Diese Arbeit wurde von der Hygiene Fonds der Medizinischen Universität Graz unterstützt. Alle Probanden gaben ihre Einwilligung. Institutionelle Zustimmung des Studienprotokoll wurde von der Medizinischen Universität Graz erhalten.

1. Probengewinnung <ol><li> Entfernen Sie feste palatinale Expander nach 4 Monaten von intraoralen Service. Verwenden Sie NOLA Dry Field System die Geräte, bevor Sie sie (Abbildungen 1 und 2) zu isolieren. </li><li> Gebrauch sterilisiert Zangen, Handschuhen und Trays zu Expander ohne Zugabe von Verunreinigungen (Abb. 3 und 4) zu entfernen. </li><li> Shop-Objekte in Sarstedt 120 ml Fläschchen bei -20 ° C. Nehmen Sie zum Labor auf Eis und Verfahren innerhalb von 24 Stunden. </li></ol> 2. Biofilm Fixierung <ol><li> Abkratzen Biofilm Flocken mit einem sterilen Skalpell oder sammeln Stücke mit einer sterilen Pinzette. </li><li> Add eiskalte 4% PFA-Lösung bis die Probe gut bedeckt ist. </li><li> Inkubieren Sie die Mischung bei +4 ° C (nicht einfrieren!) Für 3 bis 12 Stunden. Längere Fixierung Zeiten oder höher Fixierung Temperaturen machen die Zellhüllen der gram-negativen Zellen weniger durchlässig für Oligonukleotid-Sonden. </li><li> Entfernen PFA-Lösung und Waschen mit eiskaltem 1X PBS. Wiederholen Sie diesen Schritt 2-3 mal zu remove restliche PFA. </li><li> Resuspendieren der Probe in 1 vol. eiskaltes 1X PBS geben und 1 vol. eiskaltem 96% (v / v) Ethanol. </li><li> Lagern Sie die Proben bei -20 ° C. Proben fixiert nach diesem Protokoll kann für mehrere Monate bis Jahre gespeichert werden. </li></ol> 3. Die Dehydratisierung von festen Proben <ol><li> Übernehmen 5-30 ul der PFA-fixierten Probenmaterials auf einen Objektträger. </li><li> Trocken bei 46 ° C für ca. 15 min oder bei Raumtemperatur länger. Tauwetter das Lysozym und das Formamid. </li><li> Add 250 ul Lysozym (1mg/ml) bei Raumtemperatur für 10 min und erleichtert so das Eindringen der Sonden in den Zellen durch die teilweise Zerstörung der Zellwände. </li><li> Dip Abgleiten in 50%, 80% und 96% (v / v) Ethanol für jeweils 3 min. Die entwässernde Wirkung der Ethanol-Konzentration Serie wird zerfallen die Zellmembranen. </li><li> Trocknen Sie die Objektträger bei 46 ° C für 10 min. </li></ol> 4. In-situ-Hybridisierung <ol><li> Bereiten Sie 1 mlfrischen Hybridisierungspuffer (siehe Tabelle 1 für Konzentrationen). Formamid-Konzentrationen in dieser Studie verwendet: 10% (EUBmix), 20% (Bac303, POGI, MUT590) bzw. 45% (LGCmix). </li><li> Auftauen Oligonukleotidsonde Lösungen. Aufgetaute Sonden sollten auf Eis gehalten werden und vor Licht geschützt. </li><li> Add 2 ul jeder Sonde zu 200 ul Hybridisierungspuffer, gut mischen und wenden Sie die Mischung auf die dehydrierte Probe auf einen Objektträger. </li><li> Legen Sie ein Stück Seidenpapier in eine quadratische Petrischale und gießen Sie die verbleibenden Hybridisierungspuffer auf die Tissue-Papier. </li><li> Anschließend wird der Objektträger horizontal in die Schüssel, und schließen Sie die Schüssel. Inkubieren in einem Ofen bei 46 ° C für 1-5 Stunden (90 min wird in den meisten Fällen genügen). Das Gericht fungiert als einer feuchten Kammer verhindert Verdunstung Hybridisierungslösung aus der Folie. Insbesondere kann die Verdunstung von Formamid verursachen unspezifische Sonde Bindung an Nicht-Zielzellen. </li><li> Bereiten Sie 50 ml Waschpuffer (siehe Tabelle 2 für concentrations). Bereiten Sie den Waschpuffer in einem 50 ml-Tube und Vorwärmung bis 48 ° C in einem Wasserbad. Der Waschschritt wird bei 48 ° C durchgeführt </li><li> Entfernen Sie die Schale mit der Folie aus der Hybridisierungsofen. Sofort abwaschen Hybridisierungspuffer mit einem kleinen Volumen von vorgewärmten Waschpuffer, und übertragen Sie die Folie in den verbleibenden Waschpuffer. </li><li> Das Röhrchen mit dem Waschpuffer und dem Schlitten zurück ins Wasserbad und Inkubieren bei 48 ° C für 10-15 min. </li><li> Entfernen Sie Folie aus der Tube und tauchen Sie ein in eiskaltem ddH 2 O für 2-3 Sekunden, um restliche Waschpuffer zu beseitigen. </li><li> Der Luft trocknen die Folie so schnell wie möglich (die Verwendung von Druckluft wird empfohlen). Schnelle Trocknung reduziert Sonde Dissoziation. </li><li> Getrocknete Folien können im Dunkeln bei -20 ° C für mehrere Wochen gelagert, ohne signifikanten Verlust der Sonde-verliehenen Fluoreszenzsignal. </li></ol> 5. Mikroskopie <ol><li> Nach FISH und Waschen apply zwei Tropfen antifadent in der Nähe der linken und rechten Ende eines Schiebers (gefroren Scheiben sollten auf Raumtemperatur erwärmt vor diesem Schritt werden). </li><li> Legen Sie ein Mikroskop Abdeckung auf der Oberseite gleiten und warten, bis die antifadent über die gesamte Folie ausgebreitet hat. Beachten Sie, dass eine übermäßige Menge an antifadent kann das mikroskopische Bild verwischen. </li><li> Beachten Sie die Proben unter einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit geeigneten Filtern oder Lasern ausgestattet. Wir verwendeten eine Leica TCS-Einheit (HCX PL APO/63x; NA 1,2). Die Daten können mit einer Software wie Imaris oder AMIRA analysiert werden. </li><li> Slides in antifadent eingebettet werden bei +4 ° C gelagert werden (nicht einfrieren) für bis zu 7 Tage vor der Sonde-verliehenen Fluoreszenz beginnt zu sinken. Alternativ kann die antifadent mit ddH 2 O entfernt werden, und die getrockneten Objektträger können bei -20 ° C über einen längeren Zeitraum gelagert werden. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Scraping Biofilm aus festsitzenden kieferorthopädischen Apparaturen (Abbildung 5) ergibt geeignet Flocken (Abb. 6), die direkt auf beschichtete Objektträger für die Mikroskopie hybridisiert werden können. Auf diese Weise können verschiedene Gruppen von orobiome Bakterien in ihrer natürlichen dreidimensionalen Umgebung von Tagging bakterielle rRNA mit unterschiedlich markierten Sonden (Abb. 7 und 8) identifiziert werden. In Abbildung 7 wurde Biofilm mit EUBmix (grün, alle Bakterien) und LGCmix (gelb, Firmicutes) gefärbt. Firmicutes erscheinen in grün, wie sie mit gelben und blauen Flecken waren. In Abbildung 8 wurde Biofilm mit EUBmix (rot, alle Bakterien), Bac303 (blau, Bacteroidetes) und POGI (gelb, Porphyromonas gingivalis) gefärbt. Porphyromonas gingivalis in gelblich-weiß gezeigt wird, wie alle drei Sonden an die DNA binden und die Überlappung der Farben ergibt sich ein weißes Signal. Morphologischen Unterschiede zwischen Gruppen von Bakterien können auch identifiziert werden (Abb. 9 und 10). Große Cluster von Kokken sind in Abbildung 9, wo Färbung mit EUBmix durchgeführt wurde gezeigt (grün, alle bacteria). Verschiedene Formen von oralen Bakterien wurden visualisiert in Abbildung 10, wo coccoid und fadenförmige Bakterien durch Färbung mit EUBmix (rot) unterschieden werden können. Auch eine typische pilzförmige Struktur des Biofilms können über 3D-Modellierung der CLSM-Daten (Abbildungen 11 und 12) bearbeitet werden <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2967/Film1 Klug Santigli 01_2_JES_Web.mov">Klicken Sie hier, um einen Film von der 3D-Modellierung zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig1.jpg" /> Abbildung 1. Fester palatinale Expander in situ. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig2.jpg" /> Abbildung 2. Nola Dry Field System. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig3.jpg" /> Abbildung 3. Sterilisierte Zangen, Handschuhen und Fach. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig4.jpg" /> Abbildung 4. Removed Expander. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig5.jpg" /> Abbildung 5. Abschaben Biofilm mit einem sterilen Skalpell. <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig6.jpg" /> Abbildung 6. Resin Flocken direkt auf beschichtete Objektträger hybridisiert. <img alt="Abbildung 7" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig7.jpg" /> Abbildung 7 CLSM Bild:. Ausdifferenzierung eines bestimmten bakteriellen Gruppe. 2D-Überlagerung von 3D-CLSM-Stack-Daten. Biofilm gefärbt mit EUBmix (grün, alle Bakterien) und LGCmix (gelb, Firmicutes). <img alt="Abbildung 8" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig8.jpg" /> Abbildung 8 CLSM Bild:. Ausdifferenzierung eines bestimmten bakteriellen Gruppe. 2D-Überlagerung von 3D-CLSM-Stack-Daten. Biofilm gefärbt mit EUBmix (rot, alle Bakterien), Bac303 (blau, Bacteroidetes) und POGI (gelb, Porphyromonas gingivalis). <img alt="Abbildung 9" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig9.jpg" /> Abbildung 9 CLSM Bild:. Differenzierung von spezifischen Morphologien. 2D-Überlagerung von 3D-CLSM-Stack-Daten. Biofilm gefärbt mit EUBmix (grün, alle Bakterien). Große Cluster von Kokken (Pfeile). <img alt="Abbildung 10" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig10.jpg" /> . Abbildung 10 CLSM-Bilder: Differenzierung von spezifischen Morphologien. 2D-Überlagerung von 3D-CLSM-Stack-Daten. Biofilm gefärbt mit EUBmix (rot, alle Bakterien). Kokkoiden (Pfeil unten) und fadenförmige Bakterien (Pfeil oben) unterschieden werden kann. <img alt="Abbildung 11" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig11.jpg" /> Abbildung 11. Mushroom Struktur, 3D-Ansichten von unten. Stacks von Biofilm-Flocken (abgeschabt der Oberfläche eines kieferorthopädischen Gerätes), mit EUBmix und Verfahren angefärbtssed mit Imaris (CLSM-Bild). <img alt="Abbildung 11" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig11.jpg" /> Abbildung 12. Mushroom, 3D Seitenansicht. Stacks von Biofilm-Flocken (abgeschabt der Oberfläche eines kieferorthopädischen Gerätes) mit Imaris (CLSM Bild) verarbeitet. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Hybridisierungspuffer (200 ul) </td></tr><tr><td> Formamid-Konzentration </td><td> 10% </td><td> 20% </td><td> 45% </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 36 </td><td> 36 </td><td> 36 </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 2% SDS </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> FA </td><td> 20 </td><td> 40 </td><td> 90 </td></tr><tr><td><strong&gt; DdH 2 O </td><td> 138 </td><td> 118 </td><td> 68 </td></tr><tr><td> Jede FISH-Sonde </td><td> 2 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Bestandteile des Hybridisierungspuffer (Konzentrationen in ul). <table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Waschpuffer (50 ml) </td></tr><tr><td> Formamid-Konzentration </td><td> 10% </td><td> 20% </td><td> 45% </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 4500 </td><td> 2150 </td><td> 300 </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl </td><td> 1000 </td><td> 1000 </td><td> 1000 </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> 0 </td><td> 500 </td><td> 500 </td></tr><tr><td> ddH 2 O </td><td> 44 500 </td><td> 46 350 </td&gt; <td> 48 200 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Inhaltsstoffe von Wasch-Puffer (Konzentrationen in ul). Movie 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2967/Film1 Klug Santigli 01_2_JES_Web.mov">Klicken Sie hier, um den Film zu sehen.</a>

