Wir danken für die Unterstützung der NIH Zuschüsse P30ES013508 und 5T32GM008076. Wir danken auch Thermo Scientific für den Zugang zu SIEVE 2.0 und Drs. Eugene Ciccimaro und Mark Sanders von Thermo Scientific für hilfreiche Diskussionen.

1. Beispiel Extraktion aus Zellen <ol><li> Für eine 10 cm Platte von Zellen: collect 1,5 ml angehoben Zellsuspension in Medien in ein beschriftetes 10 ml Glaszentrifugenröhrchen. Für Anhänger Linien sollten die Zellen mit sanften Schaben in 1,5 ml Medium auf Eis gehalten angehoben werden. Optional: Wenn interne Standards verwendet werden, fügen Sie die entsprechende Aliquot bei diesem Schritt. Kommentar: Abschrecken des Zellstoffwechsels ist entscheidend für bestimmte Metaboliten. Für die Analyse von Zeit-und Kleinschreibung Metaboliten sollten Verfahren wie kalte Methanolextraktion Betracht gezogen werden. 17 </li><li> 6 ml Chloroform (CHCl 3) / Methanol (CH 3 OH) (2:1, v / v) zu jedem der 10 ml Glasröhrchen mit den Proben. Stellen Sie die Proben in einem Shaker oder Multi-Vortexer bei niedriger Geschwindigkeit für 30 min. Nach dem Schütteln werden die Proben mit einer geringen Beschleunigung / Verzögerung Einstellung bei 1.935 xg für 10 min bei 4 ° C zentrifugiert, um die Phasen vollständig zu trennen. Wahlfrei </em&gt;: Um zu vermeiden, unter Verwendung von CHCl 3, Extraktionen mit Dichlormethan durchgeführt werden (CH 2 Cl 2) 18,12. </li><li> Mit einem langen Stiel Pasteurpipette übertragen die organische (untere) Schicht auf eine neue Pre-markierten 10 ml Glaszentrifugenröhrchen. Weiter zum 4.1. </li><li> Übertragen Sie die obere wässrige später in einen sauberen Kunststoff 2 ml Eppendorf-Röhrchen. Verdampft die Probe unter Stickstoffgas. Weiter zu 2.6.2 für wässrige Phase Entsalzung oder weiter auf 4,1 für die direkte Analyse. </li></ol> 2. Beispiel Extraktion aus Serum <ol><li> Übertragen Sie 20 ul Serum in einem Kunststoff 2 ml Eppendorf-Röhrchen. Optional: Wenn interne Standards verwendet werden, fügen Sie die entsprechende Aliquot bei diesem Schritt. </li><li> In 190 ul CH 3 OH und Vortex für 10 Sekunden. </li><li> In 380 ul CHCl 3 und Vortex für 10 Sekunden. </li><li> In 120 ul H 2 O, um eine Phasentrennung zu induzieren. Vortex die Proben für 10 sec und damit bei RT für 10 äquilibrierenmin. </li><li> Zentrifugieren Sie die Proben bei 8000 g für 10 min bei 4 ° C, um die Phasen zu trennen. </li><li> Übertragen Sie die untere organische Phase in einen sauberen Kunststoff 2 ml Eppendorf-Röhrchen. Weiter zum 4.1. </li><li> Übertragen Sie die obere wässrige später in einen sauberen Kunststoff 2 ml Eppendorf-Röhrchen. Verdampft die Probe unter Stickstoffgas. </li><li> Re-suspend die Probe in 200 ul H 2 O. Säure oder Base Reagenzien (0,1% Essigsäure, Ameisensäure oder 0,1% Ammoniumhydroxid) verwendet werden, um bevorzugt extrahieren pH-empfindliche Metaboliten werden. Ultraschallbad für 20 min auf Eis, um erneut zu suspendieren die Probe vollständig. </li><li> Aktivieren Sie die C18-Spin-Säulen mit 500 ul CH 3 OH. </li><li> Equilibrieren die Spin-Säule mit zwei Waschungen von 500 ul H 2 O und laden Sie dann die Probe. Wenn Säure / Base-Reagenzien verwendet werden, halten diese