Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde vom National Center for Advancing Translational Sciences unter der AuszeichnungUL1TR003096 (MDE), National Heart, Lung, and Blood Institute Predoctoral Fellowship in Lung Diseases Training Program 5T32HL134640 (MLD) unterstützt.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Alabama in Birmingham genehmigt.
1. Experimentelles Protokoll
<ol><li>Opfern Sie die Maus mit einer zugelassenen IACUC-Methode. Hier verwendeten wir zervikale Dislokation einer Maus mit 5% Isofluran anästhetisiert. Verwenden Sie eine geeignete Maus für die Studie; hier verwenden wir eine 8 Wochen alte FVB-Maus</li>
	<li>Mit chirurgischer Schere, machen Sie einen 3,5-5 mm horizontalen Schnitt in der Mitte des Unterbauchs. Als nächstes legen Sie chirurgische Schere in das kleine Loch aus Schnitt erstellt und schneiden vertikal die mittlere Mittellinie bis knapp unter dem Hals der Maus.</li>
	<li>Ziehen Sie die Haut mit den Fingern zurück und inspizieren Sie die axillären Lymphknoten.</li>
	<li>Mit chirurgischer Schere, machen Sie einen 3,5 mm seitlichen Schnitt, um die Bauchhöhle zu öffnen, und schneiden Sie dann in vorderer Richtung bis zum Boden des Thorax. Inspizieren Sie die Organe in der Bauchhöhle: Leber, Milz, Nieren, etc.</li>
	<li>Mit der Flachen der chirurgischen Schere, oder mit Zangen, bewegen Sie die Leber, um das Zwerchfell freizulegen. Prüfen Sie das Zwerchfell auf Tumorwachstum oder Metastasen. Schnipsen Sie dann vorsichtig die Membran auf der rechten Seite des Bedieners, so dass es sich ausdehnen kann. Schneiden Sie das Zwerchfell vorsichtig von rechts nach links, um die Brusthöhle und die Lunge freizulegen. Achten Sie darauf, die Lunge nicht zu schneiden.</li>
	<li>Schneiden Sie durch das seitliche Extrem des linken Rippenkäfigs (rechts) des Bedieners, um den linken Lappen der Lunge zu inspizieren.</li>
	<li>Bewegen Sie die rechten Lungenlappen vorsichtig aus dem Weg und schneiden Sie das seitliche Extrem des rechten Rippenkäfigs auf und entfernen Sie den Rippenkäfig. HINWEIS: Die Entfernung des Rippenkäfigs ist optional, obwohl die Entfernung eine klarere Sicht auf die spätere Lungeninflation ermöglicht.<ol>
<li>Wenn frisches oder gefrorenes Lungengewebe erforderlich ist, verwenden Sie Hämostatzangen, um den Bronchus des linken Lappens zu klemmen und die linke Lunge mit einer chirurgischen Schere vor der Perfusion zu resektieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mit der Zange, um das Gewebe zu heben, das die Luftröhre bedeckt, schneiden Sie überschüssiges Gewebe weg. Dann schneiden Sie vorsichtig das dünne Gewebe Auskleidung der Luftröhre, um die Atemwege auszusetzen.</li>
	<li>Schneiden Sie die Nierenarterie mit chirurgischer Schere durch.</li>
	<li>Um die Lunge zu durchdringen, verwenden Sie eine 3 ml Spritze mit einer 22 G Nadel, um 1x PBS mit 10 U/ml Heparin in die rechte Herzkammer zu injizieren. Durchdringen Sie die Lunge mit PBS/Heparin langsam bei ca. 300 l/s. Die Lunge wird häufig weiß. In diesem Schritt werden in der Regel 2,5 ml PBS verwendet.</li>
	<li>Für die Lungeninflation verwenden Sie eine 3 ml Spritze mit einer 22 G Nadel, diesmal parallel zur Luftröhre gehalten. Setzen Sie die Nadel in die Luftröhre ein und injizieren Sie 10% Formalin mit einer Durchflussrate von nicht mehr als 200 l/s, bis die Lunge vollständig aufgeblasen ist. Sobald die Lunge aufgeblasen ist, wird Formalin aus der Luftröhre zurückfließen. Halten Sie die Nadel noch ein paar Sekunden an Ort und Stelle und ziehen Sie sich dann zurück.<ol>
<li>(Optional) Vor dem Zurückziehen der Nadel- und Lungeninflation verwenden Sie Nahtgewinde, um die Luftröhre abzubinden. Um dies zu erreichen, verwenden Sie 4 Zoll Nahtgewinde halten den Punkt des Gewindes mit einem kleinen Paar Zangen. Legen Sie den Faden auf die Dorsalseite der Luftröhre und ziehen Sie durch, um eine Schleife um die Nadel zu machen. Als nächstes machen Sie einen Überhandknoten um die Nadel. Knoten fest ziehen, Nadel aus Luftröhre entfernen, Knoten schließen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie Zangen, um das Herz zu heben, setzen Sie chirurgische Schere direkt hinter der Lunge, und schneiden Sie Bindegewebe, während das Herz angehoben, um die Lunge zu resektieren.</li>
