Esta pesquisa foi suportada pelo National Institutes of Health conceder R01HL086939 (NCC).

Neste protocolo, demonstramos um isolado, ventilado, preparação de pulmão perfundido de rato que tenha sido utilizado para quantificar o impacto de embolia pulmonar e hipóxia crônica em pulsátil vascular pulmonar pressão de fluxo de relações (Tuchscherer, Webster, e Chesler, 2006; Tuchscherer et al ., 2007). Em breve, os pulmões do rato são cirurgicamente isolada dos tecidos adjacentes, colocados em uma câmara climatizada (IL-1; Harvard Apparatus, Holliston, MA) e ventilado (Módulo de Controle Ventilatório (VCM)-R com timer módulo contador (TCM); Harvard aparelhos). A vasculatura pulmonar é perfundido com aquecida meio de cultura RPMI 1640 celular com Ficoll 3,5% usando uma bomba de seringa (Cole-Parmer, Vernon Hills, IL) para gerar o constante fluxo de formas de onda ou uma bomba de alta freqüência oscilatória (Bose-Electro Force, Eden Prairie, MN) em paralelo com a bomba de seringa para criar pulsátil de fluxo vascular pulmonar formas de onda. Transdutores de pressão (P75, Aparelho Harvard) medir a pressão da artéria pulmonar instantânea (PAP) ea pressão atrial esquerda (PAE). Vazão instantânea (Q) é medido com um medidor de fluxo de in-line (Transonic Systems, Inc., Ithaca, NY). Pulsátil da pressão do fluxo de relacionamentos são derivados a partir dessas medições, que fornecem insights sobre vascular pulmonar fisiologia e patologia e pós-carga do ventrículo direito. 1. Equipamento: <ol><li> Pulmão isolado set-up, incluindo ventilador do mouse </li><li> Sistema de aquisição de dados e computador com programa LabView </li><li> Dois transdutores de pressão e medidor de vazão para o fluxo de perfusato </li><li> Transdutor de pressão e medidor de vazão (pnemotachometer) para o fluxo das vias aéreas </li><li> Bomba de alta freqüência oscilatória e computador com Win programa de teste </li><li> Lança / zoom microscópio da lâmpada, </li><li> Banho de aquecimento com bomba de alto débito para o sistema IL-1 </li></ol> 2. Preparando o sistema IL-1 <ol><li> Água destilada aquecida a 37 ° C por banho de aquecimento é distribuída para o interior da IL-1 do sistema. </li><li> Todas as bombas, e transdutores a IL-1 cânula são conectados através de tubos limpos e toda a tubulação é lavada com água destilada aquecida a 37 ° C. Bolhas de ar, o que poderia viajar para o pulmão e causar edema, deve ser removido. Tubulação da bomba de fluxo oscilatório para o sensor de fluxo e do sensor de fluxo para a cânula da artéria pulmonar são lavados com PBS 1%. </li><li> O P75 transdutores de pressão são zerados, fechando a válvula para a cânula, a abertura das válvulas para a atmosfera e, em seguida, apertar o botão automático de zero do amplificador PLUGSYS. Então, a válvula para a atmosfera é fechada ea válvula para a cânula aberto. </li><li> A peça de cerâmica porosa na via de ventilação do sistema de IL-1 é molhada para fornecer umidade. </li></ol> 3. Soluções <ol><li> Prepare 3,5% por volume de solução de Ficoll-RPMI filtro estéril e os meios de comunicação. Filtragem a mídia garante que não haja grandes partículas que poderiam involuntariamente embolize o pulmão. Usando meios estéreis também reduz a probabilidade de edema súbito desenvolvimento no pulmão. Preencher uma seringa de 10 ml com RPMI para cirurgia e uma seringa de 60 ml com RPMI para cada ensaio experimental. Aqueça o perfusato a 37 ° C banho-maria. </li><li> Prepare 1ml de peso corporal heparina 500IU/100g do mouse (aproximado). O sal de heparina é 158IU/mg. Para um rato g ~ 25, mix 1,25 mg de sal heparina com 1ml solução PBS em um tubo de microcentrífuga de pequeno porte. </li></ol> 4. Ventilar um rato <ol><li> Após uma injeção intraperitoneal de pentobarbital 150 mg em solução por quilograma para o mouse, garantir a anestesia profunda, realizando uma pitada rígido em uma pata. Se não houver reação, preparar o mouse para a cirurgia fixando suas patas da frente para corkboard para a estabilidade. Nota: Durante todo o experimento profundidade anestésica é monitorado observando cuidadosamente o animal. Os pinos nas patas e incisões freqüentes atuar como estímulos nocivos, a falta de resposta a que confirma que o animal permanece em um plano cirúrgico de anestesia. </li><li> Pulverizar o peito com álcool a 95% para molhar as de pele e utilize uma pinça reta para agarrar a pele no pescoço. Corte de 1 cm de abertura na pele com a tesoura reta. </li><li> Uma vez que o interior do gargalo está exposta, remover todo o tecido glandular e músculo branco superficial, olhando para o esôfago e traquéia. Isolar o esôfago e traquéia do tecido em ambos os lados e posteriormente. </li><li> Inserir a pinça pequena dobrada sob a traquéia e pegar um pedaço de fio do outro lado. Puxe a sutura sob a traquéia e dê um nó frouxo cirurgiões. Não aperte a sutura ou amarrar o nó. </li><li> Um pequeno corte em ângulo &quot;v&quot; na traquéia com uma tesoura pequena, não cortar todo o caminho através da traquéia. Mover a placa da cortiça e do rato para a IL-1 aquecida sistema. Usando as duas pinças blunt, pegue a cânula traqueal e da traquéia abaixo do &quot;v&quot;. Então, deslize a cânula traqueal no tracheA através do &quot;v&quot; de abertura. Aperte a sutura em torno de traquéia e cânula traqueal para garantir a cânula dentro da traquéia. Amarrar o nó. </li><li> Iniciar ventilação (inspiração de 50%, 90 respirações / min, com a inspiração profunda) com ar ambiente. </li></ol> 5. Perfusão um rato ventilado 5.1. Acessar o ventrículo direito para injetar heparina <ol><li> Pulverizador do peito do rato com álcool novamente para re-molhar a pele. Retire toda a pele no peito acima das costelas com a pinça em linha reta e tesoura reta. Corte para cima ao longo do esterno. Levante a pele em cada lado e depois cortar a pele, seguindo a linha das costelas inferiores. </li><li> Compreender o processo xifóide, na parte inferior do esterno com uma pinça e cortar um buraco no diafragma usando a tesoura reta. Agarre o diafragma com a pinça e corte-o longe das costelas. </li><li> Compreender o processo xifóide novamente com a pinça (mão esquerda) e use a bola ponta, tesoura angulada para cortar o esterno e costelas por meio, tomando cuidado para não cortar os pulmões, coração ou dos vasos sanguíneos (use a bola ponta-on a tesoura para guiá-lo). Haverá sangue, mas desde que a ponta da tesoura é contra o esterno, o coração e os pulmões não será cortado. </li><li> Segure as costelas do lado esquerdo e cortar o máximo de costelas, conforme necessário para expor o coração. Injecte lentamente o ventrículo direito com 0,1 ml solução de heparina. Este passo é importante para prevenção de coágulos de sangue no pulmão, que danificam as células endoteliais e irá prejudicar a perfusão. A heparina deve ser injetado enquanto o coração ainda está batendo. </li></ol> 5.2. Canular a principal artéria pulmonar <ol><li> Cortar o resto das costelas (lado esquerdo e direito), usando as costas (arredondado) final do fórceps para empurre os pulmões de distância da parede torácica. Agarrando os pulmões se irá danificar o tecido delicado. Contato acidental entre as pontas de tesoura eo tecido pulmonar também irá causar danos. </li><li> Mover o microscópio no lugar sobre pulmão. Cortar o tecido glandular e gordura na parte superior do coração. Use a pinça para retirá-lo longe das artérias e veias e depois corte com a tesoura primavera, enquanto o tecido é em tensão. </li><li> Usando um outro conjunto de pinças blunt, colher da direita para a esquerda da parte superior do coração sob átrio esquerdo / ventrículo para chegar a ponta da pinça sob a aorta ea artéria pulmonar (PA). Faça isso com cuidado, não deve haver resistência para as pinças. Usando uma pinça sem corte reduz a probabilidade de acidentalmente punção da artéria pulmonar ou aorta. </li><li> Uma vez que a ponta pinça está sob a aorta e AP, pegue um pedaço de sutura e sobreviver. Dê um nó frouxo cirurgiões. Não aperte a sutura ou amarrar o nó. </li><li> Opcional: use a tesoura angulada para remover a metade inferior do corpo. Cortar através das costelas e coluna vertebral; corte a aorta ea veia cava fará com que uma quantidade significativa de sangue flua - use um Q-dica para estancar o fluxo. Coloque em um saco para descarte. </li><li> Primeiro-PA cânula com 4 ml de uma seringa de 10 ml de RPMI. Verifique se toda a tubulação está livre de bolhas de ar. Perfusão do pulmão com água destilada ou bolhas resultará em edema. </li><li> Corte um pequeno entalhe na parede livre do ventrículo direito e inserir a cânula PA, que aponta para baixo e à direita. A ponta da cânula deve ser visível através da parede transparente do PA. Infundir uma pequena quantidade de RPMI para confirmar a sua localização. Aperte a sutura ao redor da cânula aorta, e PA e amarrar o nó. Note que, neste ponto, a aorta também é amarrado para perfusão real não deve começar até o átrio esquerdo canulado é. </li></ol> 5.3. Canular o átrio esquerdo <ol><li> Corte um entalhe na parte inferior do ventrículo esquerdo e inerte do átrio esquerdo (LA) cânula, visando cima. Leve pressão pode ser necessário para abrir a válvula mitral nessa direção. No local correto, a ponta da cânula vai escorregar completamente e ser seguro, sem sutura. </li></ol> 5.4. Comece a perfusão <ol><li> Manualmente infundir RPMI da seringa de 10 ml a 0,3 ml por minuto até RMPI é evidente na tubulação de saída (rosa-ish cor em contraste com o PBS claro). Se não há fluxo na saída de tubulação, re-posição da cânula LA. Se nenhuma saída pode ser obtida com re-posicionamento, verifique se há um vazamento na artéria pulmonar. Um vazamento ou ruptura na artéria pulmonar não pode ser reparado, o que é motivo para abortar o experimento. </li><li> Conecte uma seringa de 60 ml para a cânula PA através da IL-1 do sistema e começar a infusão 1mL/min de perfusato, verificação de vazamentos e certificando-se nos pulmões ficam brancos, o que mostra que RPMI está substituindo o sangue nos pulmões. Perfundir com fluxo lento por dois minutos. </li></ol> 6. Medição pulsátil e constante pressão pulmonar Fluxo de Relacionamentos <ol><li> Para os estudos de fluxo pulsátil, primeiro defina os deslocamentos de pistão oscilatório bomba emos níveis desejados para cada freqüência na WinTest programa baseado em experiências anteriores. Variabilidade devido na estrutura pulmonar e mecânica, os deslocamentos devem ser ajustados para cada rato. Definir fluxo constante para o nível desejado. Abra a válvula na bomba oscilatório e começar a gravação de dados direito antes de executar o perfil de fluxo oscilatório (programa Wintest). Abra o arquivo de dados e traçar o fluxo experimental (Q) em Excel. Ajuste os deslocamentos de pistão oscilatório bomba em cada frequência (programa Wintest) de modo que Q e Q max min são tão desejado. </li><li> Para ensaios de fluxo constante, fechar a válvula na bomba oscilatório. Se essa válvula é deixada aberta, a bomba oscilatório age como um capacitor, amortecendo as mudanças de uma taxa de fluxo para o outro. Coletar dados para pelo menos 10 segundos a cada taxa de fluxo ou até que a pressão PA não muda por mais de 5%. </li><li> Para medições de vazão ou pulsátil ou contínuo, ventilação velhos a uma pressão constante antes da coleta de dados. Retomar a ventilação imediatamente após a coleta de dados. </li><li> Preste atenção para RPMI na tubulação das vias aéreas, isto é evidência de edema e é motivo para abortar o experimento. Além disso, não deixe RPMI atingir a pressão das vias aéreas ou sensores de fluxo, pois irá danificar os transdutores. </li></ol> 7. Resultados representativos: Resultados representante constante: No pulmão isolado set-up o pesquisador tem a capacidade de controlar de forma independente, não só o fluxo pulmonar Q mas também as vias aéreas pressão P do ar e deixou LAP pressão atrial. Isto é vantajoso porque Q, P ar e LAP influenciar a vasculatura pulmonar e consequente PAP pressão da artéria pulmonar. Outra vantagem é que os resultados obtidos são independentes do tônus ​​do sistema nervoso simpático 1, status de volume e anestesia 2. PAP alterações induzidas pela escada-Q para mudanças na fixa P ar e fixa ou variável LAP são mostrados na Figura 1. Note-se que na preparação de pulmão isolado, a cânula LAP está normalmente ligado ao tubo que direciona o perfusato em um recipiente de resíduos. Com este tubo no lugar, LAP é linearmente dependente Q devido ao fluxo de Poiseuille. No entanto, a altura da tomada e recipiente de resíduos pode ser ajustado manualmente para fornecer uma constante, LAP não-zero ou a tubulação pode ser removido para permitir de zero LAP que é independente de Q. Representante Resultados pulsátil: Enquanto arbitrária pulsátil do fluxo de onda pode ser gerada com este sistema, que normalmente geram fluxo da forma Q = 3 + 2 sin (2 f πt) ml / min, nas freqüências de f = 1, 2, 5, 10, 15 e 20 Hz para avaliar a impedância linearizada da vasculatura pulmonar (Figura 2: painel superior). A partir das medições resultantes LAP PAP, e Q, magnitude da impedância vascular pulmonar (Z) e fase (θ) são calculados pela primeira decomposição um ciclo completo da AP sinusoidal = PAP LAP-Q e em cada frequência sinusoidal taxa de fluxo de impostos em uma série de harmônicos sinusoidal usando uma transformada de Fourier. A relação da pressão de transformar a fluir rendimentos transformar a impedância vascualar pulmonar, PVZ = FFT (AP) / FFT (Q), que tem magnitude Z e fase θ. Impedância de entrada Z 0, impedância característica Z C, e índice de reflexão da onda R W, são calculados a partir da magnitude da impedância. Em particular, Z 0 é calculado a partir de Z a 0 harmônica (f = 0 Hz), calculados sobre todas as freqüências, Z C é calculada como a média de Z entre o mínimo primeiro (5 Hz) e 20 Hz, e R W é calculado como (Z-Z 0 C) / (Z + Z 0 C) 3. <img src="/files/ftp_upload/2690/2690fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 constante fluxo de formas de onda (linha superior) e as pressões resultantes. (Segunda linha: PAP, P ar, LAP) em função do tempo com diferentes combinações de LAP e ar P. A linha inferior mostra PAP vs P. Em (A) e (B), aumenta e diminui com LAP Q porque a tubulação de saída foi no lugar. Esta tubulação foi removido para (C) de modo que LAP é constante e independente de P. Em (D) e (E) a altura da tubulação de saída foi ajustada manualmente para que LAP é maior, mas independente do Q. P ar era tanto a inspiratório final (A, C, D) ou pressão expiratória final (B, E). <img src="/files/ftp_upload/2690/2690fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2 fluxo pulsátil forma de onda Q (painel superior) e as pressões resultantes (painel inferior: PAP LAP, e P ar). Como uma função do tempo. A partir dessas pulmonar pulsátil da pressão do fluxo de relacionamentos, PVZ pode ser calculado, o que reflete a pós-carga ventricular total direita.

<ol>
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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+vascular+remodeling+in+isolated+mouse+lungs:+Effects+on+pulsatile+pressure-flow+relationships.">Pulmonary vascular remodeling in isolated mouse lungs: Effects on pulsatile pressure-flow relationships.</a> Journal of Biomechanics. 40, 993-1001 (2007).</li><li>Vanderpool, R., Naeije, R., Chesler, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedance+in+Isolated+Mouse+Lungs+for+the+Determination+of+Site+of+Action+of+Vasoactive+Agents+and+Disease.">Impedance in Isolated Mouse Lungs for the Determination of Site of Action of Vasoactive Agents and Disease.</a> Ann Biomed Eng. , (2010).</li><li>Vanderpool, R., Kim, A., Molthen, R., Chesler, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+rho+kinase+inhibition+on+chronic+hypoxia-induced+changes+in+proximal+and+distal+pulmonary+arterial+structure+and+function.">Effects of acute rho kinase inhibition on chronic hypoxia-induced changes in proximal and distal pulmonary arterial structure and function.</a> Journal of Applied Physiology. , (2010).</li><li>El-Bizri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smooth+muscle+protein+22alpha-mediated+patchy+deletion+of+Bmpr1a+impairs+cardiac+contractility+but+protects+against+pulmonary+vascular+remodeling.">Smooth muscle protein 22alpha-mediated patchy deletion of Bmpr1a impairs cardiac contractility but protects against pulmonary vascular remodeling.</a> Circ Res. 102, 380-388 (2008).</li><li>Champion, H., Michelakis, E., Hassoun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+invasive+and+noninvasive+approach+to+the+right+ventricle-pulmonary+circulation+unit:+state+of+the+art+and+clinical+and+research+implications.">Comprehensive invasive and noninvasive approach to the right ventricle-pulmonary circulation unit: state of the art and clinical and research implications.</a> Circulation. 120, 992-1007 (2009).</li><li>Gan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasively+assessed+pulmonary+artery+stiffness+predicts+mortality+in+pulmonary+arterial+hypertension.">Noninvasively assessed pulmonary artery stiffness predicts mortality in pulmonary arterial hypertension.</a> Chest. 132, 1906-1912 (2007).</li><li>Mahapatra, S., Nishimura, R., Sorajja, P., Cha, S., McGoon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+pulmonary+arterial+capacitance+and+mortality+in+idiopathic+pulmonary+arterial+hypertension.">Relationship of pulmonary arterial capacitance and mortality in idiopathic pulmonary arterial hypertension.</a> J Am Coll Cardiol. 47, 799-803 (2006).</li><li>Bogaard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+pulmonary+artery+pressure+elevation+is+insufficient+to+explain+right+heart+failure.">Chronic pulmonary artery pressure elevation is insufficient to explain right heart failure.</a> Circulation. 120, 1951-1960 (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Etapas críticas na cirurgia É fundamental que se tenha o cuidado ao cortar a caixa torácica longe dos pulmões. Os pulmões devem ser completamente expostos e desinibida por tecidos em volta durante a inflação, mas não danificada durante o processo de isolamento. O uso de um objeto liso como o back-end da pinça pode ser usada para manter os pulmões de distância da parede torácica para que haja um caminho claro para a tesoura para cortar. Outro passo fundamental é a colocação da sut...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1 ml syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Sci</td>
<td>14-829-10F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 ml syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Sci</td>
<td>14-823-2A </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 ml syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Sci</td>
<td>13-689-8 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI with GLN 6/PK</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Sci</td>
<td>MT10040CV </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bottle Top Filters</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Sci</td>
<td>09-761-57</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ficoll PM 70</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F2878-100g</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heparin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Y27632</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>Y0503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Angled Ball Iris scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14109-09</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vannas Spring Scissors - 4mm Blades</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15018-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine Iris Scissors - straight</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14106-09</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont #5/45 Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11251-35</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont Medical Biology Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11254-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lauda E100 ECO-line 003 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>Comparable to Lauda-Brinkmann E-103, 62400-922</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IL-1 Isolated perfused mouse lung system </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus </td>
<td>739904 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS Module</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>730020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TS410 Flow Modules</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Transonic </td>
<td>TS410</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ME 4 PXN Precision PXN Inline Flowsensors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Transonic</td>
<td>ME 4 PXN</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cole-Parmer Multi-Syringe Pumps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cole-Parmer </td>
<td>EW-74900-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nembutal 50MG/ML 20ML Vial</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amatheon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

characterization of the isolated, ventilated, and instrumented mouse lung perfused with pulsatile flow

O isolado, ventilado e instrumentado preparação de pulmão do rato permite constante e pulsátil vascular pulmonar pressão de fluxo de relacionamentos para ser medido com controlo independente sobre a taxa de fluxo arterial pulmonar, forma de onda vazão, pressão das vias aéreas e da pressão atrial esquerda. Resistência vascular pulmonar é calculado com base multi-ponto, constante pressão de fluxo de curvas; impedância vascular pulmonar é calculado a partir pulsátil da pressão do fluxo de curvas obtidas em uma faixa de freqüências. Como agora reconhecida clinicamente, impedância é uma medida superior de pós-carga ventricular direita do que a resistência, pois inclui os efeitos da complacência vascular, que não são desprezíveis, principalmente na circulação pulmonar. Três métricas importantes de impedância - o zero hertz impedância Z 0, a impedância característica Z C, eo índice de reflexão da onda R W - fornecer a introspecção em distal área transversal disponível para o fluxo arterial, rigidez arterial proximal e da impedância a montante ea jusante incompatibilidade, respectivamente. Todos os resultados obtidos no isolado, ventilado e pulmões perfundidos são independentes do tônus ​​do sistema nervoso simpático, o estado do volume e os efeitos da anestesia. Temos utilizado esta técnica para quantificar o impacto de embolia pulmonar e hipóxia crônica sobre a resistência e impedância, e para diferenciar entre sítios de ação (ie, proximal versus distal) de drogas vasoativas e doenças usando a dependência da pressão de Z C. Além disso, quando estas técnicas são usadas com os pulmões de linhagens geneticamente modificadas de ratos, os efeitos do nível molecular defeitos na estrutura e função vascular pulmonar pode ser determinada.