Konzentration in den Waschschritten. </li><li> Waschen mit 500 ul H 2 O, um die Probe zu entsalzen. Auch wenn Säure / Base-Reagenzien verwendet werden, halten diese Konzentration in der WäscheSchritte. </li><li> Eluieren mit zwei Volumen von 200 ul 80% CH 3 OH in H 2 O in ein beschriftetes sauberes 2 ml Eppendorf-Röhrchen. Auch wenn Säure / Base-Reagenzien verwendet werden, halten diese Konzentration in den Waschschritten. Weiter zum 4.1. </li></ol> 3. Beispiel Extraktion aus Gewebe <ol><li> Je nach Gewebe zwischen 10-100 mg von gefrorenem Gewebe verwenden. Fügen Sie das ganze Stück Gewebe zu einer pre-markierten 2 ml low retention Eppendorf-Röhrchen mit 1 ml PBS (1 M, pH 6,8) in einem Eisbad. Optional: Wenn interne Standards verwendet werden, fügen Sie es in den Puffer, bevor das Gewebe. </li><li> Homogenisieren des Gewebes im Eis mit einer elektrischen Schleifmaschine Gewebe für 30 sec in jedem Eppendorf. Zwischen Proben, reinigen das Gewebe Mühle in zwei getrennten Röhren mit CH 3 OH und H 2 O auf. </li><li> Übertragen Sie die Gewebehomogenat mit einer Kunststoff-Pipette in ein beschriftetes 10 ml Glaszentrifugenröhrchen. Nach der Übertragung, spülen jedes Eppendorf-Röhrchen2x mit 1 ml CH 3 OH und fügen Sie die Waschungen der Gewebehomogenat in den Glasröhren. </li><li> 4 ml CHCl 3 zu jeder der 10 ml-Röhrchen, die das Gewebe-Homogenat und CH 3 OH wäscht. Stellen Sie die Proben in einem Shaker oder Multi-Vortexer bei niedriger Geschwindigkeit für 30 min. </li><li> Nach dem Schütteln, zentrifugieren Sie die Proben mit einer geringen Beschleunigung / Verzögerung Einstellung bei 1.935 xg für 10 min vollständig zu trennen die Phasen Optional:. Um zu vermeiden, mit Chloroform, haben Extraktion mit CH 2 Cl 2 entwickelt worden. </li><li> Mit einem langen Stiel Pasteurpipette übertragen die organische (untere) Schicht auf eine neue Pre-markierten 10 ml Glaszentrifugenröhrchen. Weiter zum 4.1. </li><li> Mit einem langen Stiel Pasteurpipette übertragen die wässrige Schicht auf eine neue Pre-markierten 10 ml Glaszentrifugenröhrchen. Gehe zu 2.6.2 für Entsalzung oder weiter auf 4,1. </li></ol> 4. Re-Suspension und Filtration von Proben für UPLC <ol><li> Man dampft das samples unter Stickstoffgas. </li><li> Den Inhalt herabgetrocknetes Proben in einem geeigneten Volumen der Ausgangslösung für die gewünschte UPLC Methode (siehe Tabelle 1). 50-100 ul ist in der Regel eine wünschenswerte Resuspension Volumen. Vortexen und / oder einer Pipette die Probe nach oben und unten, um das Lösen der Analyten zu unterstützen. </li><li> Übertragen Sie die Probe in einen 0,22 um Nylon-Rohr-Filter und drehen sich mit bis zu 14.000 xg, bis die Probe vollständig durch den Filter (ca. 5 Min.) geleitet. Stellen Sie sicher, dass es keine sichtbare Partikel in der Probe verbleibt. </li><li> Den Überstand des gefilterten Probe in ein beschriftetes UPLC Fläschchen mit Einsatz. Cap Fläschchen, dann streichen Sie das Fläschchen, um alle Blasen aus dem Boden der Probe Fläschchen entfernen. Legen Sie die Probe in der gekühlten Autosampler (4-5 ° C). </li></ol> 5. UPLC-Setup <ol><li> Mit der Steuer-Software für die Flüssigkeitschromatographen, erstellen