	<li>Schneiden Sie das Herz, um es aus der Lunge zu entfernen.</li>
	<li>Legen Sie die Lunge eine Kassette mit der Maus-ID oder Studien-ID beschriftet. Legen Sie die Kassette in 10% gepuffertes Formalin und fixieren Sie für 24-48 h. Lungen können auf Wunsch über ein Jahr fixativ belassen werden.</li>
	<li>Übertragen Sie die Kassette mit der Lunge auf 70% Ethanol und gehen Sie mit der Verarbeitung für die Histologie.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R., Structure, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+official+research+policy+statement+of+the+American+Thoracic+Society/European+Respiratory+Society:+standards+for+quantitative+assessment+of+lung+structure.">An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).</li><li>Vasilescu, D. M., Knudsen, L., Ochs, M., Weibel, E. R., Hoffman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+murine+lung+preparation+for+detailed+structural+evaluation+via+micro-computed+tomography.">Optimized murine lung preparation for detailed structural evaluation via micro-computed tomography.</a> Journal of Applied Physiology. 112 (1), 159-166 (2012).</li><li>Blumler, P., Acosta, R. H., Thomas-Semm, A., Reuss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+fixation+for+the+preservation+of+air+spaces.">Lung fixation for the preservation of air spaces.</a> Experimental Lung Research. 30 (1), 73-82 (2004).</li><li>Oldmixon, E. H., Suzuki, S., Butler, J. P., Hoppin, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+dehydration+fixes+elastin+and+preserves+lung+air-space+dimensions.">Perfusion dehydration fixes elastin and preserves lung air-space dimensions.</a> Journal of Applied Physiology. 58 (1), 105-113 (1985).</li><li>Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+fixation+methods+on+lung+morphology+in+a+murine+model+of+emphysema.">A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).</li><li>Renne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendation+of+optimal+method+for+formalin+fixation+of+rodent+lungs+in+routine+toxicology+studies.">Recommendation of optimal method for formalin fixation of rodent lungs in routine toxicology studies.</a> Toxicologic Pathology. 29 (5), 587-589 (2001).</li><li>Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instillation+and+Fixation+Methods+Useful+in+Mouse+Lung+Cancer+Research.">Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e52964 (2015).</li><li>Lum, H., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+10%+formalin+fixation+on+fixed+lung+volume+and+lung+tissue+shrinkage.+A+comparison+of+eleven+laboratory+species.">Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage. A comparison of eleven laboratory species.</a> American Review of Respiratory Disease. 132 (5), 1078-1083 (1985).</li><li>Edmonds, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-31+initiates+lung+tumorigenesis+and+promotes+mutant+KRAS-driven+lung+cancer.">MicroRNA-31 initiates lung tumorigenesis and promotes mutant KRAS-driven lung cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (1), 349-364 (2016).</li><li>Zhao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wogonin+suppresses+melanoma+cell+B16-F10+invasion+and+migration+by+inhibiting+Ras-medicated+pathways.">Wogonin suppresses melanoma cell B16-F10 invasion and migration by inhibiting Ras-medicated pathways.</a> PLoS One. 9 (9), 106458 (2014).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Das oben beschriebene Verfahren zur Perfusion, Inflation und Fixierung der Mauslungen ist ideal für die schnelle und effiziente Vorbereitung der Mauslungen für die Lungentumorhistologie und Pathologieanalyse. Das Verfahren erfordert keine spezielle Ausrüstung und kann in weniger als 6 Minuten pro Maus durchgeführt werden. Das Verfahren erfordert weder ein festes Volumen für die Inflation noch einen konstanten Flüssigkeitsdruck. Da dieses Verfahren nicht standardisiert ist, wird es nicht für diejenigen empfohlen, d...