<ol>
	<li>Sunde, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+for+direct+visualization+of+bacteria+in+periapical+lesions+of+asymptomatic+root-filled+teeth.">Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of bacteria in periapical lesions of asymptomatic root-filled teeth.</a> Microbiology. 149, 1095-1102 (2003).</li><li>Sussman, M., Loya, Y., Fine, M., Rosenberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+marine+fireworm+Hermodice+carunculata+is+a+winter+reservoir+and+spring-summer+vector+for+the+coral-bleaching+pathogen+Vibrio+shiloi.">The marine fireworm Hermodice carunculata is a winter reservoir and spring-summer vector for the coral-bleaching pathogen Vibrio shiloi.</a> Environ. 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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Das Protokoll beschrieben ist eine sehr praktikable Ansatz zur Färbung Biofilme aus harten Materialien gesammelt. Sampling und Hybridisierung sind die wichtigsten Schritte. Bei der Probenahme ist darauf zu achten, dass Scheiben von ausreichender Dicke gesammelt werden, um sicherzustellen, dass der Biofilm-Struktur intakt bleibt. Während der Hybridisierung ist es wichtig, starken Temperaturschwankungen zu vermeiden, wodurch die unspezifische Bindung oder Verlust der Bindung, der fluoreszenzmarkierten Sonden. Diese FISH-Protokoll ist eine elegante Methode zur normalen heterogenen Biofilm direkt auf Glas-Objektträger Fleck ohne Unterbrechung seiner Zusammensetzung. Die Folien können sofort für die Mikroskopie, ohne die Notwendigkeit, die Probe erneut verschieben werden. Auf diese Weise ist eine Verbesserung gegenüber Färbung in Röhren von weniger Querkraft wird, um den Biofilm aufgebracht werden. Slices&gt; 50 um dicke vorbereitet und auf diese Weise untersucht werden.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<th>Oligonucleotides</th>
			<th>Target organism</th>
			<th>Fluorochrome</th>
		</tr>
		<tr>
			<td>EUB338 - 338III</td>
			<td>Eubacteria</td>
			<td>Cy3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LGC354 A-C</td>
			<td>Firmicutes</td>
			<td>FITC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bac303</td>
			<td>Bacteroidetes</td>
			<td>Cy5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mut590</td>
			<td>Streptococcus mutans</td>
			<td>FITC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POGI</td>
			<td>Porphyromonas gingivalis</td>
			<td>FITC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 3. Oligonucleotides (refer to probeBase13 for details).
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<th>Component</th>
			<th>Company</th>
			<th>Comments</th>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4% solution in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 x PBS</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>3 x solution prepared</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (100%)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Roth</td>
			<td>100 mg/ml stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>99.5% solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% SDS</td>
			<td>Roth</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FISH probes (oligonucleotides)</td>
			<td>Invitrogen, Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifadent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<th>Equipment</th>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>IKA Tez</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysine-coated slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 4. Materials and equipment.

