Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health gewähren R01HL086939 (NCC) unterstützt.

In diesem Protokoll zeigen wir eine isolierte, hinterlüftet, perfundierten Mauslunge Vorbereitung, die zuvor verwendet wurde, um die Auswirkungen von Lungenembolien und chronischer Hypoxie auf pulsatile pulmonary vascular Druck-Flow-Beziehungen (Tuchscherer, Webster, &amp; Chesler, 2006 quantifizieren; Tuchscherer et al ., 2007). In Kürze werden die Mauslungen operativ aus den umliegenden Geweben isoliert, in eine beheizte Kammer (IL-1; Harvard Apparatus, Holliston, MA) und belüftet (Ventilatorische Control Module (VCM)-R mit Timer-Zähler-Modul (TCM); Harvard Apparatus). Die Lunge Gefäßsystem ist mit beheiztem RPMI 1640 Zellkulturmedium mit 3,5% Ficoll mit Hilfe einer Spritzenpumpe (Cole-Parmer, Vernon Hills, IL), um den stetigen Fluss Wellenformen oder eine hochfrequente oszillierende Pumpe (Bose-Electro Force, Eden generieren perfundierten Prairie, MN) parallel mit der Spritzenpumpe auf pulsatile pulmonary vascular fließen Wellenformen erzeugen. Druckaufnehmer (P75, Harvard Apparatus) messen die momentane Druck der Lungenarterie (PAP) und linksatrialen Druck (LAP). Momentaner Durchfluss (Q) ist mit einem in-line Durchflussmesser (Transonic Systems, Inc., Ithaca, NY) gemessen. Pulsierende Druck-Flow-Beziehungen sind aus diesen Messungen, die Einblick in pulmonary vascular Physiologie und Pathologie und des rechten Ventrikels Nachlast abgeleitet. 1. Ausstattung: <ol><li> Isolierte Lungen-Set-up inklusive Maus Ventilator </li><li> Datenerfassung und-Computer mit LabView-Programm </li><li> Zwei Drucksensoren und-Durchflussmesser für Perfusat flow </li><li> Drucksensoren und-Durchflussmesser (pnemotachometer) zur Sicherung der Atemwege fließen </li><li> Hochfrequente oszillierende Pumpe und Computer mit Win-Test-Programm </li><li> Boom / Zoom-Mikroskop, Lampe </li><li> Heizbad mit hoher Leistung Pumpe für IL-1-System </li></ol> 2. Vorbereiten des IL-1-System <ol><li> Destilliertem Wasser auf 37 ° C durch das Heizbad wird in das Innere des IL-1-System zirkuliert erwärmt. </li><li> Alle Pumpen, Sensoren und die IL-1 Kanüle werden über saubere Schläuche angeschlossen und alle Schläuche wird mit destilliertem Wasser erhitzt, um 37 ° C gespült Luftblasen, die in die Lunge und verursachen Ödeme reisen konnte, müssen entfernt werden. Tubing von der oszillierenden Strömungspumpe die Durchfluss-Sensor und vom Durchflusssensor der Lungenarterie Kanüle mit 1% PBS gespült. </li><li> Die P75 Druckaufnehmer werden durch Schließen des Ventils an der Kanüle, öffnen die Ventile in die Atmosphäre und dann schieben die automatische Null-Taste auf der PLUGSYS Verstärker auf Null gestellt. Dann wird das Ventil in die Atmosphäre geschlossen und das Ventil an der Kanüle eröffnet. </li><li> Die keramischen porösen Stück in die Lüftung Weg der IL-1-System benetzt ist gegen Feuchtigkeit bieten. </li></ol> 3. Lösungen <ol><li> Bereiten Sie 3,5% Vol. Ficoll-RPMI-Lösung und sterile Filter der Medien. Filterung der Medien gewährleistet gibt es keine großen Partikeln, die unbeabsichtigt embolisieren könnte die Lunge. Mit sterilen Medien reduziert auch die Wahrscheinlichkeit eines plötzlichen Ödem entwickeln in der Lunge. Füllen Sie eine 10 ml Spritze mit RPMI für Chirurgie und eine 60 ml Spritze mit RPMI Für jeden experimentellen Studie. Erhitzen Sie das Perfusat in einem 37 ° C Wasserbad. </li><li> Bereiten Sie 1 ml Heparin 500IU/100g Körpergewicht der Maus (ungefähr). Die Heparin-Salz ist 158IU/mg. Für eine ~ 25 g Maus, mix 1,25 mg Heparin Salz mit 1 ml PBS-Lösung in ein kleines Reaktionsgefäß. </li></ol> 4. Lüften der Maus <ol><li> Nach einer intraperitonealen Injektion von 150 mg Pentobarbital in Lösung pro Kilogramm in die Maus, sicherzustellen, tiefe Narkose, indem Sie einen harten Prise auf eine Pfote. Wenn es keine Reaktion, bereiten Sie die Maus für die Chirurgie durch Pinning seine Vorderpfoten auf die Stabilität corkboard. Hinweis: Während des Experiments Narkosetiefe wird durch genaues Beobachten der Tiere überwacht. Die Stifte in die Pfoten und häufige Schnitte wirken als schädliche Reize, die fehlende Reaktion auf die, dass das Tier in eine chirurgische Ebene der Anästhesie bleibt bestätigt. </li><li> Sprühen Sie die Brust mit 95% igem Alkohol zu benetzen sich das Fell und die Verwendung gerade Pinzette auf die Haut am Hals zu packen. Schneiden Sie ein 1 cm Öffnung in der Haut über den geraden Schere. </li><li> Nachdem das Innere des Halses ausgesetzt ist, entfernen Sie alle weißen Drüsengewebe und oberflächlichen Muskeln, auf der Suche nach der Speiseröhre und Luftröhre. Isolieren Sie die Speiseröhre und Luftröhre aus Gewebe auf beiden Seiten und nach hinten. </li><li> Stecken Sie den kleinen gebogenen Pinzette unter der Luftröhre und greifen ein Stück Naht auf der anderen Seite. Ziehen Sie den Faden unter der Luftröhre und Krawatte ein loses Chirurgen Knoten. Ziehen Sie die Naht oder den Bund fürs Leben. </li><li> Schneiden Sie ein kleines schräg &quot;v&quot; in die Luftröhre mit einer kleinen Schere, schneiden Sie nicht den ganzen Weg durch die Luftröhre. Bewegen Sie den Kork Bord und Maus an den beheizten IL-1-System. Mit den beiden