Sie einen Lauf für die organischen Probe aus der genannten Bedingungen in der Basis <strong&gt; Tabelle 1. Dann erstellen Sie eine Methode für die wässrige Phase aus den in Tabelle 1 aufgelistet. Optional: Wenn ein bekannter Satz von Analyten von großem Interesse sind, optimieren die UPLC Bedingungen mit den schweren markiertes Analogon dieser Verbindungen und erzeugen ein Verfahren unter Verwendung dieser Bedingungen . </li><li> Lassen Sie die UPLC angemessen auszugleichen. Dies sollte eine vollständige Grundierung von Lösungsmitteln, bevor Sie eine Spalte, und nach den Anweisungen des Herstellers für die Äquilibrierung Volumen von einer neuen Spalte (in der Regel 3-5 Säulenvolumen) umfassen. Pflegen Sie ein Protokoll ab Rückdrücke zur Diagnose zukünftige Probleme. </li></ol> 6. Massenspektrometer-Setup <ol><li> Mit der Steuersoftware für den hochauflösenden Massenspektrometer, erstellen Sie eine positive Mode-Verfahren unter Verwendung der in Tabelle 2 aufgeführt. Dann unter den gleichen Bedingungen, einen negativen Modus Verfahren Optional:. Wenn ein bekannter Satz von Analyten sind von hoher intERest, zu optimieren und eine Optik, mit der schweren Bedingungen markiertes Analogon dieser Verbindungen enthält, und eine Methode unter Verwendung dieser Bedingungen. </li><li> Reinigen und kalibrieren Sie das Gerät, eine stabile Spray in das Spektrometer und genügend Zeit für die Kalibrierung Lösung angemessen von der Quelle und Optik abzuleiten. Akzeptabel Stabilität der Spray sollte eine 3-5% der Intensität über mindestens 100 Scans RSD mit Einspritzung der Kalibrierlösung zur gleichen Durchfluss wie die LC-Methode verwendet wird. </li><li> Richten Sie die Sequenz für alle Proben, setzen entsprechende Injektionsvolumen, und führen Sie eine leere vor der ersten Probe. Wenn Verschleppung oder Matrix-Effekte zwischen den Proben vermutet werden, laufen angemessene Rohlinge / Wäschen. Die Proben sollten Einrichtung in einer randomisierten Weise unter Verwendung eines Zufallszahlengenerators und eine Taste, um die Charge durch die Analyse eingeführt Wirkungen zu vermeiden. Kommentar: Qualitätskontrolle Proben einschließlich stabiler Isotope Normen oder Analysestandards wahrscheinliche Ziele können seinäußerst wertvoll bei der Fehlersuche und Sicherung zuverlässige, reproduzierbare und valide Ergebnisse. Ein technisches Replikat eines Standard nur Probe durch eine Blindlösung gefolgt kann verwendet werden, um Zugriff auf Abweichung von Signalintensität und Verweildauer sowie Verschleppung in die leere run werden. </li><li> Start-Sequenz und überwachen regelmäßig für Probleme wie Druckschwankungen oder Verlust der Signalstärke in der Flucht. Wenn eine schwere Probleme erkannt werden, stoppen den Lauf, und wiederholen von 6,2. </li></ol> 7. Differential Analysis <ol><li> Zwei Workflows werden für dieses Protokoll vorgestellt. Die erste ist durch SIEVE 2.0, proprietäre markierungsfreie Differential-Analyse-Software von Thermo Fisher verkauft. Der zweite Workflow ist durch XCMS Online, eine kostenlose Plattform durch Scripps Research Institute. 