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Characterization of the Isolated, Ventilated, and Instrumented Mouse Lung Perfused with Pulsatile Flow

O protocolo a seguir descreve o processo de isolamento, ventilação e instrumentação pulmões do rato para medir estável ou pulsátil vascular pulmonar pressão de fluxo de relações, a fim de quantificar os efeitos do fluxo sanguíneo, o fluxo de ar, alterações das vias aéreas e alterações vasculares no pós-carga do ventrículo direito.

Caracterização do isolado, ventilado, Lung Mouse e Instrumentados perfundidos com fluxo pulsátil

The isolated, ventilated and instrumented mouse lung preparation allows steady and pulsatile pulmonary vascular pressure-flow relationships to be measured ...

characterization-isolated-ventilated-instrumented-mouse-lung-perfused

Research

JoVE Journal

Biology

16.2K visualizações.  University of Wisconsin – Madison. O protocolo a seguir descreve o processo de isolamento, ventilação e instrumentação pulmões do rato para medir estável ou pulsátil vascular pulmonar pressão de fluxo de relações, a fim de quantificar os efeitos do fluxo sanguíneo, o fluxo de ar, alterações das vias aéreas e alterações vasculares no pós-carga do ventrículo direito.

Vídeo: Characterization of the Isolated, Ventilated, and Instrumented Mouse Lung Perfused with Pulsatile Flow

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Purificação de Citometria de Fluxo de células de camundongo meiótica

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Biologia

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3. On the macro scale the stiffness of tissues and organs within the human body span several orders of magnitude4. Much less is known about how stiffness varies spatially within tissues, and what the scope and spatial scale of stiffness changes are in disease processes that result in tissue remodeling. To better understand how changes in matrix stiffness contribute to cellular physiology in health and disease, measurements of tissue stiffness obtained at a spatial scale relevant to resident cells are needed. This is particularly true for the lung, a highly compliant and elastic tissue in which matrix remodeling is a prominent feature in diseases such as asthma, emphysema, hypertension and fibrosis. To characterize the local mechanical environment of lung parenchyma at a spatial scale relevant to resident cells, we have developed methods to directly measure the local elastic properties of fresh murine lung tissue using atomic force microscopy (AFM) microindentation. With appropriate choice of AFM indentor, cantilever, and indentation depth, these methods allow measurements of local tissue shear modulus in parallel with phase contrast and fluorescence imaging of the region of interest. Systematic sampling of tissue strips provides maps of tissue mechanical properties that reveal local spatial variations in shear modulus. Correlations between mechanical properties and underlying anatomical and pathological features illustrate how stiffness varies with matrix deposition in fibrosis. These methods can be extended to other soft tissues and disease processes to reveal how local tissue mechanical properties vary across space and disease progression.

The stiffness of the extracellular matrix strongly influences multiple behaviors of adherent cells. Matrix stiffness varies spatially throughout a tissue, and undergoes modification in various disease conditions. Here we develop methods to characterize spatial variations in stiffness in normal and fibrotic mouse lung tissue using atomic force microscopy microindentation.

Micro-Mecânica Caracterização do tecido pulmonar Usando Microscopia de Força Atômica

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor formation. Taken together these studies suggest that resident lung MSC play a role during pulmonary tissue homeostasis, injury and repair during diseases such as pulmonary fibrosis (PF) and arterial hypertension (PAH). Here we describe a technology to define a population of resident lung MSC. The definition of this population in vivo pulmonary tissue using a define set of markers facilitates the repeated isolation of a well-characterized stem cell population by flow cytometry and the study of a specific cell type and function.

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

In this article we demonstrate the isolation of murine resident lung mesenchymal stem cells (lung MSC), their expansion, characterization and analysis of immunomodulatory properties.

Isolamento &amp; Caracterização da Hoechst Baixa CD45 Negativo Mouse Células-Tronco Mesenquimais de pulmão

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Protein Transfection of Mouse Lung

Increasing protein expression enables researchers to better understand the functional role of that protein in regulating key biological processes1. In the lung, this has been achieved typically through genetic approaches that utilize transgenic mice2,3 or viral or non-viral vectors that elevate protein levels via increased gene expression4. Transgenic mice are costly and time-consuming to generate and the random insertion of a transgene or chronic gene expression can alter normal lung development and thus limit the utility of the model5. While conditional transgenics avert problems associated with chronic gene expression6, the reverse tetracycline-controlled transactivator (rtTA) mice, which are used to generate conditional expression, develop spontaneous air space enlargement7. As with transgenics, the use of viral and non-viral vectors is expensive8 and can provoke dose-dependent inflammatory responses that confound results9 and hinder expression10. Moreover, the efficacy of repeated doses are limited by enhanced immune responses to the vector11,12. Researchers are developing adeno-associated viral (AAV) vectors that provoke less inflammation and have longer expression within the lung13.
Using &beta;-galactosidase, we present a method for rapidly and effectively increasing protein expression within the lung using a direct protein transfection technique. This protocol mixes a fixed amount of purified protein with 20 &mu;l of a lipid-based transfection reagent (Pro-Ject, Pierce Bio) to allow penetration into the lung tissue itself. The liposomal protein mixture is then injected into the lungs of the mice via the trachea using a microsprayer (Penn Century, Philadelphia, PA). The microsprayer generates a fine plume of liquid aerosol throughout the lungs. Using the technique we have demonstrated uniform deposition of the injected protein throughout the airways and the alveoli of mice14. The lipid transfection technique allows the use of a small amount of protein to achieve effect. This limits the inflammatory response that otherwise would be provoked by high protein administration. Indeed, using this technique we published that we were able to significantly increase PP2A activity in the lung without affecting lung lavage cellularity15. Lung lavage cellularity taken 24 hr after challenge was comparable to controls (27&plusmn;4 control vs. 31&plusmn;5 albumin transfected; N=6 per group). Moreover, it increases protein levels without inducing lung developmental changes or architectural changes that can occur in transgenic models. However, the need for repeated administrations may make this technique less favorable for studies examining the effects of long-term increases in protein expression. This would be particularly true for proteins with short half-lives.

Transgenic mice or viral vectors have been used to increase protein expression within the lung. However, these techniques are time-consuming, technically challenging and have off-target effects that can confound results. Our protein transfection protocol uses a lipid based transfection reagent and an ultrafine microsprayer to uniformly deliver active protein to lung cells.

A transfecção de proteína de rato Lung

Increasing protein expression enables researchers to  better understand the functional role of that protein in regulating key  biological processes1. In ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Avaliação do cálcio Faíscas intactas fibras musculares esqueléticas

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

Quantificar Único microvasos Permeabilidade em perfusão isolada-Sangue Rat Lung Preparação

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One of the primary risk factors of EAC is Barrett&#8217;s esophagus (BE), a metaplastic change of the normal squamous esophagus in response to chronic heartburn. Despite the well-established connection between EAC and BE, interrogation of the molecular events, particularly altered signaling pathways involving progression of BE to EAC, are poorly understood. Much of this is due to the lack of suitable in vitro models available to study these diseases. Recently, immortalized BE cell lines have become commercially available allowing for in vitro studies of BE. Here, we present a method for immunofluorescent staining of immortalized BE cell lines, allowing in vitro characterization of cell signaling and structure after exposure to therapeutic compounds. Application of these techniques will help develop insight into the mechanisms involved in BE to EAC progression and provide potential avenues for treatment and prevention of EAC.

There is a discernible need for improved information on molecular drivers of Barrett&#8217;s Esophagus. Immunofluorescent staining is a useful technique for understanding the effects of cell signaling on cell morphology. We present a simple, effective protocol for the use of immunofluorescent staining to assess therapeutic treatment in Barrett&#8217;s Esophagus cells.

O método de imunofluorescência para Caracterização de Células Esôfago de Barrett

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods are needed that can quantify the pathologic changes. Furthermore, to provide translational relevance to the mouse models, such measurements should be tests that can easily be done in both humans and mice. Unfortunately, in the present literature few phenotypic measurements of lung function have direct application to humans. One exception is the diffusing capacity for carbon monoxide, which is a measurement that is routinely done in humans. In the present report, we describe a means to quickly and simply measure this diffusing capacity in mice. The procedure involves brief lung inflation with tracer gases in an anesthetized mouse, followed by a 1 min gas analysis time. We have tested the ability of this method to detect several lung pathologies, including emphysema, fibrosis, acute lung injury, and influenza and fungal lung infections, as well as monitoring lung maturation in young pups. Results show significant decreases in all the lung pathologies, as well as an increase in the diffusing capacity with lung maturation. This measurement of lung diffusing capacity thus provides a pulmonary function test that has broad application with its ability to detect phenotypic structural changes with most of the existing pathologic lung models.

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

We describe a means to quickly and simply measure the lung diffusing capacity in mice and show that it is sufficiently sensitive to phenotype changes in multiple common lung pathologies. This metric thus brings direct translational relevance to the mouse models, since diffusing capacity is also easily measured in humans.

Função Pulmonar Fenotipagem Rato<em&gt; In Vivo</em&gt; Com a capacidade pulmonar Diffusing

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

A técnica de rim perfundidos rato isolado

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Caracterização do isolado, ventilado, Lung Mouse e Instrumentados perfundidos com fluxo pulsátil

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