Eine Vielzahl von Mausmodellen der Lungenonkogenese und Krebsmetastasen in die Lunge gibt es von komplexen GEMMs über krebserregende Modelle bis hin zu syngenischen und Xenograft-Modellen, bei denen Krebszellen über intrakardiale, intrathorakale, die Schwanzvene oder andere Methoden zur Etablierung von Tumoren in der Lunge injiziert werden. Alle diese Modelle teilen die gemeinsame Notwendigkeit der histologischen Bewertung der Lungenhistologie und Pathologie. Daher ist es notwendig, eine robuste, aber schnelle Methode zu haben, um Nekropsien von Mäusen durchzuführen, während die Lunge durchsetzt wird, um überschüssiges Blut zu entfernen, und die Lunge aufzublasen und zu fixieren, um die Lungenarchitektur klar zu visualisieren. Geschwindigkeit ist ein kritischer Bestandteil dieses Verfahrens, da es notwendig sein kann, die Lunge von Dutzenden von Mäusen zu einem einzigen Zeitpunkt zu sammeln. Dieses Verfahren kann in weniger als 6 Minuten pro Maus durchgeführt werden.
Während dieses Verfahren mehr als ausreichend für die Bewertung der Tumorhistologie ist, wird es nicht für diejenigen empfohlen, die stereologische oder morphometrische Messungen der Lunge durchführen möchten. Solche Messungen erfordern eine Standardinflation der Lunge, ebenso wie die Berechnung der absoluten Oberfläche der Lunge, des absoluten Volumens und der Alveolargröße und der Zahl1. Diese Methode ist auch nicht optimal für einige bildgebende Ansätze. Zum Beispiel erfordert die Bildgebung der Lunge über die "CT" für die ex vivo morphometrische Analyse, dass die Lunge mit Luft gefüllt bleibt2. Wenn die Erhaltung von Lufträumen und Abmessungen das Hauptanliegen ist, wird empfohlen, die Lunge durch Perfusionsdehydrierungstechniken3,4zu fixieren. Eines der größten Anliegen dieses Modells ist das Potenzial für das Brechen der Alveolarwände, die seine Verwendung in Studien von Emphysem enden; Das empfohlene Verfahren zur Fixierung der Lunge zur Untersuchung von Emphysem ist jedoch noch recht ähnlich, da es empfohlen wird, die Lunge entweder durch intratracheale Instillation von 10% Formalin (ähnlich dem hier beschriebenen Protokoll) unter konstantem Flüssigkeitsdruck oder durch In-situ-Fixierung5zu fixieren.
Der Vorteil des beschriebenen Verfahrens besteht hier darin, dass es keinen konstanten Flüssigkeitsdruck erfordert, sondern die Lunge aufbläht, bis sie sich vollständig erweitert hat, wodurch die für das Verfahren benötigte Zeit verringert wird. Das hier beschriebene Verfahren ähnelt den Methoden, die von einem Rüstungsarium der Gesellschaft für Toxikologische Pathologie empfohlen werden, wo ein Unterausschuss gebildet wurde, um die besten Methoden der Lungenfixierung für toxikologische Studien zu empfehlen. Die Mehrheit der Wissenschaftler in diesem Unterausschuss empfahl, die Lunge durch intratracheale Instillation mit einer Spritze zu fixieren, obwohl es unterschiedliche Empfehlungen für die Zeit gab, zu der die Lunge imfixativen 6belassen wurde. Während es also eine Vielzahl von Methoden der Lungeninflation und -fixierung gibt, wird die hier beschriebene Methode als optimale Methode vorgeschlagen, um die Lunge schnell aufzublasen und für die nachgeschaltete tumorhistologische Bewertung zu fixieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% buffered formalin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23-245685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 G Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Decon</td>
			<td>2405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>H19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8428</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

perfusion and inflation of the mouse lung for tumor histology

Die Fähigkeit, die Lungenhistologie zu bewerten, ist entscheidend für die Bereiche Lungenkrebsforschung und Krebsmetastasierung. Ebenso wichtig ist es, Nekropsien schnell und effizient aus Studien durchzuführen, ohne die Qualität des beschafften Gewebes zu beeinträchtigen. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine Methode zur schnellen Durchlässigkeit, Aufblasung und Fixierung von Mauslungen für die nachgelagerte histologische Analyse zu präsentieren. Diese Methode standardisiert die Lungeninflation nicht; daher erfordert es keine speziellen Verfahren oder Ausrüstung und stattdessen nur fixierend direkt durch die Luftröhre nach Perfusion durch das Herz. Dies ermöglicht eine ausreichende Schätzung der Tumorgröße, Histologie und Bewertung. Dies ermöglicht auch die Sammlung von gefrorenem Gewebe vor der Lungengewebefixierung. Diese Methode ist insofern eingeschränkt, als sie eine spätere morphometrische Quantifizierung der Lunge nicht zulässt; Es reicht jedoch mehr als aus für Lungentumoranalysen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen (GEMMs), syngene Modelle sowie Xenograft-Tumor- und Metastasenstudien.

Das obige Protokoll ermöglicht eine schnelle Perfusion, Inflation und Fixierung der Mauslungen. Die nachstehenden Abbildungen stellen die Bedeutung jedes Schritts dar. Abbildung 1 zeigt H&E-gefärbte Lungen, die mit PBS und Lunge durchdrungen wurden, bei denen der Perfusionsschritt übersprungen wurde oder die Lunge nicht richtig durchdrang. Wie gezeigt, erzeugt überschüssiges Blut in der schlecht durchbluteten Lunge weniger als ideale Histologie und kann es schwierig machen, die Lungenar...

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Perfusion and Inflation of the Mouse Lung for Tumor Histology

Der Zweck dieser Methode ist es, eine einfache und effiziente Methode für die Perfusion, Inflation und Fixierung von Mauslungen für die Untersuchung der Lungentumorpathologie und die Bewertung von Metastasen an der Lunge zu präsentieren.

Perfusion und Inflation der Mauslunge für Tumorhistologie

The ability to evaluate lung histology is critical for the fields of lung cancer research and cancer metastasis. It is equally important to perform ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

17.6K Aufrufe.  University of Alabama at Birmingham. Der Zweck dieser Methode ist es, eine einfache und effiziente Methode für die Perfusion, Inflation und Fixierung von Mauslungen für die Untersuchung der Lungentumorpathologie und die Bewertung von Metastasen an der Lunge zu präsentieren.

Serie: Perfusion and Inflation of the Mouse Lung for Tumor Histology

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we demonstrate a simple assay to evaluate tumor cell extravasation or micrometastasis. In this assay, tumor cells were injected through the tail vein, and after a short period, the lungs were dissected and digested to count the accumulated labeled tumor cells. This assay skips the initial step of primary tumor invasion into the blood vessel and facilitates the study of events in the distant organ where tumor metastasis occurs. The number of cells injected into the blood vessel can be optimized to observe a limited number of metastases. It has been reported that stromal cells in the distant organ contribute to metastasis. Thus, this assay could be a useful tool to explore potential therapeutic drugs or devices for prevention of tumor metastasis.

This manuscript describes a method to quantify tumor cell accumulation in the lungs in an animal model of tumor metastasis.

Lung Tumor Zelle Rekrutierung Assay

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

Forschung

Krebsforschung

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and activation of lipolysis and proteolysis systems. Cancer patients with cachexia benefit less from anti-neoplastic therapies and show increased mortality1. Several animal models have been established in order to investigate the molecular causes responsible for body and muscle wasting as a result of tumor growth. Here, we describe methodologies pertaining to a well-characterized model of cancer cachexia: mice bearing the C26 carcinoma2-4. Although this model is heavily used in cachexia research, different approaches make reproducibility a potential issue. The growth of the C26 tumor causes a marked and progressive loss of body and skeletal muscle mass, accompanied by reduced muscle cross-sectional area and muscle strength3-5. Adipose tissue is also lost. Wasting is coincident with elevated circulating levels of pro-inflammatory cytokines, particularly Interleukin-6 (IL-6)3, which is directly, although not entirely, responsible for C26 cachexia. It is well-accepted that a primary mechanism by which the C26 tumor induces muscle tissue depletion is the activation of skeletal muscle proteolytic systems. Thus, expression of muscle-specific ubiquitin ligases, such as atrogin-1/MAFbx and MuRF-1, represent an accepted method for the evaluation of the ongoing muscle catabolism2. Here, we present how to execute this model in a reproducible manner and how to excise several tissues and organs (the liver, spleen, and heart), as well as fat and skeletal muscles (the gastrocnemius, tibialis anterior, and quadriceps). We also provide useful protocols that describe how to perform muscle freezing, sectioning, and fiber size quantification.

Mice bearing the Colon-26 (C26) carcinoma represent a classical model of cancer cachexia. Progressive muscle wasting occurs in association with tumor growth, over-expression of muscle-specific ubiquitin ligases, and reductions in muscle cross-sectional area. Fat loss is also observed. Cachexia is studied in a time-dependent manner with increasing severity of wasting.

Die Colon-26-Karzinom Tumor-tragenden Maus als Modell für die Untersuchung von Krebs Kachexie

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently developed method uses a medical wire functionalized with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies for in vivo isolation of circulating tumor cells (CTCs)1. A patient-matched cohort in non-metastatic prostate cancer showed that the in vivo isolation technique resulted in a higher percentage of patients positive for CTCs as well as higher CTC counts as compared to the current gold standard in CTC enumeration. As cells cannot be recovered from current medical devices, a new functionalized wire (referred to as Device) was manufactured allowing capture and subsequent detachment of cells by enzymatic treatment. Cells are allowed to attach to the Device, visualized on a microscope and detached using enzymatic treatment. Recovered cells are cytocentrifuged onto membrane-coated slides and harvested individually by means of laser microdissection or micromanipulation. Single-cell samples are then subjected to single-cell whole genome amplification allowing multiple downstream analysis including screening and target-specific approaches. The procedure of isolation and recovery yields high quality DNA from single cells and does not impair subsequent whole genome amplification (WGA). A single cell&#39;s amplified DNA can be forwarded to screening and/or targeted analysis such as array comparative genome hybridization (array-CGH) or sequencing. The device allows ex vivo isolation from artificial rare cell samples (i.e. 500 target cells spiked into 5 mL of peripheral blood). Whereas detachment rates of cells are acceptable (50 - 90%), the recovery rate of detached cells onto slides spans a wide range dependent on the cell line used (&#60;10 - &#62;50%) and needs some further attention. This device is not cleared for the use in patients.

This protocol is to recover and prepare rare target cells from a mixture with non-target background cells for molecular genetic characterization at the single-cell level. DNA quality is equal to non-treated single cells and allows for single-cell application (both screening based and targeted analysis).