oral biofilm analysis of palatal expanders by fluorescence in-situ hybridization and confocal laser scanning microscopy

Konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) der natürlichen heterogenen Biofilm ist heute durch ein umfassendes Angebot an Färbetechniken, von denen einer Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) erleichtert. 1,2 Wir haben eine Pilotstudie, in der mündlichen Biofilm Proben aus festen gesammelt wurden, kieferorthopädischen Apparaturen (palatinale Expander) wurden durch FISH mit dem Ziel, die dreidimensionale Organisation der natürlichen Biofilm und Plaque zu beurteilen gefärbt. 3,4 FISH schafft eine Gelegenheit, um Zellen in ihrer Muttersprache Biofilm-Umgebung Fleck durch die Verwendung von fluoreszenzmarkierten 16S rRNA-Targeting-Sonden. 4-7,19 Im Vergleich zu alternativen Techniken wie Immunfluoreszenz Kennzeichnung, ist dies eine kostengünstige, präzise und einfache Kennzeichnung Technik, um verschiedene bakterielle Gruppen in gemischten Biofilm Konsortien zu untersuchen. 18,20 Allgemeine Sonden verwendet wurden, die Bindung an Eubakterien ( EUB338 + + EUB338II EUB338III; nachfolgend EUBmix), 8-10 Firmicutes (LGC354 AC;. Wurden nachfolgend LGCmix), 9,10 und Bacteroidetes (Bac303) 11 Darüber hinaus spezifische Sonden Bindung an Streptococcus mutans (MUT590) 12,13 und Porphyromonas gingivalis (POGI) 13,14 verwendet . Die extreme Härte der Oberfläche beteiligten Materialien (Edelstahl und Acryl) zwang uns, neue Wege zur Herstellung des Biofilms zu finden. Da diese Oberflächen-Materialien könnten nicht ohne weiteres mit einem Kryotom geschnitten werden, wurden verschiedene Methoden zur Probenahme untersucht werden, um intakte orale Biofilm zu erhalten. Die meisten praktikable dieser Ansätze ist in dieser Mitteilung vorgestellt. Kleine Flocken des Biofilms tragenden Acrylharz wurden mit einem sterilen Skalpell abgekratzt, kümmert sich nicht um den Biofilm-Struktur beschädigen. Pinzetten wurden verwendet, um Biofilm aus dem Stahl-Oberflächen zu sammeln. Einmal gesammelt, wurden die Proben fixiert und direkt auf Polysine beschichteten Glasplättchen gelegt. FISH wurde direkt auf diese Folien mit den Sonden m durchgeführtentioned oben. Verschiedene FISH-Protokolle wurden kombiniert und modifiziert werden, um ein neues Protokoll, das einfach zu handhaben war zu schaffen. 5,10,14,15 Anschließend werden die Proben mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie analysiert. Namhafte Konfigurationen 3,4,16,17 visualisiert werden, einschließlich Pilz-style-Formationen und Gruppen von Kokken durch Kanäle durchzogen. Darüber hinaus wurden die bakterielle Zusammensetzung dieser typischen Biofilm Strukturen analysiert und 2D-und 3D-Bilder erstellt.