11. Vor Beginn Differentialanalyse, manuell überprüfen die Tics oder schauen gefiltert Chromatogramme für jede bekannte Verbindung in der Probe, um die Reproduzierbarkeit der Läufe zu gewährleistenund Einspritzung / UPLC / Aerosol Stabilität in allen Proben. </li><li> SIEVE <ol><li> Übertragen Sie die. Rohdaten aus dem Massenspektrometer auf die Festplatte der Workstation, SIEVE installiert ist. (Anmerkung: Laufen Sieb mit Daten auf einem vernetzten oder USB-Port angeschlossen Laufwerk gespeichert ist nicht ratsam, da sie die Geschwindigkeit der Analyse können zu begrenzen.) </li><li> Offene SIEVE, und beginnen ein neues Experiment. </li><li> Legen Sie die entsprechenden Dateien in SIEVE. </li><li> Weisen Vergleichsgruppen und wählen Sie eine einzelne Referenz-Datei, damit SIEVE, um die Parameter für die Analyse zu generieren. </li><li> Folgen Sie den Anweisungen und stellen Sie alle Parameter pro Anforderungen jedes einzelnen Experiments. Oft ist es ratsam, mit strengen Parametern zu starten und dann gehen Sie zurück und lösen Sie die Parameter als großzügiger Einstellungen Analyse Zeit verlängern kann. </li><li> Legen Sie das richtige Addukt Liste für positive oder negative Modus in den Parametern. </li></ol></li><li> XCMS Online <ol><li> Konvertieren von Dateienin einem akzeptablen Format für XCMS Online. In unserem Fall, wandeln wir mzXML Format. 19 </li><li> Offene XCMS Online und E-Mail Job. </li><li> Upload und nennen Datensätzen. Nur zwei Datensätze (zB Steuerung vs Behandlung) können als Stand-alone-XCMS wird Kopf-an-Kopf-Vergleiche beschränkt hochgeladen werden. </li><li> Wählen Sie die gewünschten Einstellungen aus der Dropdown-Liste. Pre-besiedelte Parameter sind für verschiedene Instrumente Setups zur Verfügung, und diese können weiter für experimentelle Bedürfnisse modifiziert werden. In unserem Fall nutzen wir die HPLC-Orbi2 Einstellungen. </li><li> Senden und bestätigen Job. </li></ol></li><li> Data Analysis <ol><li> Für SIEVE und XCMS eine Liste der Rahmen und Ausstattung, bzw. aufgefüllt wird, sobald die Analyse abgeschlossen sein. Stellen Sie sicher, dass die LC Ausrichtung keine Wahrzeichen Peaks überlagert. Wenn eine der unaligned LC läuft große Abweichung zeigen in Wahrzeichen Gipfel kann dies auf ein Problem mit der Probe. Optional: Für SIEVE, wenn interne Standards verwendet werden, findendie entsprechende Peakgruppe und zu normalisieren, um die ausgewählte Fassung. Für XCMS On-line können Normalisierung in einer Tabellenkalkulation nach der Ausfuhr durchgeführt werden. </li><li> Zeichnen Sie die Daten, die von der Variationskoeffizient (CV) innerhalb einer Probe wie Bevölkerung (zB Kontrollproben). Alle großen CV-Werte kann auf ein Problem mit einem oder mehreren Probe. Sortieren Sie die Liste auf die gewünschten Eigenschaften (z. B. p-Wert &lt;0,05, Fold Change&gt; 1.5, niedrige Standardabweichung innerhalb einer Gruppe, etc.) basiert. </li><li> Untersuchen Sie jeden Peak für Peak entsprechende Ausrichtung über Gruppen, Peak-Integration, Gauß-Peak-Form, Signalintensität, Isotope und Addukt Zuordnung. </li><li> Exportieren von Daten als für die weitere Analyse gewünscht oder gezielt Masse Listen zur Bestätigung und MS n Experimente zu generieren. </li></ol></li></ol>

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Autoren haben nichts zu offenbaren.

Untargeted metabolomics bietet ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung von endogenen oder xenobiotischen Biotransformationen, oder die Erfassung eines metabolischen Profils aus einer Probe von Interesse. Der Ausgang der Technik skaliert mit der Auflösung und Empfindlichkeit der verwendeten Technologie zu trennen und analysieren die Probe, die Fähigkeit, mit der große Datenmengen erzeugt umzugehen, und die Fähigkeit, um die Datenmenge für nützliche Informationen (zB genaue Masse Datenbanksuche...

Aufgrund der jüngsten technologischen Fortschritte auf dem Gebiet der HRMS haben ungezielte, Hypothesen-Generierung metabolomics Ansätze werden eine praktikable Ansatz zur Analyse von komplexen Proben. 1-Massenspektrometer zur Auflösung 100.000 erleichtert Routine niedrigen Teil pro Million (ppm) Massegenauigkeit haben sich weitgehend von verschiedenen Herstellern. 2,3 Diese Masse Genauigkeit ermöglicht eine größere Spezifität und Vertrauen in eine vorläufige Zuordnung der Analyten Identität Isotopen Mustererkennung und Addukt Identifikation. 4 Wenn mit einem geeigneten Extraktionsverfahren und High-Performance-LC oder UPLC, komplexe Mischungen gekoppelt kann mit zusätzlichen Spezifität von Verweilzeit Daten abgeleitet analysiert werden. 5 UPLC besitzt größere chromatographische Effizienz und ermöglicht eine höhere Empfindlichkeit, Auflösung und Analyse Zeit macht eine größere Abdeckung des Metaboloms möglich. 6 Die entstehenden großen Datenmengen können in einem integriert werdenmehrerer Differential-Analyse-Software und abgebaut für brauchbare Muster oder einzelne Analyten von Interesse. 7,8,9,10,11 Putative Treffern zunächst identifiziert werden mit einer Kombination aus Spitze Algorithmen, genaue Masse basierte chemische Formel Vorhersage, Fragmentierung Vorhersage und chemische Datenbank suchen. Dieser Ansatz ermöglicht die Priorisierung von Zielen für zeitaufwändige vollständige strukturelle Identifizierung oder für die Entwicklung von empfindlicher und präziser Isotopenverdünnungsanalyse UPLC / ausgewählte oder multiple reaction monitoring / MS-Studien, dass die derzeitige Goldstandard Methoden zur Quantifizierung sind. 12 Die unterschiedliche Art von biologischen Proben ist die Optimierung der Extraktion Protokolle für Urin 13 Zellen 14, 15 Serum oder Gewebe 16 geführt. Dieses Protokoll bietet Extraktionen für Zellen, Serum und Gewebe. Gegebenenfalls haben Kommentare und weitere Referenzen für Modifikationen einbezogengen des Verfahrens zur Bewältigung Einbeziehung von stabilen Isotopen, oder für die Aufnahme von besonders instabilen Metaboliten.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>21-031-CM</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W7-4</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (CH3CN)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A996-4</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (CH3OH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454-4</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A464-4</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (CH3Cl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>366927</td>
			<td>Hazard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (CH2Cl2)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>61030-1000</td>
			<td>To replace chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl Ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>346136</td>
			<td>To replace chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid (FA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4OH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A470-250</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate (HCOONH4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78314</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSpin C18 Columns</td>
			<td>Nest Group Inc</td>
			<td>SS18V</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-200</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Glass Centrifuge Tubes</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>73785-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Plastic Centrifuge Tubes</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>CLS-4301-015</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Vials (glass)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>60000751CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Inserts (glass)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT094171</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Vials (plastic)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002640</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &mu;m Filters</td>
			<td>Corning</td>
			<td>8169</td>
			<td>nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Eppendorf Tubes</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>C-3229-1</td>
			<td>Low Retention</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Resolution Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LTQ XL-Orbitrap</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC/UPLC</td>
			<td>Waters</td>
			<td>nanoACQUITY UPLC</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Source</td>
			<td>Michrom</td>
			<td>Thermo Advance Source</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential Analysis Software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SIEVE 2.0</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanoACQUITY C18 BEH130</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003546</td>
			<td>1.7 &mu;m particle size, 150 mm x 100 &mu;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acentis Express C8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>54262</td>
			<td>2.7 &mu;m particle size, 15 cm x 200 &mu;m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

untargeted metabolomics from biological sources using ultraperformance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (uplc-hrms)

Hier präsentieren wir einen Workflow, um die metabolische Profile für biologische Proben des Interesses einschließlich analysieren; Zellen, Serum oder Gewebe. Die Probe wird zunächst in polaren und nicht-polaren Fraktionen durch eine Flüssig-Flüssig-Flüssig-Extraktion abgetrennt und teilweise gereinigt, um stromabwärts Analyse zu erleichtern. Sowohl wässrige (polare Metaboliten) und organischen (nicht-polaren Metaboliten) Phasen der ersten Extraktion verarbeitet werden, um eine breite Palette von Metaboliten zu überblicken. Stoffwechselprodukte werden von verschiedenen Flüssigkeits-Chromatographie-Methoden auf ihre Eigenschaften Partition Basis getrennt. Bei diesem Verfahren stellen wir Mikroströmungsfühler ultra-Leistung (UP) LC-Methoden, aber das Protokoll ist skalierbar, um höhere Ströme und niedrigere Drücke. Einführung in das Massenspektrometer kann entweder durch allgemeine oder Verbindung optimierte Quelle Bedingungen. Erkennung von einem breiten Spektrum von Ionen erfolgt im Full-Scan-Modus in positive und negative Modus durchgeführt über einen breiten m / z-Bereich mit hoher Auflösung auf einem kürzlich calibrated Instrument. Markierungsfreie Differentialanalyse wird auf Bioinformatik-Plattformen durchgeführt. Anwendungen dieses Ansatzes umfassen Stoffwechselweg Screening zur Entdeckung von Biomarkern und Entwicklung von Arzneimitteln.

Die vorgestellten Ergebnisse zeigen ausgewählte Daten aus einer 6-stündigen Behandlung von SH-SY5Y Glioblastom-Zellen mit dem Pestizid und mitochondrialer Komplex I-Inhibitor Rotenon. Der Kürze halber werden nur die organische Phase positive Mode-Daten dargestellt. Die Proben wurden aufgearbeitet und analysiert, wie oben beschrieben (Abbildung 1, Tabelle 1, Tabelle 2) geladen und auf zwei Differentialanalyse Plattformen für Label-freie Quantifizierung SIEVE und XCMS online. Obwohl eine große Anzahl...

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Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Untargeted metabolomics stellt eine Hypothese generieren Momentaufnahme eines metabolischen Profils. Dieses Protokoll wird zeigen, die Extraktion und Analyse von Metaboliten von Zellen, Serum oder Gewebe. Eine Reihe von Metaboliten werden mit flüssigem befragten-Flüssigphasenextraktion, Mikroströmungsfühler UltraPerformance Flüssigkeits-Chromatographie / hochauflösende Massenspektrometrie (UPLC-HRMS), gekoppelt mit Differential-Analyse-Software.

Untargeted Metabolomics aus biologischen Quellen Mit UltraPerformance Flüssigkeits-Chromatographie-hochauflösender Massenspektrometrie (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

untargeted-metabolomics-from-biological-sources-using

Research

JoVE Journal

Chemistry

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

22.2K Aufrufe.  University of Pennsylvania. Untargeted metabolomics stellt eine Hypothese generieren Momentaufnahme eines metabolischen Profils. Dieses Protokoll wird zeigen, die Extraktion und Analyse von Metaboliten von Zellen, Serum oder Gewebe. Eine Reihe von Metaboliten werden mit flüssigem befragten-Flüssigphasenextraktion, Mikroströmungsfühler UltraPerformance Flüssigkeits-Chromatographie / hochauflösende Massenspektrometrie (UPLC-HRMS), gekoppelt mit Differential-Analyse-Software.

Serie: Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. The approach offers an unbiased and in-depth analysis that can enable the development of diagnostic tests, novel therapies, and further our understanding of disease processes. The inherent chemical diversity of the metabolome creates significant analytical challenges and there is no single experimental approach that can detect all metabolites. Additionally, the biological variation in individual metabolism and the dependence of metabolism on environmental factors necessitates large sample numbers to achieve the appropriate statistical power required for meaningful biological interpretation. To address these challenges, this tutorial outlines an analytical workflow for large scale non-targeted metabolite profiling of serum by UPLC-MS. The procedure includes guidelines for sample organization and preparation, data acquisition, quality control, and metabolite identification and will enable reliable acquisition of data for large experiments and provide a starting point for laboratories new to non-targeted metabolite profiling by UPLC-MS.

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. This article outlines a typical workflow utilized for non-targeted metabolite profiling of serum including sample organization and preparation, data acquisition, data analysis, quality control, and metabolite identification.

Large Scale Non gezielte Metabolomic Profiling von Serum von Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Forschung

Chemie

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique amino acid sequence, it is only realized by the folding of the polypeptide chain into a single defined three-dimensional arrangement or more commonly into an ensemble of interconverting conformations. Investigating the connection between protein conformation and its function is therefore essential for a complete understanding of how proteins are able to fulfill their great variety of tasks. One possibility to study conformational changes a protein undergoes while progressing through its functional cycle is hydrogen-1H/2H-exchange in combination with high-resolution mass spectrometry (HX-MS). HX-MS is a versatile and robust method that adds a new dimension to structural information obtained by e.g. crystallography. It is used to study protein folding and unfolding, binding of small molecule ligands, protein-protein interactions, conformational changes linked to enzyme catalysis, and allostery. In addition, HX-MS is often used when the amount of protein is very limited or crystallization of the protein is not feasible. Here we provide a general protocol for studying protein dynamics with HX-MS and describe as an example how to reveal the interaction interface of two proteins in a complex. &#160;&#160;

Protein conformation and dynamics are key to understanding the relationship between protein structure and function. Hydrogen exchange coupled with high-resolution mass spectrometry is a versatile method to study the conformational dynamics of proteins as well as characterizing protein-ligand and protein-protein interactions, including contact interfaces and allosteric effects.

Analyse von Proteindynamik mit Wasserstoffwechsel Massenspektrometrie

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, and that these chemical fingerprints can be used for plant species identification. The mass spectral data can be acquired rapidly and in a high throughput manner without the need for sample extraction, derivatization or pH adjustment steps. The use of this technique bypasses challenges presented by more conventional techniques including lengthy chromatography analysis times and resource intensive methods. The high throughput capabilities of the direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry protocol, coupled with multivariate statistical analysis processing of the data, provide not only class characterization of plants, but also yield species and varietal information. Here, the technique is demonstrated with two psychoactive plant products, Mitragyna speciosa (Kratom) and Datura (Jimsonweed), which were subjected to direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry followed by statistical analysis processing of the mass spectral data. The application of these tools in tandem enabled the plant materials to be rapidly identified at the level of variety and species.