Ziel Zelle Voranreicherung und ganze Genome Amplifikation für einzelne Zelle nachgelagerten Charakterisierung

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by CTCs critically contributes to early lung metastatic processes, has been vigorously investigated. As such, animal models are the only approach that captures the full systemic process of metastasis. Given that problems occur in previous experimental designs for examining the contributions of CTCs to blood vessel extravasation, we established an in vivo lung colonization assay in which a long-term-fluorescence cell-tracer, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), was used to label suspended tumor cells and lung perfusion was performed to clear non-specifically trapped CTCs prior to lung removal, confocal imaging, and quantification. Polymeric fibronectin (polyFN) assembled on CTC surfaces has been found to mediate lung colonization in the final establishment of metastatic tumor tissues. Here, to specifically test the requirement of polyFN assembly on CTCs for lung colonization and extravasation, we performed short term lung colonization assays in which suspended Lewis lung carcinoma cells (LLCs) stably expressing FN-shRNA (shFN) or scramble-shRNA (shScr) and pre-labeled with 20 &#956;M of CFSE were intravenously inoculated into C57BL/6 mice. We successfully demonstrated that the abilities of shFN LLC cells to colonize the mouse lungs were significantly diminished in comparison to shScr LLC cells. Therefore, this short-term methodology may be widely applied to specifically demonstrate the ability of CTCs within the circulation to colonize the lungs.

An animal model is needed to decipher the role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting lung colonization during cancer metastasis. Here, we established and successfully performed an in vivo assay to specifically test the requirement of polymeric fibronectin (polyFN) assembly on CTCs for lung colonization.

Die Einrichtung eines Lunge Kolonisation Assays für zirkulierenden Tumor Zelle Visualisierung im Lungengewebe

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

A hallmark of advanced tumors is a switch to aerobic glycolysis that is readily measured by [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography (18F-FDG PET) imaging. Co-mutations in the KRAS proto-oncogene and the LKB1 tumor suppressor gene are frequent events in lung cancer that drive hypermetabolic, glycolytic tumor growth. A critical pathway regulating the growth and metabolism of these tumors is the mechanistic target of the rapamycin (mTOR) pathway, which can be effectively targeted using selective catalytic mTOR kinase inhibitors. The mTOR inhibitor MLN0128 suppresses glycolysis in mice bearing tumors with Kras and Lkb1 co-mutations, referred to as KL mice. The therapy response in KL mice is first measured by 18F-FDG PET and computed tomography (CT) imaging before and after the delivery of MLN0128. By utilizing 18F-FDG PET/CT, researchers are able to measure dynamic changes in the glucose metabolism in genetically engineered mouse models (GEMMs) of lung cancer following a therapeutic intervention with targeted therapies. This is followed by ex vivo autoradiography and a quantitative immunohistochemical (qIHC) analysis using morphometric software. The use of qIHC enables the detection and quantification of distinct changes in the biomarker profiles following treatment as well as the characterization of distinct tumor pathologies. The coupling of PET imaging to quantitative histology is an effective strategy to identify metabolic and therapeutic responses in vivo in mouse models of disease.

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

In this protocol, we describe how to utilize [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography and computed tomography (18F-FDG PET/CT) imaging to measure the tumor metabolic response to the targeted therapy MLN0128 in a Kras/Lkb1 mutant mouse model of lung cancer and coupled imaging with high resolution ex vivo autoradiography and quantitative histology.

Nutzung von 18F-FDG-PET/CT-Bildgebung und quantitativer Histologie, dynamische Veränderungen in der Glukose-Stoffwechsel in Mausmodellen von Lungenkrebs zu messen

A hallmark of advanced tumors is a switch to aerobic glycolysis that is readily measured by [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor cells with a natural matrix and continual flow of nutrients, as well as a model that shows the interaction of tumor cells with normal cellular components and a natural matrix. The acellular ex vivo lung model is created by isolating a rat heart-lung block and removing all the cells using the decellularization process. The right main bronchus is tied off and tumor cells are placed in the trachea by a syringe. The cells move and populate the left lung. The lung is then placed in a bioreactor where the pulmonary artery receives a continual flow of media in a closed circuit. The tumor grown on the left lung is the primary tumor. The tumor cells that are isolated in the circulating media are circulating tumor cells and the tumor cells in the right lung are metastatic lesions. The cellular ex vivo lung model is created by skipping the decellularization process. Each model can be used to answer different research questions.

Here, we present a protocol for an ex vivo lung cancer model that mimics the steps of tumor progression and helps to isolate a primary tumor, circulating tumor cells, and metastatic lesions.

