Diese Arbeit wird durch NIH P20 RR021905-01, CF RPD gewähren STANTO07R0 und NASA gewähren NNH09ZNE002C finanziert.

<img src="/files/ftp_upload/2664/2664fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Schaltplan für SESI-MS-Analyse der bakteriellen volatiles. Der Kopfraum der Bakterienkultur wird durch CO 2 (1) in die SESI Reaktionskammer (2) verdrängt. Da die flüchtigen durchqueren die SESI Reaktionskammer sie durch die Elektrospray Wolke und ionisiert (3). Einmal ionisiert werden die flüchtigen Bestandteile in das Massenspektrometer für die Analyse (4) gezogen. Überschüssiges Trägergas und umgesetzten bakterielle flüchtigen Stoffe werden durch einen 0,22 um-Filter (5) weitergeleitet, wie ein zusätzliches Maß an Schutz und entlüftet werden, um eine chemische Kapuze. Kleines Bild: Die SESI Elektrospray Nadel ist eine Silica-Kapillare (40 um ID) mit einem geschärften Nadelspitze. Zur Demonstration des Einsatzes von SESI-MS zur Charakterisierung von bakteriellen volatiles, E. coli K12 und P. aeruginosa PAO1 sind aerob für 24 h in 50 mL LB-Lennox bei 37 ° C und die SESI-MS-Spektren der Kopfraum flüchtigen Stoffe werden in 2 Minuten gesammelt. Kohlendioxid (99,99%) bei einer Flussrate von 2 L / min wird als Trägergas für flüchtige Auslieferung an die Reaktionskammer verwendet. Die SESI Reaktionskammer wurde speziell gebaut und ausgestattet, um eine API-3000 (SCIEX) als Ersatz für die ursprüngliche Elektrospray-Ionenquelle. Die Spektren sind in Positiv-Ionen-Modus mit 0,1% Ameisensäure, 5,0% Methanol und 94,9% Wasser (v / v) als Elektrospray-Lösung gesammelt, geliefert mit 5 nl / s durch eine nicht leitende Silica-Kapillare mit einem geschärften Nadelspitze (40 um ID). Die angelegte Spannung beträgt 2,5 kV. - 500 Da, MCA-Modus, 40-Scans, 3 s / Scan-und 2 min Gesamtanalyse Zeit 20: Analyst 1.4.2 Software (Applied Biosystems) ist für die Datenerfassung mit den folgenden Parametern verwendet. 1. Anzucht-System <ol><li> Wählen Sie die passende Gefäß für das Wachstum Ihres Kulturen, wenn man bedenkt das Wachstum Anforderungen der Arten in Ihrem Experiment (z. B. Belüftung, Licht, Temperatur, etc.), sowie die effiziente Bereitstellung von flüchtigen dem Massenspektrometer. Die Kultur Flaschen, die wir wählen, zu verwenden sind Standard 100 mL Pyrex Medien-Flaschen mit Schraub-, dass mindestens zwei Luer-Ports ausgestattet. Eine Zuleitung wird durch einen Luer-Anschluss für Trägergas Lieferung an der Probeflasche und eine Ableitung durch einen anderen Anschluss für VOC Lieferung an das Instrument (Abbildung 1) eingesetzt ist. Jede zusätzliche Ports angeschlossen sind. </li><li> Vor Kultivierung der Proben, unter Druck die Gefäße und in Wasser tauchen, um auf Dichtigkeit prüfen. Gaslecks sind eine Hauptursache für atypische Ergebnisse in Form von schwach oder nicht vorhanden flüchtigen Ionen-Signale. </li></ol> 2. Biologische Experimente: set-up-und Sicherheitsüberlegungen <ol><li> Steigern Sie Ihre Kulturen in den geeigneten Bedingungen, um Ihre Hypothese. Es wird empfohlen, mindestens zwei biologische, Wiederholungen mit jeweils zwei technischen Replikaten, sind für jede Variable verwendet. </li><li> Bereiten Sie eine leere für jede Kultur Zustand (mittel, Antibiotika, etc.) und inkubieren Sie die leere unter den gleichen Bedingungen wie Ihre Proben. </li><li> Beschäftigen Sicherheitsvorkehrungen, die für die biologische Arbeitsstoffe Sie verwenden werden, unter Berücksichtigung der biologischen Sicherheit (s) der Arten. </li><li> Um zu verhindern Kontamination von Ihrem Instrument und das Gas Transferstraßen mit lebensfähigen biologischen Agenzien, installieren Filter der entsprechenden Porengröße in den Träger Gasleitung. Die Filter werden nicht mit der Übertragung von flüchtigen, die SESI Reaktionskammer stören, können aber etwas Einfluss auf die Effizienz der Aerosol-Übertragung. 