A method for species identification of botanical material by direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry and multivariate statistical analysis is presented.

Schnelle Hochdurchsatz-Spezies Identifizierung von Pflanzen von Material mit Direktanalyse in Echtzeit hochauflösender Massenspektrometrie

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

Echtzeit-Atem-Analyse mithilfe von sekundären Nanoelectrospray Ionisation mit hochauflösenden Massenspektrometrie gekoppelt

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic development. To enable single-cell investigations directly in live embryos, new analytical approaches are needed, particularly those that are sensitive, selective, quantitative, robust, and scalable to different cell sizes. Here, we present a protocol that enables the in situ analysis of metabolism in single cells in freely developing embryos of the South African clawed frog (Xenopus laevis), a powerful model in cell and developmental biology. This approach uses a capillary microprobe to aspirate a defined portion from single identified cells in the embryo, leaving neighboring cells intact for subsequent analysis. The collected cell content is analyzed by a microscale capillary electrophoresis electrospray ionization (CE-ESI) interface coupled to a high-resolution tandem mass spectrometer. This approach is scalable to various cell sizes and compatible with the complex three-dimensional structure of the developing embryo. As an example, we demonstrate that microprobe single-cell CE-ESI-MS enables the elucidation of metabolic cell heterogeneity that unfolds as a progenitor cell gives rise to descendants during development of the embryo. Besides cell and developmental biology, the single-cell analysis protocols described here are amenable to other cell sizes, cell types, or animal models.

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

We describe steps that enable fast in situ sampling of a small portion of an individual cell with high precision and minimal invasion using capillary-based micro-sampling, to facilitate chemical characterization of a snapshot of metabolic activity in live embryos using a custom-built single cell capillary electrophoresis and mass spectrometry platform.

Mikrosonde Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry für einzellige Metabolomik in Live-Frosch (Xenopus Laevis) Embryonen

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug crisis in public health. Conventional urine drug testing based on a two-tier immunoassay screen followed by a gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) or liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method are expensive and prone to bias while being limited to targeted panels of known drugs of abuse (DoA). Herein, we outline an improved method for drug surveillance that allows for the resolution and detection of an expanded panel of DoA and their metabolites when using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry (MSI-CE-MS). Multiplexed separations of ten urine samples with a quality control by CE (&lt; 3 min/sample) in conjunction with full-scan data acquisition using a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS) under positive ion mode detection allows for the identification and quantification of DoA above recommended cut-off levels. An excellent resolution of drug isomers and isobars, including background interferences, are achieved when using MSI-CE-MS with an electrokinetic spacer between sample segments, where accurate mass/molecular formula together with the comigration of a matching deuterated internal standard and the detection of one or more bio-transformed metabolites facilitate DoA identification over a wider detection window. Additionally, urine samples can be analyzed directly without enzyme deconjugation for the rapid screening without complicated sample workup. MSI-CE-MS enables the surveillance of a broad spectrum of DoA that is required for the treatment monitoring of high-risk patients, including confirming prescribed drug adherence, revealing illicit drug use/substitution, and evaluating optimal dosage regimes as required for new advances in precision medicine.

Here we describe a high-throughput method for comprehensive drug surveillance that allows for the improved resolution and detection of large panels of drugs of abuse and their metabolites, with quality control based on multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry.

High-Throughput und umfassende Droge-Überwachung mittels Massenspektrometrie Multisegment-Injektion-Kapillar-Elektrophorese

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Imaging Corrosion at the Metal-Paint Interface Using Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS), illustrating that SIMS is a suitable technique to study the chemical distribution at a metal-paint interface. The painted Al alloy coupons are immersed in a salt solution or exposed to air only. SIMS provides chemical mapping and 2D molecular imaging of the interface, allowing direct visualization of the morphology of the corrosion products formed at the metal-paint interface and mapping of the chemical after corrosion occurs. The experimental procedure of this method is presented to provide technical details to facilitate similar research and highlight pitfalls that may be encountered during such experiments.

Time-of-flight secondary ion mass spectrometry is applied to demonstrate the chemical mapping and corrosion morphology at the metal-paint interface of an aluminum alloy after being exposed to a salt solution compared with a specimen exposed to air.

Bildkorrosion an der Metal-Paint-Schnittstelle mit zeitweiliger Ionenmassenspektrometrie

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass ...