Azelluläre und zellulären Lunge Modell Tumor Metastasen zu studieren

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as tumors. Because digital polymerase chain reactions (PCR) enable the precise quantification of DNA copy number variants, they are becoming an essential tool for detecting rare genetic variations, such as drug-resistant mutations. It is expected that molecular diagnoses using digital PCR (dPCR) will be available in clinical practice in the near future; thus, how to efficiently conduct dPCR with human genetic material is a hot topic. Here, we introduce a method to detect Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism using dPCR with the chip-in-a-tube format, which allows eight dPCR reactions to be simultaneously conducted. Care should be taken when filling and sealing the reaction mixture on the chips. This article demonstrates how to avoid the over- and underestimation of positive partitions. Furthermore, we present a simple procedure for collecting the dPCR product from the partitions on the chips, which can then be used to confirm the specific amplification. We hope that this methods report will help promote the dPCR with the chip-in-a-tube method in genetic research.

Digital polymerase chain reaction (PCR) is a useful tool for the high-sensitivity detection of single nucleotide variants and DNA copy number variants. Here, we demonstrate key considerations for measuring rare variants in the human genome using digital PCR with the chip-in-a-tube format.

Digitalen Polymerase-Kettenreaktion-Assay für die genetische Variation bei einem sporadischen familiäre adenomatöse Polyposis Patienten mit dem Chip-in-Rohr-Format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic alterations in oncogenes such as the KRAS oncogene, which constitutes ~25% of lung cancer cases. The difficulty in therapeutically targeting KRAS-driven lung cancer partly stems from having poor models that can mimic the progression of the disease in the lab. We describe a method that permits the relative quantification of primary KRAS lung tumors in a Cre-inducible LSL-KRAS G12D mouse model via ultrasound imaging. This method relies on brightness (B)-mode acquisition of the lung parenchyma. Tumors that are initially formed in this model are visualized as B-lines and can be quantified by counting the number of B-lines present in the acquired images. These would represent the relative tumor number formed on the surface of the mouse lung. As the formed tumors develop with time, they are perceived as deep clefts within the lung parenchyma. Since the circumference of the formed tumor is well-defined, calculating the relative tumor volume is achieved by measuring the length and width of the tumor and applying them in the formula used for tumor caliper measurements. Ultrasound imaging is a non-invasive, fast and user-friendly technique that is often used for tumor quantifications in mice. Although artifacts may appear when obtaining ultrasound images, it has been shown that this imaging technique is more advantageous for tumor quantifications in mice compared to other imaging techniques such as computed tomography (CT) imaging and bioluminescence imaging (BLI). Researchers can investigate novel therapeutic targets using this technique by comparing lung tumor initiation and progression between different groups of mice.

This protocol describes the steps taken to induce KRAS lung tumors in mice as well as the quantification of formed tumors by ultrasound imaging. Small tumors are visualized in early timepoints as B-lines. At later timepoints, relative tumor volume measurements are achieved by the measurement tool in the ultrasound software.

Nachweis der Lungentumorprogression bei Mäusen durch Ultraschall-Bildgebung

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

Pathologische Analyse der Lungenmetastasierung nach lateraler Schwanzveneninjektion von Tumorzellen

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly visualizing the response to anti-cancer therapies (chemo, radiotherapy, and biologicals), angiogenesis and metastasis with single cell resolution, places the zebrafish xenograft model as a top choice to develop preclinical studies.

The zebrafish larval xenograft assay presents several experimental advantages compared to other models, but probably the most striking is the reduction of size scale and consequently time. This reduction of scale allows single cell imaging, the use of a relatively low number of human cells (compatible with biopsies), medium-high-throughput drug screenings, but most importantly enables a significant reduction of the time of the assay. All these advantages make the zebrafish xenograft assay extremely attractive for future personalized medicine applications.

Many zebrafish xenograft protocols have been developed with a wide diversity of human tumors; however, a general and standardized protocol to efficiently generate zebrafish larval xenografts is still lacking. Here we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

Here, we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

Generation von Zebrafischen Larval Xenografts und Tumorverhaltensanalyse

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...