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Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy

Wir präsentieren ein Protokoll für die strukturelle und Analyse der Zusammensetzung der natürlichen oralen Biofilm aus kieferorthopädischen Apparaturen mit<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung (FISH) und konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM). Oral Biofilm-Proben wurden von palatinal Expander gesammelt, Schaben Acrylharz-abplatzt ihrer Oberfläche und deren Weiterleitung für die molekulare Verarbeitung.

Oral Biofilm Analyse Palatal Expander durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung und konfokale Laser Scanning Mikroskopie

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) of natural heterogeneous biofilm is today facilitated by a comprehensive range of staining techniques, one of ...

oral-biofilm-analysis-palatal-expanders-fluorescence-situ

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JoVE Journal

Medicine

15.9K Aufrufe.  Medical University of Graz. Wir präsentieren ein Protokoll für die strukturelle und Analyse der Zusammensetzung der natürlichen oralen Biofilm aus kieferorthopädischen Apparaturen mit In situ Hybridisierung (FISH) und konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM). Oral Biofilm-Proben wurden von palatinal Expander gesammelt, Schaben Acrylharz-abplatzt ihrer Oberfläche und deren Weiterleitung für die molekulare Verarbeitung.

Serie: Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy

Probe-based Confocal Laser Endomicroscopy of the Urinary Tract: The Technique

Probe-based confocal laser endomicroscopy (CLE) is an emerging optical imaging technology that enables real-time in vivo microscopy of mucosal surfaces during standard endoscopy. With applications currently in the respiratory1 and gastrointestinal tracts,2-6 CLE has also been explored in the urinary tract for bladder cancer diagnosis.7-10 Cellular morphology and tissue microarchitecture can be resolved with micron scale resolution in real time, in addition to dynamic imaging of the normal and pathological vasculature.7
The probe-based CLE system (Cellvizio, Mauna Kea Technologies, France) consists of a reusable fiberoptic imaging probe coupled to a 488 nm laser scanning unit. The imaging probe is inserted in the working channels of standard flexible and rigid endoscopes. An endoscope-based CLE system (Optiscan, Australia), in which the confocal endomicroscopy functionality is integrated onto the endoscope, is also used in the gastrointestinal tract. Given the larger scope diameter, however, application in the urinary tract is currently limited to ex vivo use.11 Confocal image acquisition is done through direct contact of the imaging probe with the target tissue and recorded as video sequences. As in the gastrointestinal tract, endomicroscopy of the urinary tract requires an exogenenous contrast agent&mdash;most commonly fluorescein, which can be administered intravenously or intravesically. Intravesical administration is a well-established method to introduce pharmacological agents locally with minimal systemic toxicity that is unique to the urinary tract. Fluorescein rapidly stains the extracellular matrix and has an established safety profile.12 Imaging probes of various diameters enable compatibility with different caliber endoscopes. To date, 1.4 and 2.6 mm probes have been evaluated with flexible and rigid cystoscopy.10 Recent availability of a &lt; 1 mm imaging probe13 opens up the possibility of CLE in the upper urinary tract during ureteroscopy. Fluorescence cystoscopy (i.e. photodynamic diagnosis) and narrow band imaging are additional endoscope-based optical imaging modalities14 that can be combined with CLE to achieve multimodal imaging of the urinary tract. In the future, CLE may be coupled with molecular contrast agents such as fluorescently labeled peptides15 and antibodies for endoscopic imaging of disease processes with molecular specificity.

Probe-based confocal laser endomicroscopy enables real-time microscopy of the human urinary tract during cystoscopy, providing dynamic, intravital imaging of pathological states such as bladder cancer with cellular resolution. Endomicroscopy may augment the diagnostic accuracy of standard white light endoscopy and provide intraoperative image guidance to improve surgical resection.

Probe-basierte konfokale Laser Endomikroskopie der Harnwege: Die Technik

Probe-based  confocal laser endomicroscopy (CLE) is an emerging optical imaging technology  that enables real-time in vivo microscopy of mucosal surfaces ...

Forschung

Medizin

Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA (Locked Nucleic Acid) probe. The probe was recognized by anti-DIG alkaline phosphatase antibodies and later developed using alkaline phosphatase substrate producing fluorescence signals. Here we utilized miRNA in situ hybridization (MISH) technique to analyze expression of miR-489 in tissues from breast cancer patients. This technique can detect the localization of miRNA of interest in individual tissue samples. This technique can be used to compare the expression of desired miRNA in tumor tissue with that in adjacent normal tissue and to identify the specific structures responsible for expressing this miRNA. This technique can be very useful in answering certain clinical questions, such as role of specific miRNA in the development of cancer. Our results indicate that mammary epithelial cells express significantly higher levels of miR-489 than adjacent tumor cells.

Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

Here we present a protocol to detect miRNA expression in breast cancer patient samples using miRNA in situ hybridization.

Clinicopathological Analyse von miRNA Expression in Mammakarzinomen von miRNA Verwendung<em&gt; In Situ</em&gt; Die Hybridisierung

In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA ...

Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children

Oral biofilm and its molecular analysis provide a basis for investigating various dental research and clinical questions. Knowledge of biofilm composition leads to a better understanding of cariogenic and periopathogenic mechanisms. Microbial changes taking place in the oral cavity during childhood are of interest for several reasons. The evolution of the child oral microbiota and shifts in its composition need to be analyzed further to understand and possibly prevent the onset of disease. At the same time, advanced knowledge of the natural composition of oral biofilm is needed. Early stages of caries-free permanent dentition with healthy gums provide a widely unaffected subgingival habitat that can serve as an in situ baseline for studying features of oral health and disease. Analysis of children's oral biofilm during different stages in life is thus an important theme in the field. Modern molecular analysis methods can provide comprehensive information about the bacterial diversity of such biofilms. To enable microbiota data comparison, it is important to standardize each step in the procedure for molecular data generation. This procedure spans from clinical sampling, Next Generation Sequencing (NGS), bioinformatic data processing, to taxonomic interpretation. One of the most critical factors here is biofilm sampling. Sampling in children is even more challenging in particular due to limited space in subgingival areas. We thus focus on the use of paper points for subgingival sampling. This article provides a detailed protocol for oral biofilm sampling of the subgingival sulcus, the mucosa, and saliva in children.

Changes in the oral microbiome throughout childhood are of growing interest. Comparison of different microbiome studies reveals a lack of standardized sampling protocols. Limited space makes sampling the sound subgingival sulcus of children challenging. Paper point sampling is presented here in detail as the method of choice for this area.

Oralen Biofilm Sampling für Microbiome Analyse bei gesunden Kindern

Oral biofilm and its molecular analysis provide a basis for investigating various dental research and clinical questions. Knowledge of biofilm composition ...

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy include photochemical cross-linking and tissue cross-linking (TXL) methods. Such methods for inducing mechanical tissue property changes are being employed to the cornea in corneal thinning (mechanically weakened) disorders such as keratoconus as well as the sclera in progressive myopia, where thinning and weakening of the posterior sclera occurs and likely contributes to axial elongation. The primary target proteins for such tissue strengthening are fibrillar collagens which constitute the great majority of dry weight proteins in the cornea and sclera. Fortuitously, fibrillar collagens are the main source of second harmonic generation signals in the tissue extracellular space. Therefore, modifications of the collagen proteins, such as those induced through cross-linking therapies, could potentially be detected and quantitated through the use of second harmonic generation microscopy (SHGM). Monitoring SHGM signals through the use of a laser scanning microscopy system coupled with an infrared excitation light source is an exciting modern imaging method that is enjoying widespread usage in the biomedical sciences. Thus, the present study was undertaken in order to evaluate the use of SHGM microscopy as a means to measure induced cross-linking effects in ex vivo rabbit sclera, following an injection of a chemical cross-linking agent into the sub-Tenon&#39;s space (sT), an injection approach that is standard practice for causing ocular anesthesia during ophthalmologic clinical procedures. The chemical cross-linking agent, sodium hydroxymethylglycinate (SMG), is from a class of cosmetic preservatives known as formaldehyde releasing agents (FARs). Scleral changes following reaction with SMG resulted in increases in SHG signals and correlated with shifts in thermal denaturation temperature, a standard method for evaluating induced tissue cross-linking effects.

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia

This protocol describes techniques for evaluating chemical cross-linking of the rabbit sclera using&#160;second harmonic generation imaging and differential scanning calorimetry.

Zweite harmonische Generation Signale in Kaninchen Sklera als Instrument für die Bewertung des therapeutischen Gewebes Vernetzung (TXL) für Kurzsichtigkeit

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy ...

