is a typical objective of research labs studying gene function and this is often achieved through image capture. A particular process that is amenable to observation using imaging approaches is the corrective growth of a seedling root that has been displaced from alignment with the gravity vector. Imaging platforms used to measure the root gravitropic response can be expensive, relatively low in throughput, and/or labor intensive. These issues have been addressed by developing a high-throughput image capture method using inexpensive, yet high-resolution, flatbed scanners. Using this method, images can be captured every few minutes at 4,800 dpi. The current setup enables collection of 216 individual responses per day. The image data collected is of ample quality for image analysis applications.

This protocol describes a process for rapid collection of images of Arabidopsis seedlings responding to a gravity stimulus using commercially-available flatbed scanners. The method allows for inexpensive, high-volume capture of high-resolution images amenable for downstream analysis algorithms.

Mit Flachbett-Scanner mit hoher Auflösung zeitversetzt Bilder von der Arabidopsis-Wurzel gravitropen Antwort sammeln

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The synchronization of cell populations at specific stages of the cell cycle has been found to be very useful in such experimental endeavors. Synchronization of cells by treatment with chemicals that are relatively less toxic can be advantageous over the use of pharmacological inhibitory drugs for the study of consequent cell cycle events and to obtain specific enrichment of selected mitotic stages. Here, we describe the protocol for synchronizing human cells at different stages of the cell cycle, including both in S phase and M phase with a double thymidine block and release procedure for studying the functionality of mitotic proteins in chromosome alignment and segregation. This protocol has been extremely useful for studying the mitotic roles of multifunctional proteins which possess established interphase functions. In our case, the mitotic role of Cdt1, a protein critical for replication origin licensing in G1 phase, can be studied effectively only when G2/M-specific Cdt1 can be depleted. We describe the detailed protocol for depletion of G2/M-specific Cdt1 using double thymidine synchronization. We also explain the protocol of cell fixation, and live cell imaging using high resolution confocal microscopy after thymidine release. The method is also useful for analyzing the function of mitotic proteins under both physiological and perturbed conditions such as for Hec1, a component of the Ndc80 complex, as it enables one to obtain large sample sizes of mitotic cells for fixed and live cell analysis as we show here.&#160;&#160;

We present a protocol for double thymidine synchronization of HeLa cells followed by analysis using high resolution confocal microscopy. This method is key to obtaining large number of cells that proceed synchronously from S phase to mitosis, enabling studies on mitotic roles of multifunctional proteins which also possess interphase functions.

Kombination von mitotische Zelle Synchronisation und hochauflösenden konfokalen Mikroskopie zur Untersuchung der Rolle von multifunktionalen Zelle Zyklus Proteine während der Mitose

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

Eine vielseitige Methode für die Montage von Arabidopsis verlässt für intravitalen Zeitraffer Aufnahmen

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

Spezifische Kennzeichnung von mitochondrialen Nukleoiden für die Zeitraffer-Struktur-Beleuchtungsmikroskopie

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because the larval body wall and most internal organs are transparent. However, continuous live imaging of intact Drosophila larvae for longer than 30 min has been challenging because it is difficult to noninvasively immobilizeimmobilizing larvae for a long time. Here we present a larval mounting method called LarvaSPA that allows for continuous imaging of live Drosophila larvae with high temporal and spatial resolution for longer than 10 hours. This method involves partially attaching larvae to the coverslip using a UV-reactive glue and additionally restraining larval movement using a polydimethylsiloxane (PDMS) block. This method is compatible with larvae at developmental stages from second instar to wandering third instar. We demonstrate applications of this method in studying dynamic processes of Drosophila somatosensory neurons, including dendrite growth and injury-induced dendrite degeneration. This method can also be applied to study many other cellular processes that happen near the larval body wall.

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

This protocol describes a method for mounting Drosophila larvae to achieve longer than 10 h of uninterrupted time-lapse imaging in intact live animals. This method can be used to image many biological processes close to the larval body wall.

LarvaSPA, Eine Methode zur Montage von Drosophila Larva für Langzeit-Zeitraffer-Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...