6 </li><li> Verwenden Sie Auffangbecken oder Biosicherheitswerkbank beim Anbringen des Gases Übertragungskappe Ihre Kultur Flasche auf die richtige Containment im Falle von Verschütten biologischen Arbeitsstoffen zu gewährleisten. </li><li> Einleitung und Beendigung von Trägergasstrom Ihre Probeflasche in einer Weise, die nicht bauen steigt der Druck in der Flasche. </li></ol> 3. Instrument Optimierung HINWEIS: SESI-MS speziell auf Probe flüchtigen ausgelegt, so schränken die Verwendung von duftenden Körperpflegeprodukten (zB Kölnisch Wasser, Mundwasser, Lotionen, Weichspüler), Gummi, Zigaretten, etc. vor Gebrauch des Instruments. Fest verschließen alle flüchtigen Chemikalien im Labor, und die Kontrolle Zugluft so weit wie möglich während der Prüfung. Die folgende instrumentelle Parameter, die alle betreffen Signalintensität und Stabilität, müssen Sie für Ihr Instrument und Experiment optimiert werden. <ol><li> Elektrospray-Lösung und Durchfluss: Wählen Sie die passende Elektrospray Lösung für die Klasse von Molekülen gewünschten Ziel, unter Berücksichtigung der operativen Instrument Polarität (positiv oder negativ-Ionen-Modus) und molekularen Charakter der Zielverbindungen. In diesem Versuch wurde die Elektrospray-Lösung 0,1% Ameisensäure, 5,0% Methanol, 94,9% Wasser (v / v), der das Signal Intensität von weniger polaren Molekülen erhöht while eine gute Stabilität des Signals. Die Lösung ist bei einer Flussrate von 5 nl / s. geliefert </li><li> Gasstrom: Der Gasstrom kann die Elektrospray Stabilität und die Signalintensität beeinflussen. CO 2 (≥ 99,99%) bei einer Flussrate von 2 l / min zum Einsatz. </li><li> Needle Form und Funktion: Die Nadelspitze Form und Position stark auf die Signalintensität und Stabilität. Bei der Installation einer neuen Nadel, muss die Position der Nadel optimiert, um eine Balance zwischen geringem Hintergrund, hohe Analyt-Signal Intensität und Stabilität des Signals zu erzeugen. Um SESI Spektren nach einer Nadel ändern zu reproduzieren, ist es notwendig, in regelmäßigen Abständen zu sammeln Spektren, wie Sie die Nadel zu verstellen, bis Sie in der Lage, das beobachtete Spektrum, um Ihre Daten passen. Die Entfernung von Elektrospray Nadelspitze Massenspektrometrie Öffnung wird 1 - 5 mm. </li><li> Angelegte Spannung: Die Spannung, die auf das System angewendet wird, betrifft das Signal Ionenintensität und die Stabilität der Elektrospray Taylor Kegel. Darüber hinaus ist die optimale Spannung abhängig von Ihrem Elektrospray-Lösung und die Nadelspitze zu gestalten. Zu Beginn Ihrer Reihe von Experimenten, bestimmen Sie die Spannung, die die optimale Bandbreite und Stabilität des Signals ergibt sich für Ihr System und verwenden Sie dann diese Spannung für alle nachfolgenden Experimente. Für unser System angelegten Spannungen von 2,0 - 5,0 kV bieten optimale Signalstärke und Elektrospray Stabilität. Für dieses Experiment 2,5 kV verwendet wird. </li></ol> 4. Einschalten und Einstellen des SESI-MS für die Analyse <ol><li> Beginnen Sie, indem sichergestellt wird, dass die Spannungsversorgung ausgeschaltet ist und dass das System der Elektrizität entladen. Tun Sie dies, indem 1) die Gewährleistung der Anzeige leuchtet die Spannungsversorgung abgeschaltet, 2) die Gewährleistung der Spannung auf dem Multimeter Null ist, und 3) die Erdung der elektrischen Leitungen. </li><li> Installieren Sie die entsprechende Elektrospray-Lösung für Ihr Experiment. </li><li> Schalten Sie das Trägergas und stellen Sie den Strom, um die Rate für Ihr Experiment. </li><li> Druck auf die Elektrospray Reservoir zur Lieferung der Elektrospray-Lösung in die Reaktionskammer zu initiieren. </li><li> Schalten Sie die Spannungsversorgung und die Spannung auf einen entsprechenden Wert für Ihre Experimente. </li></ol> HINWEIS: An dieser Stelle der Metalloberflächen der Ionisierungsquelle der Lage sind, liefern eine gefährliche Schock. Seien Sie äußerst vorsichtig bei der Arbeit rund um das Instrument, wenn die Spannungsversorgung eingeschaltet worden ist. <ol start="6"><li> Richten Sie ein Tuning-Verfahren zur Überwachung der SESI-MS-Spektrum während Sie fein abgestimmte Anpassungen der angelegten Spannung. Verwenden Sie die Aufnahme-Parameter, die Sie für Ihr System und Ihre Experiment optimiert. Deaktivieren Sie das Multiple