3D Depth Profile Reconstruction of Segregated Impurities Using Secondary Ion Mass Spectrometry

The presented protocol combines excellent detection limits (1 ppm to 1 ppb) using secondary ion mass spectrometry (SIMS) with reasonable spatial resolution (~1 &#181;m). Furthermore, it describes how to obtain realistic three-dimensional (3D) distributions of segregated impurities/dopants in solid state materials. Direct 3D depth profile reconstruction is often difficult to achieve due to SIMS-related measurement artifacts. Presented here is a method to identify and solve this challenge. Three major issues are discussed, including the i) nonuniformity of the detector being compensated by flat-field correction; ii) vacuum background contribution (parasitic oxygen counts from residual gases present in the analysis chamber) being estimated and subtracted; and iii)&#160;performance of all steps within a stable timespan of the primary ion source. Wet chemical etching is used to reveal the position and types of dislocation in a material, then the SIMS result is superimposed on images obtained via scanning electron microscopy (SEM). Thus, the position of agglomerated impurities can be related to the position of certain defects. The method is fast and does not require sophisticated sample preparation stage; however, it requires a high-quality, stable ion source, and the entire measurement must be performed quickly to avoid deterioration of the primary beam parameters.

The presented method describes how to identify and solve measurement artifacts related to secondary ion mass spectrometry as well as obtain realistic 3D distributions of impurities/dopants in solid state materials.

3D-Tiefenprofilrekonstruktion von segregierten Verunreinigungen mittels Sekundärionen-Massenspektrometrie

The presented protocol combines excellent detection limits (1 ppm to 1 ppb) using secondary ion mass spectrometry (SIMS) with reasonable spatial ...

Characterizing RNA Modifications in Single Neurons Using Mass Spectrometry

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous system (CNS). Recent evidence has linked specific neuronal RNA modifications to learning and memory paradigms. Unfortunately, conventional methods for the detection of these epitranscriptomic features are only capable of characterizing highly abundant RNA modifications in bulk tissues, precluding the assessment of unique PTM profiles that may exist for individual neurons within the activated behavioral circuits. In this protocol, an approach is described&#8212;single-neuron RNA modification analysis by mass spectrometry (SNRMA-MS)&#8212;to simultaneously detect and quantify numerous modified ribonucleosides in single neurons. The approach is validated using individual neurons of the marine mollusk, Aplysia californica, beginning with surgical isolation and enzymatic treatment of major CNS ganglia to expose neuron cell bodies, followed by manual single-neuron isolation using sharp needles and a micropipette. Next, mechanical and thermal treatment of the sample in a small volume of buffer is done to liberate RNA from an individual cell for subsequent RNA digestion. Modified nucleosides are then identified and quantified using an optimized liquid chromatography-mass spectrometry method. SNRMA-MS is employed to establish RNA modification patterns for single, identified neurons from A. californica that have known morphologies and functions. Examples of qualitative and quantitative SNRMA-MS are presented that highlight the heterogeneous distribution of RNA modifications across individual neurons in neuronal networks.

Post-transcriptional modifications of RNA represent an understudied layer of translation regulation that has recently been linked to central nervous system plasticity. Here, sample preparation and liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach is described for simultaneous characterization of numerous RNA modifications in single neurons.

Charakterisierung von RNA-Modifikationen in einzelnen Neuronen mittels Massenspektrometrie

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous ...

Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of NPAAs can provide crucial information about cellular uptake and/or function, metabolic pathways, and potential toxicity. &#946;-methylamino-L-alanine (BMAA) is a neurotoxic NPAA produced by various algae species and is associated with an increased risk for neurodegenerative diseases, which has led to significant research interest. There are numerous ways to extract AAs for analysis, with liquid chromatography-tandem mass spectrometry being the most common, requiring protein precipitation followed by acid hydrolysis of the protein pellet. Studies on the presence of BMAA in algal species provide contradictory results, with the use of unvalidated sample preparation/extraction and analysis a primary cause. Like most NPAAs, protein precipitation in 10% aqueous TCA and hydrolysis with fuming HCl is the most appropriate form of extraction for BMAA and its isomers aminoethylglycine (AEG) and 2,4-diaminobutyric acid (2,4-DAB). The present protocol describes the steps in a validated NPAA extraction method commonly used in research and teaching laboratories.

The present protocol describes the extraction of non-protein amino acids from biological matrices via trichloroacetic acid (TCA) protein precipitation and acid hydrolysis before analysis using liquid chromatography-tandem mass spectrometry.

Extraktion von Nicht-Protein-Aminosäuren aus Cyanobakterien für die Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Analyse

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of ...