stumpfen Pinzette packen die Trachealkanüle und die Luftröhre unterhalb des &quot;v&quot;. Dann schieben Sie die Trachealkanüle in die Trachealkanüleea durch das &quot;v&quot; Öffnung. Ziehen Sie die Naht um Luftröhre und Trachealkanüle mit der Kanüle in der Luftröhre zu sichern. Den Bund fürs Leben. </li><li> Begin Lüftung (50% Inspiration, 90 Atemzüge / min, mit tiefer Inspiration) mit Raumluft. </li></ol> 5. Perfusion einem belüfteten Maus 5.1. Greifen Sie auf die rechte Herzkammer mit Heparin spritzen <ol><li> Spray Maus Brust mit Alkohol wieder zu re-nassen Fell. Entfernen Sie alle der Haut auf der Brust über die Rippen mit geraden Pinzette und gerade Schere. Cut nach oben entlang des Brustbeins. Heben Sie die Haut auf jeder Seite und dann schneiden Sie die Haut nach der Linie der unteren Rippen. </li><li> Fassen Sie den Schwertfortsatz am unteren Ende des Brustbeins mit einer Pinzette und schneiden ein Loch in die Membran mit der geraden Schere. Besorgen Sie sich die Membran mit der Pinzette und schneiden Sie es weg von den Rippen. </li><li> Fassen Sie den Schwertfortsatz wieder mit der Pinzette (linke Hand) und die Kugel-Spitze, abgewinkelte Schere zu zerschneiden dem Brustbein und durch Rippen, man aufpassen, nicht in die Lungen abgeschnitten, verwenden Sie das Herz oder die Blutgefäße (die Kugel-Spitze auf die Schere zu führen you). Es wird Blut sein, aber solange die Schneide der Schere gegen das Brustbein ist, das Herz und die Lunge wird nicht geschnitten werden. </li><li> Fassen Sie die Rippen auf der linken Seite und schneiden Sie so viel von den Rippen als notwendig, um das Herz freizulegen. Langsam injizieren die rechte Herzkammer mit 0,1 ml Heparin-Lösung. Dieser Schritt ist wichtig zur Vermeidung von Blutgerinnseln in der Lunge, die endothelialen Zellen schädigen und Perfusion beeinträchtigt. Das Heparin muss gespritzt, während das Herz noch schlägt sein. </li></ol> 5.2. Kanülieren die wichtigsten Lungenarterie <ol><li> Schneiden Sie den Rest der Rippen (links und rechts) mit dem Rücken (gerundet) Ende der Zange vorsichtig nach der Lunge entfernt von der Rippe Wand. Grabbing die Lunge selbst beschädigt die empfindliche Gewebe. Zufälliger Kontakt zwischen den Scheren Tipps und das Lungengewebe wird auch Schäden verursachen. </li><li> Bewegen Sie das Mikroskop in Platz über Lunge. Schneiden Sie das Drüsen-und Fettgewebe auf dem Herzen. Verwenden Sie die Pinzette, um sie ziehen weg von den Arterien und Venen und dann mit der Feder Schere geschnitten, während das Gewebe unter Spannung. </li><li> Mit einem anderen stumpfen Satz Pinzette, eine Schaufel von rechts nach von der Spitze des Herzens nach links unter dem linken Vorhof / Ventrikel an der Spitze der Pinzette unter der Aorta und Lungenarterie (PA) zu bekommen. Tun Sie dies sorgfältig sollte es keinen Widerstand gegen die Pinzette werden. Mit stumpfen Pinzette reduziert die Wahrscheinlichkeit einer versehentlichen Punktion der Pulmonalarterie oder Aorta. </li><li> Sobald der Pinzette Spitze steht unter der Aorta und der PA, greifen ein Stück Faden und durchziehen. Tie eine lose Chirurgen Knoten. Ziehen Sie die Naht oder den Bund fürs Leben. </li><li> Optional: Verwendung des abgewinkelten Schere, um die untere Hälfte des Körpers zu entfernen. Reduzieren Sie durch die Rippen und die Wirbelsäule, das Schneiden der Aorta und Vena Cava wird eine erhebliche Menge an Blut zum Fließen zu bringen - mit einem Q-Tip zu stillen den Fluss. In einen Plastikbeutel für die Entsorgung. </li><li> Prime PA Kanüle mit 4 ml aus einer 10 ml Spritze mit RPMI. Überprüfen Sie, dass alle Schläuche frei von Luftblasen ist. Perfusion der Lunge mit destilliertem Wasser oder Blasen in Ödemen führen. </li><li> Schneiden Sie eine kleine Kerbe in der rechten Herzkammer freien Wand und legen Sie die PA Kanüle, mit dem Ziel nach unten und nach rechts. Die Spitze der Kanüle sichtbar sein soll durch die transparente Wand des PA. Infuse eine kleine Menge RPMI, um Ihren Standort zu bestätigen. Ziehen Sie die Naht um die Kanüle, Aorta und PA und den Bund fürs Leben. Beachten Sie, dass an dieser Stelle der Aorta auch ausgeschaltet, so tatsächliche Perfusion nicht beginnen sollte, bis der linke Vorhof ist kanülierten gebunden. </li></ol> 5.3. Kanülieren den linken Vorhof <ol><li> Cut eine Kerbe in den unteren Teil des linken Ventrikels und inert den linken Vorhof (LA) Kanüle, mit dem Ziel nach oben. Leichter Druck erforderlich sein, um die Mitralklappe in diese Richtung zu öffnen. In der richtigen Stelle, wird die Kanülenspitze durchrutschen und sicher sein, ohne Naht. </li></ol> 5.4. Begin Perfusion <ol><li> Manuelles ziehen RPMI aus der 10 ml Spritze mit 0,3 ml pro Minute, bis RMPI ist offensichtlich in den Abfluss-Schlauch (pink-ish Farbe im Gegensatz zu den klaren PBS). Wenn es keine Strömung in den Abfluss-Schlauch, re-positionieren Sie den LA Kanüle. Wenn kein Abfluss mit Re-Positionierung erreicht werden kann, für ein Leck in der Lungenarterie zu überprüfen. Ein Leck oder Riss in der Lungenarterie kann nicht repariert werden, dies ist Ursache für den Abbruch des Experiments. </li><li> Schließen Sie eine 60 ml Spritze mit dem PA Kanüle durch den IL-1-System und starten 1ml/min Infusion von Perfusat, Prüfung auf Dichtheit und sicherstellen, dass die Lunge wiederum weiß, was zeigt, dass RPMI ersetzt Blut in die Lunge. Perfundieren mit langsamen Fluss für zwei Minuten. </li></ol> 6. Mess-Pulsatile and Steady Pulmonary Druck-Fluss-Beziehungen <ol><li> Für die pulsatilen Fluss Studien, zuerst die oszillierende Pumpenkolben Verschiebungen beidie gewünschten Werte für jede Frequenz in der WinTest Programm bei früheren Experimenten. Durch die Variabilität in der Lunge Struktur und Mechanik sind die Verschiebungen für jede Maus eingestellt werden. Set stetigen Fluss auf das gewünschte Niveau. Öffnen Sie das Ventil auf die oszillierende Pumpe und starten Sie die Aufnahme von Daten direkt vor der Ausführung der oszillierenden Strömungsprofil (Wintest Programm). Öffnen Sie die Datei und dann das experimentelle Durchfluss (Q) in Excel. Passen Sie die oszillierende Pumpenkolben Verschiebungen bei jeder Frequenz (Wintest Programm), so dass Q max und Q min als erwünscht. </li><li> Für stetigen Versuche, das Ventil zu schließen, um das Schwingungsverhalten zu pumpen. Wenn dieses Ventil offen gelassen wird, wirkt die oszillierende Pumpe wie ein Kondensator, dämpfend die Änderungen von einem Durchfluss zu einem anderen. Sammeln von Daten für mindestens 10 Sekunden bei jedem Durchfluss, oder bis die PA Druck um nicht mehr als 5% ändern. </li><li> Für beide pulsatile oder stationäre Durchflussmessungen, alte Lüftung bei einem konstanten Druck vor der Datenerhebung. Fortsetzen Belüftung unmittelbar nach der Datenerhebung. </li><li> Achten Sie auf RPMI in den Atemwegen Schlauch, dies ist ein Beweis für Ödeme und ist Ursache für den Abbruch des Experiments. Auch lassen Sie sich nicht RPMI erreichen die Atemwege Druck oder Durchfluss-Sensoren, weil es die Wandler beschädigen. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: Vertreter Stetige Ergebnisse: In der isolierten Lunge Set-up der Experimentator hat die Fähigkeit, unabhängig zu steuern nicht nur die Lungen-Q, sondern auch die Atemwegsdruck P Luft-und linksatrialen Druck LAP. Dies ist vorteilhaft, da Q, P Luft-und LAP den Lungengefäßen und die daraus resultierenden Druck der Lungenarterie PAP beeinflussen. Ein weiterer Vorteil ist, dass erzielten Ergebnisse unabhängig von der sympathischen Nervensystems Ton 1, Volume-Status und Anästhesie 2 sind. PAP Änderungen durch stufenförmige Änderungen in Q für feste P Luft induziert und entweder feste oder variable LAP sind in Abbildung 1 dargestellt. Beachten Sie, dass in den isolierten Lungen-Präparat, das LAP Kanüle wird typischerweise mit dem Schlauch, dass das Perfusat leitet in einen Abfallbehälter verbunden. Mit diesem Schlauch vorhanden, ist LAP linear abhängig von Q durch Poiseuille-Strömung. Allerdings kann die Höhe der Steckdose und Abfallbehälter manuell eingestellt werden, um eine konstante, nicht-Null-LAP liefern oder den Schlauch entfernt auf Null LAP, die unabhängig von Q. ist zu ermöglichen Vertreter Pulsatile Ergebnisse: Während willkürliche pulsatilen Fluss Wellenformen mit diesem System erzeugt werden kann, wir erzeugen typischerweise Fluss der Form Q = 3 + 2 sin (2 f πt) ml / min bei Frequenzen von f = 1, 2, 5, 10, 15 und 20 Hz zu beurteilen, die linearisierte Impedanz der Lungengefäße (Abbildung 2: oberes Feld). Aus dem resultierenden PAP, LAP und Q-Messungen sind pulmonale Gefäßwiderstand Größenordnung (Z) und Phase (θ), indem Sie zuerst zersetzt eine volle sinusförmige Zyklus von AP = PAP-LAP und Q bei jedem auferlegt sinusförmige Durchfluss Frequenz in eine Reihe von berechneten sinusförmigen Oberwellen mit einer Fourier-Transformation. Das Verhältnis der Druck verwandeln zu fließen verwandeln Erträge der pulmonalen vascualar Impedanz, PVZ = FFT (AP) / FFT (Q), die Größe Z und Phase θ hat. Eingangsimpedanz Z 0, Wellenwiderstand Z C, und der Index der Welle Reflexion R W, sind von der Impedanz Größenordnung berechnet. Insbesondere ist Z 0 von Z an der 0. Oberwelle (f = 0 Hz) berechnet, gemittelt über alle Frequenzen, Z C als Mittelwert von Z zwischen dem ersten Minimum (5 Hz) und 20 Hz berechnet wird, und R W berechnet als (Z 0-Z C) / (Z 0 + Z C) 3. <img src="/files/ftp_upload/2690/2690fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1 Stationäre Strömung Wellenformen (obere Reihe) und die daraus resultierenden Belastungen. (Zweite Reihe: PAP, P Luft, LAP) als Funktion der Zeit mit verschiedenen Kombinationen von LAP und P Luft. Die untere Reihe zeigt PAP vs Q. In (A) und (B), LAP steigt und sinkt mit Q, weil der Abfluss-Schlauch vorhanden war. Dieser Schlauch wurde für (C), so dass LAP ist konstant und unabhängig von Q. In (D) und (E) die Höhe der Ablaufschlauch wurde manuell so, dass LAP höher ist, sondern unabhängig von Q. P Luft eingestellt wurde entweder bei entfernt end-inspiratorischen (A, C, D) oder endexspiratorischen (B, E) Druck. <img src="/files/ftp_upload/2690/2690fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2 pulsatilen Fluss Wellenform Q (oben) und die daraus resultierenden Druck (unten: PAP, LAP und P Luft). Als Funktion der Zeit. Aus diesen pulsatile pulmonale Druck-Fluss-Beziehungen kann PVZ berechnet werden, gibt die Gesamtzahl rechtsventrikulären Nachlast.

<ol>
	<li>Pace, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sympathetic+control+of+pulmonary+vascular+impedance+in+anesthetized+dogs.">Sympathetic control of pulmonary vascular impedance in anesthetized dogs.</a> Circ Res. 29, 555-568 (1971).</li><li>Ewalenko, P., Stefanidis, C., Holoye, A., Brimioulle, S., Naeije, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+vascular+impedance+vs.+resistance+in+hypoxic+and+hyperoxic+dogs:+effects+of+propofol+and+isoflurane.">Pulmonary vascular impedance vs. resistance in hypoxic and hyperoxic dogs: effects of propofol and isoflurane.</a> J Appl Physiol. 74, 2188-2193 (1993).</li><li>Nichols, W. W., O'Rourke, M. F., Hartley, C., McDonald, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> McDonald's blood flow in arteries : theoretical, experimental, and clinical principles. , (2005).</li><li>Tuchscherer, H. A., Webster, E. B., Chesler, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+Vascular+Resistance+and+Impedance+in+Isolated+Mouse+Lungs:+Effects+of+Pulmonary+Emboli.">Pulmonary Vascular Resistance and Impedance in Isolated Mouse Lungs: Effects of Pulmonary Emboli.</a> Annals of Biomedical Engineering. 34, 660-668 (2006).</li><li>Tuchscherer, H. A., Vanderpool, R. R., Chesler, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+vascular+remodeling+in+isolated+mouse+lungs:+Effects+on+pulsatile+pressure-flow+relationships.">Pulmonary vascular remodeling in isolated mouse lungs: Effects on pulsatile pressure-flow relationships.</a> Journal of Biomechanics. 40, 993-1001 (2007).</li><li>Vanderpool, R., Naeije, R., Chesler, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedance+in+Isolated+Mouse+Lungs+for+the+Determination+of+Site+of+Action+of+Vasoactive+Agents+and+Disease.">Impedance in Isolated Mouse Lungs for the Determination of Site of Action of Vasoactive Agents and Disease.</a> Ann Biomed Eng. , (2010).</li><li>Vanderpool, R., Kim, A., Molthen, R., Chesler, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+rho+kinase+inhibition+on+chronic+hypoxia-induced+changes+in+proximal+and+distal+pulmonary+arterial+structure+and+function.">Effects of acute rho kinase inhibition on chronic hypoxia-induced changes in proximal and distal pulmonary arterial structure and function.</a> Journal of Applied Physiology. , (2010).</li><li>El-Bizri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smooth+muscle+protein+22alpha-mediated+patchy+deletion+of+Bmpr1a+impairs+cardiac+contractility+but+protects+against+pulmonary+vascular+remodeling.">Smooth muscle protein 22alpha-mediated patchy deletion of Bmpr1a impairs cardiac contractility but protects against pulmonary vascular remodeling.</a> Circ Res. 102, 380-388 (2008).</li><li>Champion, H., Michelakis, E., Hassoun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+invasive+and+noninvasive+approach+to+the+right+ventricle-pulmonary+circulation+unit:+state+of+the+art+and+clinical+and+research+implications.">Comprehensive invasive and noninvasive approach to the right ventricle-pulmonary circulation unit: state of the art and clinical and research implications.</a> Circulation. 120, 992-1007 (2009).</li><li>Gan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasively+assessed+pulmonary+artery+stiffness+predicts+mortality+in+pulmonary+arterial+hypertension.">Noninvasively assessed pulmonary artery stiffness predicts mortality in pulmonary arterial hypertension.</a> Chest. 132, 1906-1912 (2007).</li><li>Mahapatra, S., Nishimura, R., Sorajja, P., Cha, S., McGoon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+pulmonary+arterial+capacitance+and+mortality+in+idiopathic+pulmonary+arterial+hypertension.">Relationship of pulmonary arterial capacitance and mortality in idiopathic pulmonary arterial hypertension.</a> J Am Coll Cardiol. 47, 799-803 (2006).</li><li>Bogaard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+pulmonary+artery+pressure+elevation+is+insufficient+to+explain+right+heart+failure.">Chronic pulmonary artery pressure elevation is insufficient to explain right heart failure.</a> Circulation. 120, 1951-1960 (2009).</li></ol>

Kritische Schritte in der Chirurgie Es ist wichtig, dass darauf geachtet wird beim Schneiden der Brustkorb von der Lunge. Die Lunge muss vollständig freigelegt werden und ungehemmt beim Aufblasen durch das umgebende Gewebe, aber nicht während des Prozesses der Isolierung beschädigt. Die Verwendung eines flachen Gegenstand wie das hintere Ende der Zange können verwendet werden, um die Lunge weg zu halten von der Brustwand, so dass es einen klaren Weg für die Schere geschnitten werden. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Platzierung der Naht um die Lungenarterie und Aorta. Mit einer stumpfen Pinzette gerade verringert sich das Risiko der Punktion der Lungenarterie. Der letzte entscheidende Schritt bei der Operation ist die Platzierung der Kanülen. Wenn die Kanülen zu hoch über der Ebene der großen Gefäße, wie sie das Herz verlassen, können die Kanülen, entweder in der Lungenarterie oder Lungenvenen ziehen. Wenn die Kanüle in den linken Vorhof zu niedrig ist, kann es fließen in der linken Lunge blockieren. Als Folge davon geht mehr Durchfluss, um die rechte Lunge, wodurch PAP und die Beschleunigung der Entwicklung von Ödemen in der rechten Lunge. Kritische Schritte bei der Datenerhebung Stationäre Strömung Datenerhebung sollte schnell durchgeführt werden, insbesondere für hohe Flussraten, so dass die Exposition der Lunge Gefäßsystem zu hohe Flüssigkeitsaufnahme Schubspannungen minimiert wird. In unserer Erfahrung, betont hohe Scherung führen zu Lungen-Ödem. Darüber hinaus kann eine rasche Zunahme der Schubspannung zu Lungenödem führen. Für stationäre Strömungsverhältnisse, eine Erhöhung der Fluss von 6 ml / min / min nicht zu Ödemen. Stationäre Strömung-Raten über 5 ml / min ohne Ödeme in bestimmten Bedingungen erhalten werden. Wir haben Lungen-Steuerung und chronisch hypoxischen Mäuse mit stetigen Raten so hoch wie 10 ml / min erfolgreich perfundiert. Frequency Einschränkungen Die höchste Frequenz von uns getestet wird in der Regel 20 Hz, weil wir eine Strömung nutzen Wellenform Q = 3 + 2 sin (2 f πt) ml / min. Die Pumpe beschreiben wir hier Oszillationen bei höheren Frequenzen (mindestens 50 Hz) zu erzeugen, aber der trade-off ist Hublänge, dh Änderungen in Q. Eine weitere physiologische flow Wellenform, in denen das Ausmaß der Strömung Schwingung nimmt mit zunehmender Frequenz verringert könnte wahrscheinlich simuliert werden mit diesem System. Alternativ könnte ein benutzerdefiniertes Perfusionspumpe mit der gleichen chirurgischen Isolierung und Lüftung hier beschriebenen Verfahren verwendet werden. Der Frequenzbereich der Druckaufnehmer (P75, Harvard Apparatus, Holliston, MA) ist als 0-100 Hz angegeben. Der tatsächliche Frequenzgang der Wandler ist abhängig von der Steifigkeit und der Größe der Schläuche verwendet werden, um die Sensoren an die PA und LA Kanülen verbinden. Mit Metall-Röhre anstelle von Polyethylen-Rohr würde die Reaktion des Systems. Allerdings ist es nicht möglich, vollständig zu nutzen starre Rohre, weil Flexibilität in Kanüle Lage und Platzierung während der Operation benötigt werden. Dennoch wäre höheren Frequenzgang Wandler und / oder steifer Schlauch das Signal-Rausch-in den Druck-Messungen zu erhöhen und damit PVZ bei höheren Frequenzen erreicht werden. Anwendungen Diese isolierten Lunge Präparat wurde verwendet, um die Wirkung der Lungenembolie 4 sowie chronischer Hypoxie 5 untersuchen auf pulsatile pulmonale Druck-Fluss-Beziehungen. Es wurde auch verwendet, um die Auswirkungen von vasoaktiven Substanzen in den Lungenkreislauf 6 zu untersuchen und die proximalen und distalen pulmonary vascular Wirkungen einer akuten Rho-Kinase-Hemmung 7 quantifizieren. Diese Technik kann zur Behandlung der pulmonalen vaskulären Physiologie in Inzucht oder outbred Stämme von Mäusen oder gentechnisch veränderten Mäusen 8 quantifizieren. Die Interpretation der Druck-Flow-Daten mit dieser isolierten Lunge erhaltene Präparat ist nicht durch Unterschiede in der Herzfrequenz oder Herzleistung zwischen Mäusestämmen kompliziert. Es ist wichtig zu beachten, dass die Impedanz-Spektren in einer isolierten erhalten, belüfteten perfundierten Lunge als Reaktion auf eine nicht-physiologische Wellenform sollte nicht direkt mit jenen in einer in vivo-Präparat erhalten in Reaktion auf einen normalen Herzschlag verglichen werden. Auch in vivo, ist die Belüftung durch negative, nicht positiv, Druck und der Viskosität des Blutes ist etwa 4-fach die Viskosität des RPMI mit Ficoll. Bedeutung Mit dem isolierten, hinterlüftet, perfundierten Mauslunge Vorbereitung haben wir in der Lage, die glatten Muskelzellen de-Aktivierung durch akute Rho-Kinase-Hemmung zeigen, hat keine direkte Auswirkung auf die Compliance der großen, Conduit Arterien, die wesentlichen Einfluss RV Nachlast 7. Die klinische Bedeutung der proximalen Arterie Compliance wurde zunehmend 9-11 anerkannt. Darüber hinaus verringert wichtigsten Lungenarterie Compliance hat sich gezeigt, dass eine ausgezeichnete Prädiktor für die Mortalität bei pulmonaler arterieller Hypertonie 10,11 sein. Die Hauptursache für death von pulmonaler Hypertonie ist Versagen der rechten Herzkammer, jedoch erhöhte mittleren pulmonalarteriellen Druck allein nicht ausreicht, um Fehler 12 zu bewirken. Eine effektivere Maßnahme zur vollständigen rechtsventrikulären Nachlast ist PVZ, die auf beiden proximalen Compliance und distalen Widerstand abhängt und von pulsatile pulmonale Druck-Fluss-Beziehungen, wie sie in Mauslungen mit diesem Protokoll erreicht werden berechnet.

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1 ml syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Sci</td>
<td>14-829-10F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 ml syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Sci</td>
<td>14-823-2A </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 ml syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Sci</td>
<td>13-689-8 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI with GLN 6/PK</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Sci</td>
<td>MT10040CV </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bottle Top Filters</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Sci</td>
<td>09-761-57</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ficoll PM 70</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F2878-100g</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heparin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Y27632</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>Y0503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Angled Ball Iris scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14109-09</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vannas Spring Scissors - 4mm Blades</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15018-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine Iris Scissors - straight</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14106-09</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont #5/45 Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11251-35</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont Medical Biology Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11254-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lauda E100 ECO-line 003 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>Comparable to Lauda-Brinkmann E-103, 62400-922</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IL-1 Isolated perfused mouse lung system </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus </td>
<td>739904 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS Module</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>730020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TS410 Flow Modules</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Transonic </td>
<td>TS410</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ME 4 PXN Precision PXN Inline Flowsensors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Transonic</td>
<td>ME 4 PXN</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cole-Parmer Multi-Syringe Pumps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cole-Parmer </td>
<td>EW-74900-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nembutal 50MG/ML 20ML Vial</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amatheon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

characterization of the isolated, ventilated, and instrumented mouse lung perfused with pulsatile flow

Die isolierte, belüftet und instrumentiert Mauslunge Vorbereitung ermöglicht gleichmäßige und pulsatile pulmonary vascular Druck-Flow-Beziehungen mit unabhängigen Kontrolle über pulmonale arterielle Strömungsgeschwindigkeit, Durchfluss Wellenform, Atemwegsdruck und linksatrialen Druck gemessen werden. Pulmonalen Gefäßwiderstand basiert auf Multi-Point, stetigem Druck-Flow-Kurven berechnet; pulmonary vascular Impedanz setzt sich aus pulsatile Druck-Flow-Kurven an eine Reihe von Frequenzen, berechnet. Als nun erkannt klinisch wird die Impedanz einer überlegenen Maß rechtsventrikulären Nachlast als Widerstand, weil sie die Wirkungen des vaskulären Compliance, die nicht vernachlässigt werden, vor allem in den Lungenkreislauf umfasst. Drei wichtige Metriken der Impedanz - die Null-Hertz-Impedanz Z 0, die charakteristische Impedanz Z C, und der Index der Welle Reflexion R W - geben Einblick in distalen arteriellen Querschnittsfläche für Durchfluss, proximalen arteriellen Steifigkeit und der Upstream-Downstream-Impedanz mismatch jeweils. Alle Ergebnisse in isolierten erhalten, belüftet und perfundierten Lungen sind unabhängig von sympathischen Nervensystems Klangfarbe, Lautstärke-Status und die Auswirkungen der Narkose. Wir haben diese Technik verwendet, um die Auswirkungen von Lungenembolien und chronischer Hypoxie auf Widerstand und Impedanz zu quantifizieren und zwischen den Standorten der Maßnahme (dh proximal vs distal) von vasoaktiven Substanzen und Krankheiten über die Druckabhängigkeit der Z C unterscheiden. Außerdem, wenn diese Techniken mit den Lungen von gentechnisch veränderten Stämme von Mäusen verwendet werden, können die Auswirkungen der auf molekularer Ebene Defekte auf pulmonary vascular Struktur und Funktion bestimmt werden.

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Characterization of the Isolated, Ventilated, and Instrumented Mouse Lung Perfused with Pulsatile Flow

Das folgende Protokoll beschreibt den Prozess der Isolierung, Lüftungs-und Instrumentierung Mauslungen zu stabilisieren oder pulsatile pulmonary vascular Druck-Flow-Beziehungen zu messen, um die Auswirkungen des Blutflusses, Luftstrom-, Atemwegs-Änderungen und Gefäßveränderungen am rechten Ventrikels Nachlast zu quantifizieren.

Charakterisierung der isolierten, ventilierten und Instrumented Maus Lung mit pulsatilen Fluss perfundierten

The isolated, ventilated and instrumented mouse lung preparation allows steady and pulsatile pulmonary vascular pressure-flow relationships to be measured ...

characterization-isolated-ventilated-instrumented-mouse-lung-perfused

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

16.2K Aufrufe.  University of Wisconsin – Madison. Das folgende Protokoll beschreibt den Prozess der Isolierung, Lüftungs-und Instrumentierung Mauslungen zu stabilisieren oder pulsatile pulmonary vascular Druck-Flow-Beziehungen zu messen, um die Auswirkungen des Blutflusses, Luftstrom-, Atemwegs-Änderungen und Gefäßveränderungen am rechten Ventrikels Nachlast zu quantifizieren.

Serie: Characterization of the Isolated, Ventilated, and Instrumented Mouse Lung Perfused with Pulsatile Flow

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Durchflusszytometrie Reinigung der Maus meiotischen Zellen

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Forschung

Biologie

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3. On the macro scale the stiffness of tissues and organs within the human body span several orders of magnitude4. Much less is known about how stiffness varies spatially within tissues, and what the scope and spatial scale of stiffness changes are in disease processes that result in tissue remodeling. To better understand how changes in matrix stiffness contribute to cellular physiology in health and disease, measurements of tissue stiffness obtained at a spatial scale relevant to resident cells are needed. This is particularly true for the lung, a highly compliant and elastic tissue in which matrix remodeling is a prominent feature in diseases such as asthma, emphysema, hypertension and fibrosis. To characterize the local mechanical environment of lung parenchyma at a spatial scale relevant to resident cells, we have developed methods to directly measure the local elastic properties of fresh murine lung tissue using atomic force microscopy (AFM) microindentation. With appropriate choice of AFM indentor, cantilever, and indentation depth, these methods allow measurements of local tissue shear modulus in parallel with phase contrast and fluorescence imaging of the region of interest. Systematic sampling of tissue strips provides maps of tissue mechanical properties that reveal local spatial variations in shear modulus. Correlations between mechanical properties and underlying anatomical and pathological features illustrate how stiffness varies with matrix deposition in fibrosis. These methods can be extended to other soft tissues and disease processes to reveal how local tissue mechanical properties vary across space and disease progression.

The stiffness of the extracellular matrix strongly influences multiple behaviors of adherent cells. Matrix stiffness varies spatially throughout a tissue, and undergoes modification in various disease conditions. Here we develop methods to characterize spatial variations in stiffness in normal and fibrotic mouse lung tissue using atomic force microscopy microindentation.

Micro-Mechanische Charakterisierung von Lungengewebe mit Atomic Force Microscopy

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor formation. Taken together these studies suggest that resident lung MSC play a role during pulmonary tissue homeostasis, injury and repair during diseases such as pulmonary fibrosis (PF) and arterial hypertension (PAH). Here we describe a technology to define a population of resident lung MSC. The definition of this population in vivo pulmonary tissue using a define set of markers facilitates the repeated isolation of a well-characterized stem cell population by flow cytometry and the study of a specific cell type and function.

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

In this article we demonstrate the isolation of murine resident lung mesenchymal stem cells (lung MSC), their expansion, characterization and analysis of immunomodulatory properties.

Isolation und Charakterisierung von Hoechst Low CD45 Negative Mouse Lung mesenchymalen Stammzellen

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Protein Transfection of Mouse Lung

Increasing protein expression enables researchers to better understand the functional role of that protein in regulating key biological processes1. In the lung, this has been achieved typically through genetic approaches that utilize transgenic mice2,3 or viral or non-viral vectors that elevate protein levels via increased gene expression4. Transgenic mice are costly and time-consuming to generate and the random insertion of a transgene or chronic gene expression can alter normal lung development and thus limit the utility of the model5. While conditional transgenics avert problems associated with chronic gene expression6, the reverse tetracycline-controlled transactivator (rtTA) mice, which are used to generate conditional expression, develop spontaneous air space enlargement7. As with transgenics, the use of viral and non-viral vectors is expensive8 and can provoke dose-dependent inflammatory responses that confound results9 and hinder expression10. Moreover, the efficacy of repeated doses are limited by enhanced immune responses to the vector11,12. Researchers are developing adeno-associated viral (AAV) vectors that provoke less inflammation and have longer expression within the lung13.
Using &beta;-galactosidase, we present a method for rapidly and effectively increasing protein expression within the lung using a direct protein transfection technique. This protocol mixes a fixed amount of purified protein with 20 &mu;l of a lipid-based transfection reagent (Pro-Ject, Pierce Bio) to allow penetration into the lung tissue itself. The liposomal protein mixture is then injected into the lungs of the mice via the trachea using a microsprayer (Penn Century, Philadelphia, PA). The microsprayer generates a fine plume of liquid aerosol throughout the lungs. Using the technique we have demonstrated uniform deposition of the injected protein throughout the airways and the alveoli of mice14. The lipid transfection technique allows the use of a small amount of protein to achieve effect. This limits the inflammatory response that otherwise would be provoked by high protein administration. Indeed, using this technique we published that we were able to significantly increase PP2A activity in the lung without affecting lung lavage cellularity15. Lung lavage cellularity taken 24 hr after challenge was comparable to controls (27&plusmn;4 control vs. 31&plusmn;5 albumin transfected; N=6 per group). Moreover, it increases protein levels without inducing lung developmental changes or architectural changes that can occur in transgenic models. However, the need for repeated administrations may make this technique less favorable for studies examining the effects of long-term increases in protein expression. This would be particularly true for proteins with short half-lives.

Transgenic mice or viral vectors have been used to increase protein expression within the lung. However, these techniques are time-consuming, technically challenging and have off-target effects that can confound results. Our protein transfection protocol uses a lipid based transfection reagent and an ultrafine microsprayer to uniformly deliver active protein to lung cells.

Protein Transfektion von Maus Lung

Increasing protein expression enables researchers to  better understand the functional role of that protein in regulating key  biological processes1. In ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Bewertung von Calcium in Sparks Intact Skelettmuskelfasern

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

Quantifizierung der Mikrogefäßdurchlässigkeit im Einzel isolierten Blutdurchbluteten Lungen Rat Vorbereitung

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One of the primary risk factors of EAC is Barrett&#8217;s esophagus (BE), a metaplastic change of the normal squamous esophagus in response to chronic heartburn. Despite the well-established connection between EAC and BE, interrogation of the molecular events, particularly altered signaling pathways involving progression of BE to EAC, are poorly understood. Much of this is due to the lack of suitable in vitro models available to study these diseases. Recently, immortalized BE cell lines have become commercially available allowing for in vitro studies of BE. Here, we present a method for immunofluorescent staining of immortalized BE cell lines, allowing in vitro characterization of cell signaling and structure after exposure to therapeutic compounds. Application of these techniques will help develop insight into the mechanisms involved in BE to EAC progression and provide potential avenues for treatment and prevention of EAC.

There is a discernible need for improved information on molecular drivers of Barrett&#8217;s Esophagus. Immunofluorescent staining is a useful technique for understanding the effects of cell signaling on cell morphology. We present a simple, effective protocol for the use of immunofluorescent staining to assess therapeutic treatment in Barrett&#8217;s Esophagus cells.

Eine Immunfluoreszenz-Verfahren zur Charakterisierung von Barrett-Ösophagus Cells

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods are needed that can quantify the pathologic changes. Furthermore, to provide translational relevance to the mouse models, such measurements should be tests that can easily be done in both humans and mice. Unfortunately, in the present literature few phenotypic measurements of lung function have direct application to humans. One exception is the diffusing capacity for carbon monoxide, which is a measurement that is routinely done in humans. In the present report, we describe a means to quickly and simply measure this diffusing capacity in mice. The procedure involves brief lung inflation with tracer gases in an anesthetized mouse, followed by a 1 min gas analysis time. We have tested the ability of this method to detect several lung pathologies, including emphysema, fibrosis, acute lung injury, and influenza and fungal lung infections, as well as monitoring lung maturation in young pups. Results show significant decreases in all the lung pathologies, as well as an increase in the diffusing capacity with lung maturation. This measurement of lung diffusing capacity thus provides a pulmonary function test that has broad application with its ability to detect phenotypic structural changes with most of the existing pathologic lung models.

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

We describe a means to quickly and simply measure the lung diffusing capacity in mice and show that it is sufficiently sensitive to phenotype changes in multiple common lung pathologies. This metric thus brings direct translational relevance to the mouse models, since diffusing capacity is also easily measured in humans.

Phänotypisierung Maus Lungenfunktion<em&gt; In-vivo-</em&gt; Mit der Lungendiffusionskapazität

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

Die Maus isoliert perfundierten Nieren-Technik

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Charakterisierung der isolierten, ventilierten und Instrumented Maus Lung mit pulsatilen Fluss perfundierten

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