Channel Acquisition (MCA) Kontrollkästchen (falls zutreffend), so dass jeder Scan eine unabhängige Spektrum erzeugt, stellen Sie die Aufnahmezeit auf 10 bis 15 min, und starten Sie die Übernahme. Spectra des Trägergases Hintergrund sollte nun beobachtet werden. </li><li> Machen Feinabstimmung Anpassungen der angelegten Spannung zu einer stabilen Gesamtrendite (TIC) und reproduzierbare Scans, dass die CO 2-Scans für Ihre früheren Experimenten überein zu erhalten. Sobald die Spannung Anpassungen vorgenommen wurden, weiterhin Spektren und TIC für fünf Minuten, um sicherzustellen, das Instrument stabilisiert zu sammeln. </li><li> Sobald instrumental Stabilität gewährleistet ist, bis der Erwerbsmethode entsprechend Ihrer Proben gesetzt, die Anpassung der Messzeit, Datenbereich und MCA Auswahl nach Bedarf. Sammeln Sie ein Trägergas Hintergrund Spektrum für Ihre Unterlagen. </li></ol> 5. Die Erteilung einer flüchtigen Fingerabdruck Ihrer Bakterienkultur <ol><li> Zum Sammeln ein leeres Spektrum, direkt das Trägergas durchströmt den Bypass-Leitungen, und fügen Sie die Blindprobe (Ventile geschlossen), um das Gas Transferstraßen des Instruments. </li><li> Öffnen Sie die Ventile, um die Probe-Flasche, und schließen Sie die Ventile der Bypass-Leitungen. </li><li> Lassen Sie das System für 30 Sekunden ausgleichen, während welcher Zeit die Feuchtigkeit in der Reaktionskammer stabilisiert. Diese Zeit der Äquilibrierung ist unerlässlich für den Erhalt von reproduzierbaren Spektren. Um sicherzustellen, dass das System äquilibriert ist, möchten Sie vielleicht die TIC, die während der Aquilibrierungsperiode Änderung überwachen und stabilisieren danach. </li><li> Sobald das System äquilibriert, initiieren Spektrum Sammlung. </li><li> Nach dem Spektrum gesammelt, entfernen Sie die Probeflasche von dem ersten Öffnen des Trägergases Bypass-Leitungen, dann schließt die Probe Ventile, und schließlich der Entnahme der Probe Flasche. Spülen Sie das System mit dem Trägergas für 2 bis 4 min, das Entfernen der Feuchtigkeit und adsorbierten flüchtigen Stoffen aus dem Transferstraßen, Verhinderung von Probe zu Probe Verschleppung. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5,2 bis 5,5 für jede bakterielle Probe intermittierend Erfassung zusätzlicher Leerspektren einer gründlichen blank Subtraktion zu gewährleisten. Unvollständige blank Subtraktion wird die FührungAussehen der chemischen Hintergrund Gipfel in Ihre verarbeitet Spektrum, die für Atmosphärendruck-Ionisation Techniken (z. B. Phthalate, Silikone, etc.). 9 </li><li> Bei der Erhebung Ihrer Spektren, sicherzustellen, dass die Ionen-Signale werden nicht mehr als die lineare Nachweisgrenzen des Instruments, wie die TIC und die maximale Intensität der einzelnen Peaks ermitteln. Ionen Überschreiten des oberen Grenzen Ihres Instruments Detektor erzeugen kann Artefakt Peaks, die nicht repräsentativ sind Ihrer Probe. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Als ein Beispiel für die SESI-MS-Spektren, die für bakterielle volatiles, die positive Ionen-Modus flüchtigen Fingerabdrücke für E. erhältlich coli und P. aeruginosa aerob in LB-Lennox für 24 h gezüchtet bei 37 ° C angezeigt (Abb. 2). Die E. coli flüchtigen Spektrum von Indol bei m / z = 118 dominiert, gibt die E. coli Kulturen ihre charakteristischen Geruch, während das Spektrum von P. aeruginosa enthält eine größere Vielfalt an protonierbare Gipfel. Bitte beachten Sie, dass die relativen Intensitäten der Peaks in den flüchtigen Spektrum abhängig von der instrumentalen Parameter in Abschnitt 3 beschrieben werden. Diese Parameter müssen dicht von Experiment zu Experiment kontrolliert werden, um reproduzierbare Spektren zu erhalten. <img src="/files/ftp_upload/2664/2664fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2 Blank-subtrahiert positive Ionen-Modus SESI-MS-Spektren (20 bis 150 m / z). E. coli K12 und P. aeruginosa PAO1 volatiles nach 24 h aeroben Wachstumsbedingungen in LB-Lennox bei 37 ° C. Für weitere Informationen über die Gipfel in der SESI Spektren entnehmen Sie bitte Zhu et al. 8.