Oral Biofilm Formation on Different Materials for Dental Implants

Dental implants and their prosthetic components are prone to bacterial colonization and biofilm formation. The use of materials that provides low microbial adhesion may reduce the prevalence and progression of peri-implant diseases. In view of the oral environment complexity and oral biofilm heterogeneity, microscopy techniques are needed that can enable a biofilm analysis of the surfaces of teeth and dental materials. This article describes a series of protocols implemented for comparing oral biofilm formation on titanium and ceramic materials for prosthetic abutments, as well as the methods involved in oral biofilms analyses at the morphological and cellular levels. The in situ model to evaluate oral biofilm formation on titanium and zirconia materials for dental prosthesis abutments as described in this study provides a satisfactory preservation of the 48 h biofilm, thereby demonstrating methodological adequacy. Multiphoton microscopy allows the analysis of an area representative of the biofilm formed on the test materials. In addition, the use of fluorophores and the processing of the images using multiphoton microscopy allows the analysis of the bacterial viability in a very heterogeneous population of microorganisms. The preparation of biological specimens for electron microscopy promotes the structural preservation of biofilm, images with good resolution, and no artifacts.

Here, we present a protocol to evaluate oral biofilm formation on titanium and zirconia materials for dental prosthesis abutments, including the analysis of bacterial cells viability and morphological characteristics. An in situ model associated with powerful microscopy techniques is used for the oral biofilm analysis.

Mündliche Biofilmbildung auf unterschiedlichen Materialien für Zahnimplantate

Dental implants and their prosthetic components are prone to bacterial colonization and biofilm formation. The use of materials that provides low ...

Oral Health Assessment by Lay Personnel for Older Adults

Oral health is an often-undervalued contributor to overall health. The literature, however, underscores the myriad of systemic diseases influenced by oral health, including type II diabetes, heart disease, and atherosclerosis. Thus, assessments of oral health, called oral screenings, have a significant role in assessing risk of disease, managing disease, and even improving disease by oral care. Here we present a method to assess oral health quickly and consistently across time. The protocol is simple enough for non-oral health professionals such as students, family, and caregivers. Useful for any age of patient, the method is particularly key for older individuals who are often at risk of inflammation and chronic disease. Components of the method include existing oral health assessment scales and inventories, which are combined to produce a comprehensive assessment of oral health. Thus, oral characteristics assessed include intraoral and extraoral structures, soft and hard tissues, natural and artificial teeth, plaque, oral functions such as swallowing, and the impact this oral health status has on the patient&#39;s quality of life. Advantages of this method include its inclusion of measures and perceptions of both the observer and patient, and its ability to track changes in oral health over time. Results acquired are quantitative totals of questionnaire and oral screening items, which can be summed for an oral health status score. The scores of successive oral screenings can be used to track the progression of oral health across time and guide recommendations for both oral and overall health care.

The goal of this protocol is to enable non-dental professionals to assess oral health status for research or health-screening purposes. Aspects assessed include lips, tongue, soft and hard tissues, natural and artificial teeth, oral cleanliness, plaque, swallowing, and impact of oral health on quality of life.

Mundgesundheitsbewertung durch Laienpersonal für ältere Erwachsene

Oral health is an often-undervalued contributor to overall health. The literature, however, underscores the myriad of systemic diseases influenced by oral ...

Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy

Membrane ruffling is the formation of motile plasma membrane protrusions containing a meshwork of newly polymerized actin filaments. Membrane ruffles may form spontaneously or in response to growth factors, inflammatory cytokines, and phorbol esters. Some of the membrane protrusions may reorganize into circular membrane ruffles that fuse at their distal margins and form cups that close and separate into the cytoplasm as large, heterogeneous vacuoles called macropinosomes. During the process, ruffles trap extracellular fluid and solutes that internalize within macropinosomes. High-resolution scanning electron microscopy (SEM) is a commonly used imaging technique to visualize and quantify membrane ruffle formation, circular protrusions, and closed macropinocytic cups on the cell surface. The following protocol describes the cell culture conditions, stimulation of the membrane ruffle formation in vitro, and how to fix, dehydrate, and prepare cells for imaging using SEM. Quantification of membrane ruffling, data normalization, and stimulators and inhibitors of membrane ruffle formation are also described. This method can help answer key questions about the role of macropinocytosis in physiological and pathological processes, investigate new targets that regulate membrane ruffle formation, and identify yet uncharacterized physiological stimulators as well as novel pharmacological inhibitors of macropinocytosis.

Macropinocytosis is a highly conserved endocytic process initiated by the formation of F-actin-rich sheet-like membrane projections, also known as membrane ruffles. Increased rate of macropinocytotic solute internalization has been implicated in various pathological conditions. This protocol presents a method to quantify membrane ruffle formation in vitro using scanning electron microscopy.

Visualisierung der Membranrüschenbildung mittels Rasterelektronenmikroskopie

Membrane ruffling is the formation of motile plasma membrane protrusions containing a meshwork of newly polymerized actin filaments. Membrane ruffles may ...