<ol>
	<li>Fuerstenau, S., Kiselev, P., Fenn, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESI-MS+in+the+analysis+of+trace+species+in+gases.">ESI-MS in the analysis of trace species in gases.</a> , (1999).</li><li>Wu, C., Siems, W. F., Hill, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+electrospray+ionization+ion+mobility+spectrometry/mass+spectrometry+of+illicit+drugs.">Secondary electrospray ionization ion mobility spectrometry/mass spectrometry of illicit drugs.</a> Anal. Chem. 72, 396-403 (2000).</li><li>Tam, M., Hill, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+electrospray+ionization-ion+mobility+spectrometry+for+explosive+vapor+detection.">Secondary electrospray ionization-ion mobility spectrometry for explosive vapor detection.</a> Anal. Chem. 76, 2741-2747 (2004).</li><li>Martinez-Lozano, P., Rus, J., de la Mora, G. F., Hernandez, M., de la Mora, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+electrospray+ionization+(SESI)+of+ambient+vapors+for+explosive+detection+at+concentrations+below+parts+per+trillion.">Secondary electrospray ionization (SESI) of ambient vapors for explosive detection at concentrations below parts per trillion.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 287-294 (2009).</li><li>Martinez-Lozano, P., de la Mora, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-line+detection+of+human+skin+vapors.">On-line detection of human skin vapors.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 1060-1063 (2009).</li><li>Martinez-Lozano, P., de la Mora, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray+ionization+of+volatiles+in+breath.">Electrospray ionization of volatiles in breath.</a> Int. J. Mass Spectrom. 265, 68-72 (2007).</li><li>Martinez-Lozano, P., de la Mora, J. F., F, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+analysis+of+fatty+acid+vapors+in+breath+by+electrospray+ionization+and+atmospheric+pressure+ionization-mass+spectrometry.">Direct analysis of fatty acid vapors in breath by electrospray ionization and atmospheric pressure ionization-mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 80, 8210-8215 (2008).</li><li>Guo, X. H., Bruins, A. P., Covey, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+typical+chemical+background+interferences+in+atmospheric+pressure+ionization+liquid+chromatography-mass+spectrometry.">Characterization of typical chemical background interferences in atmospheric pressure ionization liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 3145-3150 (2006).</li><li>Rudzinski, C. M., Herzig-Marx, R., Lin, J., Szpiro, A., Johnson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pathogen detection using headspace analysis. , 16-16 (2004).</li><li>Lechner, M., Fille, M., Hausdorfer, J., Dierich, M., Rieder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+bacteria+in+vitro+by+mass+spectrometric+fingerprinting:+A+pilot+study.">Diagnosis of bacteria in vitro by mass spectrometric fingerprinting: A pilot study.</a> Curr. Microbiol. 51, 267-269 (2005).</li><li>Schulz, S., Dickschat, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+volatiles:+The+smell+of+small+organisms.">Bacterial volatiles: The smell of small organisms.</a> Nat. Prod. Rep. 24, 814-842 (2007).</li><li>Ligor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+methods+for+breath+investigation.">Analytical methods for breath investigation.</a> Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 2-12 (2009).</li><li>Cao, W. Q., Duan, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breath+analysis:+Potential+for+clinical+diagnosis+and+exposure+assessment.">Breath analysis: Potential for clinical diagnosis and exposure assessment.</a> Clin. Chem. 52, 800-811 (2006).</li><li>Law, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+characterization+of+complex+viscous+liquids+at+the+molecular+level.">Rapid characterization of complex viscous liquids at the molecular level.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 8277-8280 (2009).</li><li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sampling+analytes+from+cheese+products+for+fast+detection+using+neutral+desorption+extractive+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Sampling analytes from cheese products for fast detection using neutral desorption extractive electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal. Bioanal. Chem. 397, 1549-1556 (2010).</li><li>Fleming-Jones, M. E., Smith, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatile+organic+compounds+in+foods:+A+five+year+study.">Volatile organic compounds in foods: A five year study.</a> J. Agric. Food Chem. 51, 8120-8127 (2003).</li><li>Calkins, C. R., Hodgen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fresh+look+at+meat+flavor.">A fresh look at meat flavor.</a> Meat Sci. 77, 63-80 (2007).</li></ol>

Bakterien produzieren verschiedene Kombinationen von flüchtigen, die Identifizierung von Bakterien 10-12 und die Beurteilung der Stoffwechsellage eingesetzt werden können. Die SESI-MS hier beschriebene Methode bietet die Möglichkeit, schnell Charakterisierung bakterieller volatiles (in zwei Minuten oder weniger) ohne Probenvorbereitung, Erzeugen einer bakteriellen &quot;Fingerabdruck&quot; zur Identifizierung der Arten. 8 In den letzten Jahrzehnten andere Atmosphärendruck-Ionisation MS-Techniken haben zur Charakterisierung von flüchtigen Verbindungen, einschließlich selektiver Ionen Strömungsrohr (SIFT) und Proton-Transfer-Reaktion (PTR)-Massenspektrometrie angewendet worden. Der markante Vorteil, dass SESI bietet gegenüber diesen anderen Ionisation-Methoden ist, dass es möglich Fragment spezifischen Peaks (vorausgesetzt, die geeignete Art von Massenspektrometer für SESI angepasst), die ein wichtiges Instrument zur Identifizierung von Substanzen ist. Wir haben nicht auf Spitzenzeiten Fragmentierung im Protokoll aufgeführten, aber Beispiele dafür, wie Fragmentierung Informationen finden Sie in der Charakterisierung von bakteriellen flüchtigen verwendet werden, entnehmen Sie bitte Zhu et al. 8 SESI-MS hat die direkte Anwendung auf die in-situ-Detektion von bakteriellen Infektionen der Lunge über Atem-Analyse, sondern kann auch eine andere Einstellung, in der flüchtige Probenahme ist möglich angewendet werden. Zum Beispiel die Analyse von flüchtigen Stoffen im Urin, Blut und Atem, die relevant für die Diagnose von Stoffwechselerkrankungen, sind Magen-Darm-Erkrankungen, Krebs, und der Umwelt gegenüber, gut zu SESI-MS geeignet. 13,14 SESI-MS hat auch ein breites Spektrum von nicht-klinischen VOC-Fingerprinting-Anwendungen, einschließlich schnelle Analyse von Lebensmitteln, die für die charakteristische flüchtige mit Reifung, Alterung oder Verderb verbunden. 15-18

<table border="1"><tbody><tr><td> Material Name </td><td> Typ </td><td> Firma </td><td> Katalog # </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td> API-3000 Triple-Quadrupol- </td><td> Instrument </td><td> SCIEX </td><td></td><td> Gekauft mit Analyst 1.4.2 (Applied Biosystems) </td></tr><tr><td> SESI Ion Source </td><td> Instrument </td><td></td><td></td><td> Custom-made; Siehe Referenz 6 </td></tr><tr><td> Gas-Durchflussmesser </td><td> Ausstattung </td><td> Cole-Parmer </td><td> EW-03217-74 </td><td></td></tr><tr><td> Kohlendioxid </td><td> Ausstattung </td><td> Airgas </td><td> CD I300 </td><td> ≥ 99,99% reinem </td></tr><tr><td> Stickstoff </td><td> Ausstattung </td><td> Airgas </td><td> NI UHP300 </td><td> Hochreine </td></tr><tr><td> 100 ml Glas Medien Flaschen </td><td> Ausstattung </td><td> VWR </td><td> 89012-114 </td><td> GL45-Gewinde </td></tr><tr><td> Flaschenverschlüsse mit Luer-Anschlüsse </td><td> Ausstattung </td><td> Bio Chem Fluidics </td><td> 00945T-3 </td><td> Cap Montage </td></tr><tr><td> Luer-Anschluss-Stecker </td><td> Ausstattung </td><td> Bio Chem Fluidics </td><td> 009LP </td><td> Cap Montage </td></tr><tr><td> Tubing 1 / 4 &quot;(OD) x 1 / 8&quot; (ID) </td><td> Ausstattung </td><td> Cole-Parmer </td><td> EW-95875-02 </td><td> Cap Montage-und Gas-Transferstraßen </td></tr><tr><td> Tubing 1 / 8 &quot;(OD) x 1 / 16&quot; (ID) </td><td> Ausstattung </td><td> Cole-Parmer </td><td> EW-06605-27 </td><td> Cap Montage </td></tr><tr><td> Zwei-Wege-Ventile </td><td> Ausstattung </td><td> Cole-Parmer </td><td> 07391-04 </td><td> Cap Montage </td></tr><tr><td> Filter, Grade AAQ </td><td> Ausstattung </td><td> Balston Filter </td><td> 9922-05 </td><td></td></tr><tr><td> Ameisensäure, LC / MS grade </td><td> Reagens </td><td> Fischer </td><td> A117-05AMP </td><td> Elektrospray-Lösung </td></tr><tr><td> Methanol, LC / MS grade </td><td> Reagens </td><td> Fischer </td><td> A456-500 </td><td> Elektrospray-Lösung </td></tr><tr><td> Wasser, LC / MS grade </td><td> Reagens </td><td> Fischer </td><td> W6-500 </td><td> Elektrospray-Lösung </td></tr></tbody></table>

characterizing bacterial volatiles using secondary electrospray ionization mass spectrometry (sesi-ms)

Sekundäre Elektrospray Massenspektrometrie (SESI-MS) ist eine Methode zum raschen Nachweis von flüchtigen Verbindungen entwickelt, ohne die Notwendigkeit für Probenvorbehandlung. Die Methode wurde zuerst von Fenn und Kollegen 1 beschrieben und hat den Nachweis von illegalen Drogen 2 und Sprengstoff 3-4, die Charakterisierung der Haut flüchtigen 5, und die Analyse des Atems 6-7 angewendet worden. SESI Ionisation durch Protonen-Transfer-Reaktionen zwischen den Elektrospray-Lösung und die flüchtigen Analyten und ist daher für die Analyse von hetero-organischen Molekülen geeignet, ebenso wie in traditionellen Elektrospray-Ionisation (ESI). Doch im Gegensatz zu Standard-ESI, tritt das Proton-Transfer-Prozess von SESI in der Gasphase statt in Lösung (Abb. 1), und deshalb SESI am besten geeignet ist zur Detektion von organischen flüchtigen und Aerosole. Wir erweitern den Einsatz von SESI-MS zur Detektion von bakteriellen volatiles als eine Methode zur Identifizierung von Bakterien und Charakterisierung 8. Wir haben gezeigt, dass SESI-MS flüchtigen Fingerprinting, mit einer statistischen Analyse-Verfahren kombiniert, verwendet werden, um Bakterien-Gattungen, Arten und Mischkulturen in einer Vielzahl von Nährmedien unterscheiden. 8 Hier haben wir die Schritte für den Erhalt von bakteriellen flüchtigen Fingerabdrücke mit SESI bieten -MS, darunter die instrumentelle Parameter, die optimiert werden, um robuste Identifizierung von Bakterien und Charakterisierung sicher sein sollte.

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS at JoVE.com

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

Sekundäre Elektrospray Massenspektrometrie (SESI-MS) ermöglicht die Detektion von flüchtigen organischen Verbindungen (VOC), ohne dass für jede Vorbehandlung der Probe. Dieses Protokoll enthält Anweisungen für die schnelle (innerhalb von Minuten) Charakterisierung von bakteriellen VOCs mit SESI-MS.

Charakterisierung Bakterielle Flüchtige mit Secondary Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie (SESI-MS)

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for ...

characterizing-bacterial-volatiles-using-secondary-electrospray

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS)

17.8K Aufrufe.  University of Vermont. Sekundäre Elektrospray Massenspektrometrie (SESI-MS) ermöglicht die Detektion von flüchtigen organischen Verbindungen (VOC), ohne dass für jede Vorbehandlung der Probe. Dieses Protokoll enthält Anweisungen für die schnelle (innerhalb von Minuten) Charakterisierung von bakteriellen VOCs mit SESI-MS.

Serie: Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Cellular Lipidextraktion für Targeted Stable Isotope Dilution Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Analyse

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Forschung

Biotechnik

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

Bakterielle Erkennung und Identifizierung mit elektrochemischen Sensoren

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

Imaging von biologischem Gewebe durch Desorption Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Immortalized cancer cell lines can be grown as 3D cell cultures, a valuable model for biological research. This protocol describes mass spectrometry imaging of 3D cell cultures, including improvements in the sample preparation platform. The goal of this protocol is to instruct users to prepare 3D cell cultures for mass spectrometry imaging analysis.

Probenvorbereitung Strategien für Massenspektrometrie Imaging von 3D-Zellkulturmodelle

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in complex mixtures. It is often used to analyze gasoline, jet fuel, diesel, bio-diesel and the organic fraction of bio-crude/bio-oil. In most of those analyses, the first dimension of separation is non-polar, followed by a polar separation. The aqueous fractions of bio-crude and other aqueous samples from biofuels production have been examined with similar column combinations. However, sample preparation techniques such as derivatization, solvent extraction, and solid-phase extraction were necessary prior to analysis. In this study, aqueous fractions obtained from the hydrothermal liquefaction of algae were characterized by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry without prior sample preparation techniques using a polar separation in the first dimension followed by a non-polar separation in the second. Two-dimensional plots from this analysis were compared with those obtained from the more traditional column configuration. Results from qualitative characterization of the aqueous fractions of algal bio-crude are discussed in detail. The advantages of using a polar separation followed by a non-polar separation for characterization of organics in aqueous samples by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry are highlighted.

A two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry method is described for characterization of the aqueous fraction of bio-crude produced from hydrothermal liquefaction of algae. This protocol can also be employed to analyze the aqueous fraction of liquid products from fast pyrolysis, catalytic fast pyrolysis, catalytic deoxygenation and hydro-treating.

Qualitative Charakterisierung der wässrigen Fraktion von hydrothermale Verflüssigung von Algen mit Hilfe von 2D-Gaschromatographie mit Time-of-Flight Mass Spectrometry

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) is an example of such methods, where features of matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) (e.g., pulsed nature of desorption) and electrospray ionization (ESI) (e.g., soft-ionization) are combined. One of the major advantages of MALDESI is its inherent versatility. In MALDESI experiments, an ultraviolet (UV) or infrared (IR) laser can be used to resonantly excite an endogenous or exogenous matrix. The choice of matrix is not analyte dependent, and depends solely on the laser wavelength used for excitation. In IR-MALDESI experiments, a thin layer of ice is deposited on the sample surface as an energy-absorbing matrix. The IR-MALDESI source geometry has been optimized using statistical design of experiments (DOE) for analysis of liquid samples as well as biological tissue specimens. Furthermore, a robust IR-MALDESI imaging source has been developed, where a tunable mid-IR laser is synchronized with a computer controlled XY translational stage and a high resolving power mass spectrometer. A custom graphical user interface (GUI) allows user selection of the repetition rate of the laser, number of shots per voxel, step-size of the sample stage, and the delay between the desorption and scan events for the source. IR-MALDESI has been used in variety of applications such as forensic analysis of fibers and dyes and MSI of biological tissue sections. Distribution of different analytes ranging from endogenous metabolites to exogenous xenobiotics within tissue sections can be measured and quantified using this technique. The protocol presented in this manuscript describes major steps necessary for IR-MALDESI MSI of whole-body tissue sections.

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.

Ganzkörper-Massenspektrometrie Imaging durch Infrarot-Matrix-assistierte Laser-Desorptions-Elektrospray-Ionisations (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

Zellwanderung in dreidimensionales In Vitro Charakterisierung Wunde Umgebungen

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Engineering &#039;Golden&#039; Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).

Engineering-"Golden" Fluoreszenz durch Selektionsdruck Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren und Protein-Analyse durch Massenspektrometrie und Fluoreszenz

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria can undergo changes in the physiology due to the exposure to host growth environment and the presence of the host cells. We developed an assay to rapidly measure the virulence state of bacteria that minimize the extent to which bacteria grow in the presence of host cells. Bacteria and amoebae are mixed together and immobilized on a single imaging plane using an agar pad. The procedure uses single-cell fluorescence imaging with calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) as an indicator of host cell health. The fluorescence of host cells is analyzed after 1 h of exposure of host cells to bacteria using epifluorescence microscopy. Image analysis software is used to compute a host killing index. This method has been used to measure virulence within planktonic and surface-attached Pseudomonas aeruginosa sub-populations during the initial stage of biofilm formation and may be adapted to other bacteria and other stages of biofilm growth. This protocol provides a rapid and robust method of measuring virulence and avoids many of the complexities associated with the growth and maintenance of mammalian cell lines. Virulence phenotypes measured here using amoebae have also been validated using mouse macrophages. In particular, this assay was used to establish that surface attachment upregulates virulence in P. aeruginosa.

Here, we present a protocol to measure the virulence of planktonic or surface-attached bacteria using D. discoideum (amoeba) as a host. Virulence is measured over a period of 1 h and host killing is quantified using fluorescence microscopy and image analysis. We demonstrate this protocol using the bacterium P. aeruginosa.

Einen schnellen Image-basierte bakteriellen Virulenz-Assay mit Amöben

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

Herstellung von Proteinproduktion synthetischer Zellen mit zellfreien bakteriellen Extrakten, Liposomen und Emulsionstransfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...