Interphase Fluorescence in situ Hybridization of Bone Marrow Smears of Multiple Myeloma

Fluorescence in situ hybridization (FISH) detection is an indispensable method in genetic risk stratification in multiple myeloma (MM), which is one of the most common hematological malignancies. The identifying characteristic of MM is accumulated malignant plasma cells in bone marrow. FISH reports for MM mainly focus on purified or identified clonal plasma cells, rather than all nucleated cells, by sorting with anti-CD138 magnetic beads or marking with cytoplasmic immunoglobulin light chain &#954; or &#955;. Bone marrow interphase nuclei are usually obtained from fresh bone marrow cells. However, satisfactory enrichment of plasma cell specimens requires large amounts of fresh heparin anti-coagulated bone marrow, which cannot be obtained in the case of difficult bone marrow extraction or a bone marrow dry tap. Herein, we establish a novel method to improve the success of FISH detection on stained or unstained bone marrow smears. Bone marrow smears are easier to obtain than anticoagulated bone marrow specimens.

Interphase Fluorescence in situ Hybridization of Bone Marrow Smears of Multiple Myeloma

Here, we present a protocol for improving the success of interphase fluorescence in situ hybridization detection on bone marrow smears from multiple myeloma patients.

Interphasenfluoreszenz-in-situ-Hybridisierung von Knochenmarkabstrichen des Multiplen Myeloms

Fluorescence in situ hybridization (FISH) detection is an indispensable method in genetic risk stratification in multiple myeloma (MM), which is one of ...

Semi-Automated Planimetric Quantification of Dental Plaque Using an Intraoral Fluorescence Camera

Dental plaque accumulation is quantified using clinical indices or, otherwise, the planimetric plaque index (PPI),&#160;which measures the relative area of a tooth that is covered by plaque deposits. Compared to clinical indices, the PPI has a higher discriminatory power, but traditional planimetry is a time-consuming analysis, as the plaque-covered and clean tooth areas have to be determined manually for each image using image-processing software. Here, we present a method for the semi-automated planimetric quantification of dental plaque, which allows for the rapid processing of up to 1,000 images simultaneously. The method exploits the enhanced contrast between disclosed plaque, sound tooth surfaces, and soft tissues in fluorescence images acquired with an intraoral camera. Careful execution of the clinical procedures and accurate image acquisition are crucial steps for the successful semi-automated identification of the plaque-covered areas. The method is suitable for planimetry on sound facial and oral tooth surfaces, on most composite resin restorations, and on teeth with orthodontic brackets, but not on metallic restorations. Compared to traditional PPI recordings, semi-automated planimetry considerably reduces the amount of time spent on the analysis, as well as the subjective human input, thus increasing the reproducibility of planimetric measurements.

This study presents a semi-automated digital image analysis procedure for the planimetric quantification of disclosed dental plaque based on images acquired with an intraoral fluorescence camera. The method allows for the rapid and reliable quantification of dental plaque in the research environment.

Halbautomatische planimetrische Quantifizierung von Zahnbelag mittels intraoraler Fluoreszenzkamera

Dental plaque accumulation is quantified using clinical indices or, otherwise, the planimetric plaque index (PPI),&#160;which measures the relative area ...

Erfassung von Gewebeproben der oralen submukösen Fibrose für die Spatial-Omics-Analyse

Isolation of Cells with Morphological and Spatial Information from Oral Submucous Fibrosis Samples by Laser Capture Microdissection

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina propria and the submucosa are often found on histopathological slides. Epithelial dysplasia, epithelial atrophy, and senescent fibroblasts have been proposed to be associated with the malignant transformation of OSF. However, because of the heterogeneity of potentially malignant oral disorders and oral squamous cell carcinoma, it is difficult to identify the specific molecular mechanisms of malignant transformation in OSF. Here, we present a method to obtain a small number of epithelial or mesenchymal cells carrying morphological data and spatial information by laser capture microdissection on formalin-fixed paraffin-embedded tissue slides. Using a microscope, we can precisely capture microscale (~500 cells) dysplastic or atrophic epithelial tissue and fibrotic subepithelial tissue. The extracted cells can be evaluated by genome or transcriptome sequencing to acquire genomic and transcriptomic data with morphological and spatial information. This approach removes the heterogeneity of bulk OSF tissue sequencing and the interference caused by cells in non-lesioned areas, allowing for precise spatial-omics analysis of OSF tissue.

Autor im Rampenlicht: Die Geheimnisse oraler potenzieller Malignome entschlüsseln 

Laser capture microdissection of oral submucous fibrosis tissues allows for precise extraction of cells from histological regions of interest for the analysis of multi-omics data with morphological and spatial information.

Isolierung von Zellen mit morphologischen und räumlichen Informationen aus oralen submukösen Fibroseproben mittels Laser-Capture-Mikrodissektion

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina ...