Die Autoren danken William Nance (University of Michigan) um Hilfe bei der Formulierung der Biofilmwachstum Protokolle und Johannes Battista (Fluxion, San Francisco, CA) für die Beratung bei technischen Fragen im Zusammenhang mit der BIOFLUX System. (: R21DE018820 zu AHR NIH) und der University of Michigan Anschubfinanzierung, um AHR Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health

Die hier beschriebene Speichelentnahme Protokoll wurde von der University of Michigan Institutional Review Board für Menschenversuch überprüft. HINWEIS: Im Hinblick auf die institutionelle Bewertungen für menschliche Subjekt der Arbeit dieser Art sollten nach vorheriger Vereinbarung und Berechtigungen von der Gasthochschule sammelte werden. Insbesondere in Abhängigkeit von der Institution, IRB oder Ethik Genehmigung Möglicherweise müssen gesucht und genehmigt werden, bevor Speichelentnahme aus Freiwilligen fortfahren. Als Hilfe für die Antragstellung, kann eine nützliche NIH-Algorithmus / Grafik hier: <a href="http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf">http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf</a> 1. Vorbereitung der Pooled Speichel für die Verwendung als umwelt Germane Wachstumsmedium <ol><li> Rekrutieren&gt; 5 Personen für Speichel Spende. Keine identifizierenden Informationen Nehmen Sie nicht, sicherzustellen, dass keine individuals wird Speichel spenden, wenn sie krank sind, oder haben orale Antibiotika in den letzten 3 Monaten getroffen haben oder Nahrung oder Flüssigkeit verbraucht wird, mit Ausnahme von Wasser, in der vorhergehenden 2 Stunden vor der Spende. </li><li> Sammeln Speichel in 50 ml Kunststoffröhrchen. Bündeln die gesammelten Speichel in einen Kunststoffbecher, halten sie auf Eis. Verwenden Sie keine Glas als Polymere im Speichel wird auf die inneren Glasoberflächen haften. </li><li> Fügen Dithiothreitol (DTT) bis zu einer Endkonzentration von 2,5 mM aus einer 100-fach Lager. (Auf in Einweg-Aliquots bei -20 froren ° C). Rühre 10 Minuten in einem Kunststoffbecher auf Eis. </li><li> Um Partikel zu entfernen, Zentrifuge die gepoolte Speichel für 30 min bei 17.500 x g. </li><li> Verdünne den Speichel mit 3 Volumina dH 2 O auf ein Viertel eingeengt Speichel zu ergeben. </li><li> Filter-sterilisiert Speichel mit 0,22 um Polyethersulfon (PES), geringe Proteinbindung Filter. Verwenden Sie Filter mit großer Oberfläche, oder verwenden Sie mehrere Filter mit kleinen Flächen. Halten Speichel in einKunststoffbehälter auf Eis und filtert. </li><li> Frieren Sie das gepoolte Speichel bei -80 &#160; ° C in 50 ml Plastikröhrchen, bis sie benötigt, um Bakterien wachsen. Jeder Kunststoffrohr ist nur für eine Verwendung und sollte nicht mehr als 35 ml enthalten, da jeder Mikrofluidik und kann maximal 1,2 ml (1,2 ml x 24 Wells = 28,8 ml) und Raum wird in jedem Röhrchen benötigt als Speichel beim Gefrieren ausdehnt. </li><li> Für den Einsatz, Tauwetter die gepoolten Speichel bei Raumtemperatur. Einmal aufgetaut, Filter-Sterilisierung wieder (0,22 um Polyethersulfon, geringe Proteinbindung Filter, um alle Niederschläge zu entfernen). </li></ol> 2. Herstellung der Pooled Speichel für die Verwendung als Inokulum <ol><li> Rekrutieren&gt; 5 Personen für Speichel Spende. Keine identifizierenden Informationen Nehmen Sie nicht, sicherzustellen, dass keine Personen werden Speichel spenden, wenn sie krank sind, haben orale Antibiotika in den letzten 3 Monaten in den letzten 2 Stunden vor der Spende entnommen oder haben Nahrung oder Flüssigkeit verbraucht wird, mit Ausnahme von Wasser,. Sammeln samples über 30 min. </li><li> Sammeln Sie Speichel in 50 ml Plastikröhrchen bei Raumtemperatur und bündeln die gesammelten Speichel in einen Kunststoffbecher bei Raumtemperatur. </li><li> Verdünnen gepoolte Speichel mit autoklaviertem allgemeinen Reagenzqualität Glycerin, eine Aktie mit einem letzten Quote von 25% Glycerin, 75% zellhaltigen Speichel [CCS] ergeben. </li><li> Gefriert Speichel bei -80 ° C in 3 ml Einweg Aliquoten bis benötigt. </li><li> Wenn erforderlich, um die Mikrofluidsystem zu inokulieren werden Aliquots bei Raumtemperatur, bevor es in dem Mikrofluidsystem, wie in Schritt 3 des Protokolls unten beschrieben pipettiert taut und vorsichtig auf einem Vortexer für 5 s geschüttelt. </li></ol> 3. Wachstum von Oral Multi-Spezies-Biofilme <ol><li> CFS Vorbehandlungs <ol><li> Erste Schicht die BIOFLUX mikrofluidischen Kanälen mit CFS. 100 l CFS zu jeder Steckdose gut. Mit dem BIOFLUX Steuerungssoftware, wählen Sie &quot;Manuell&quot; und stellen Sie Flow aus Kanälen &quot;B1-B24&quot; that zu verwenden. </li><li> Als nächstes setzen Scher bis 1,0 dyn / cm² und starten Fluss für 2 min bei Raumtemperatur, um eine homogene Verteilung der CFS gesamten Kanal zu gewährleisten. Sorgen Sie für eine Flüssigkeit in jedem Eingangskanal, um zu überprüfen, dass CFS floss durch alle Kanäle gleichmäßig. </li><li> Inkubieren Platte bei Raumtemperatur für 20 min. </li><li> Entfernen Sie den CFS / Vorbehandlung Lösung, die in den Austrittsbohrungen bleibt und Transfer zu den Einlassbohrungen. Das Gesamtvolumen von 100 ul wird dazu dienen, gegen die Druckwaage mit dem Inokulum aus dem Auslaß angewendet. </li></ol></li><li> Impfung <ol><li> Zu jeder Steckdose gut, fügen Sie 100 ul der CCS-Impfstoff. Setzen Sie den mikrofluidischen Platte auf der Wärmeplatte (Temperatur auf 37 ° C eingestellt ist), wählen Sie Anleitung in der Steuerungssoftware und stellen Sie Flow aus der Steckdose Brunnen zu den Einlassbohrungen (reverse) bei 1,0 dyn / cm² für genau 6 Sek. </li><li> Inkubieren der mikrofluidischen Platte bei 37 ° C für 40 min, damitfür die anfängliche Haftfähigkeit und das Wachstum der Bakterien in dem Inokulum. </li></ol></li><li> Übernachtung Wachstum <ol><li> Für die inokulierten Kanäle verwendet absaugen Abfall Inokulum aus jeder der Austrittsbohrungen. Sie können bis zu 1 ml Gesamtvolumen von CFS in jede der Einlaßbohrungen (kann auf der Oberseite des vorhandenen CFS durchgeführt werden). </li><li> Inkubieren Sie die Mikrofluid-Platte bei 37 ° C, wählen Sie die manuelle und setzen das Programm bei 0,2 dyn / cm² für 20 Stunden laufen. </li></ol></li><li> Stain Vorwäsche <ol><li> Aspirieren von Fluid aus der Eintritts- und Austrittsbohrungen und mit 100 ul PBS (pH 7,4) zu jeder der Einlassbohrungen. Durchfluss für 20 min bei 0,2 dyn / cm². </li></ol></li><li> Stain Mischung zusätzlich <ol><li> Für die Lebensfähigkeit der Zellen Färbung machen 100 ul Flecken Mischung für jeden Kanal, gefärbt werden. Insbesondere hinzufügen 3 ul SYTO 9 und 3 ul Propidiumiodid pro ml PBS mit kommerziellen Lebensfähigkeit der Zellen Färbekit wie Live / Dead. Dies erzeugteine Färbelösung, enthaltend 10 uM SYTO 9 und 60 &amp; mgr; M Propidiumiodid. </li><li> Saugt den verbleibenden PBS von den Eintrittsbohrungen und dann mit 100 ul der Zelllebensfähigkeit Flecken Mischung auf jedes Einlaß gut. Soll bei 0,2 dyn / cm 2 von der Einlassfluss und führen Sie die Lösung für 45 Minuten bei Raumtemperatur Steckdose. </li></ol></li><li> Post-Färbung Wasch <ol><li> Saugt den restlichen Flecken in jeder der Einlaßbohrungen und mit 100 ul PBS in jedes Einlaß gut. Soll bei 0,2 dyn / cm² von Einlassstrom und starten Sie das PBS-Lösung für 20 Minuten bei Raumtemperatur Steckdose, um überschüssiges Fleck zu entfernen. </li></ol></li></ol> 4. Bildsammlung, 3D-Rendering, und Bildanalyse <ol><li> Verwenden Sie ein umgekehrtes konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) zur Bild Biofilm Daten aus dem mikrofluidischen System zu sammeln. Stellen Sie sicher, dass die CLSM der Lage ist, das Gewicht des BIOFLUX Platte, die 150 g erreichen können, zu widerstehen. HINWEIS: Angesichts der Groschennsions der mikrofluidischen Kanälen, die Notwendigkeit einer Sensibilität für Biofilm-Struktur zu erkennen, und die Anforderungen zu erkennen Fluoreszenzsignal von unterschiedlicher Intensität, passen die CLSM mit einer 40X 1,25 NA Objektiv oder eine ähnliche optische Qualität, Vergrößerung und numerische Apertur. </li><li> Vereinheitlichung der Emissionserfassung Tore mit Verstärkungs- und Offset-Messungen konstant gehalten wird. Stellen Sie sicher, dass die Laserleistung 25% nicht überschreiten, da dies zu Fotobleichen führen. </li><li> Konvertieren CLSM-Dateien aus dem L eica Ich mage F ile Typ (LIF) zu OME (O pen M icroscopy E nvironment) Dateityp. Dies ermöglicht eine größere Leichtigkeit des Zugangs und Kompatibilität zwischen Softwareprogramme. Verwenden Sie handelsübliche Software wie Imaris, Dateien auf diese Art umzuwandeln. </li></ol> 3D-Rendering für Bilder / Abbildungen <ol start="4"><li> Einmal auf OME-Format konvertiert, eine handelsübliche Software wie Imaris um die Bilder machenin 3D. Führen Sie dies durch eine Kombination von &quot;Easy3D&quot; und &quot;übertreffen&quot; Optionen. HINWEIS: Die Liebe zum Hintergrundsignal und Schwellen sollte vorgenommen werden. Die Histogramm-Funktion in Imaris kann die Sammlung Bereich zu erhalten, und dies sollte konstant gehalten zwischen den Bildern, die analysiert werden. </li><li> Bilder mit der Funktion &quot;Momentaufnahme&quot; zu sparen und sich sorgfältig überlegen, Bildauflösung vor dem Speichern Dateitypen. </li><li> Montieren Sie Bilder in Zahlen mit Bildbearbeitungssoftware wie Corel Draw oder Adobe Illustrator. </li></ol> 3D-Bildanalyse für Grafiken und Tabellen <ol start="7"><li> Nutzen Sie kostenlos verfügbare ImageJ 23 und COMSTAT / COMSTAT2 38 für die Bildanalyse. Laden Sie die Pakete von http://rsb.info.nih.gov/ij/ und http://comstat.dk/ auf. Haben die letzte Java-Update installiert. HINWEIS: Die Software-Plattform Java muss installiert werden Prior die Verwendung der Bildanalyse-Software. <ol><li> Verwenden Sie die ImageJ Software mit COMSTAT2 Plugin, um die OME-Dateien für jedes Bild in Biofilm &quot;Hyperstack&quot; -Modus und Ausblick mit &quot;aufgeteilt Kanäle&quot; zu importieren. </li><li> Individuell analysieren die beiden Kanäle (rot / Propidiumiodid / tot Befinden Kanal 0, grün / SYTO-9 / LIVE-Sein Kanal 1) mit dem &quot;Histogramm&quot; Funktion der ImageJ. Diese Funktion führt die Gesamtzahl der Pixel von 8-Bit-OME Dateien (als &quot;count&quot; dargestellt) an jeder der Farbintensität von 0 bis 255 (als &quot;Wert&quot; gezeigt), wobei 0 die Pixel ohne Signal (Hintergrund) und 255 Befinden Pixel mit kompletten Signalsättigung. </li><li> Exportieren Sie die Daten in eine Tabellenkalkulation und zu standardisieren, alle Signalwerte durch Gewichtung der einzelnen Pixel durch die entsprechende Signalintensität. Dies wird durch Multiplizieren der Gesamtzahl bei einer gegebenen Signalintensität durch den numerischen Wert von 8 Bit (0-255) der genannten Signalintensität durchgeführt wird. </li><li> Zusammenfassend alle gewichteten Werte, von 0 bis 255, für beide Kanäle für jeden Biofilm Bild aufgenommen. Nehmen Sie die Summe der gewichteten Werte für beide Kanäle, um die prozentuale Gesamtsignal aus einem der Kanäle zu bestimmen. Tun dies, um das relative Verhältnis oder Prozent roten und Prozent grünes Signal (dh den Prozentsatz &quot;tot&quot; und die prozentuale &quot;LIVE&quot; für jede Behandlung) zu bestimmen. </li><li> Statistische Analysen durchführen, beispielsweise mit zweiseitigen Student-T-Test für ungleiche Varianz modifiziert. Werte von p &lt;0,05 werden als signifikant und die Werte von p &lt;0,01 sind als sehr wichtig. </li></ol></li></ol> 5. Ernten Biofilm-Zellen für die Kultur-unabhängige Analyse <ol start="1"><li> Entfernen Sie alle verbracht und unbenutzt Speichel von Ein- und Auslaufbrunnen. Mit 1 ml sterilem destilliertem Wasser dreimal Waschen Sie die Vertiefungen. </li><li> 100 l sterilem destilliertem Wasser zu den Einlassbohrungen und mit Hilfe des Software-Steuerschnittstelle, übergeben diesteriles destilliertes Wasser nach vorne durch die Kanäle auf&gt; 8,0 dyn / cm 2 (Durchfluss&gt; 745 &amp; mgr; l / h, Scherung von 800 s -1) für mindestens 5 min. Wiederholen in umgekehrter Richtung für mindestens 5 min und wiederholen Sie die Forward- und Reverse Waschschritt Prozess. </li><li> Prüfen Sie durch Licht oder durch Epifluoreszenzmikroskopie (wenn Zellen wurden gefärbt / beschriftet) zur gründlichen Biofilmentfernung (Abbildung 2). Sammeln Sie die 100 ul Zellsuspension und bei -80 ° C für die kulturunabhängige Analyse. Eine kostengünstige Analyse von Community-Zusammensetzung kann durch Verwendung bakterieller Tag-kodierte FLX Amplikon Pyrosequenzierung (bTEFAP) mit Hilfe der in Nance et al Ansatz erreicht werden. 20 </li></ol>

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+bacterial+infections+through+culture-independent+approaches.">Studying bacterial infections through culture-independent approaches.</a> Journal of medical microbiology. 58 (11), 1401-1418 (2009).</li><li>Socransky, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiota+of+the+gingival+crevice+area+of+man.+I.+Total+microscopic+and+viable+counts+and+counts+of+specific+organisms.">The microbiota of the gingival crevice area of man. I. Total microscopic and viable counts and counts of specific organisms.</a> Archives of oral biology. 8, 275-280 (1963).</li><li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT.">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146 (10), 2395-2407 (2000).</li><li>Nobbs, A. H., Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+adherence+and+colonization.+Microbiology+and+molecular+biology+reviews).">Streptococcus adherence and colonization. Microbiology and molecular biology reviews).</a> MMBR. 73 (3), 407-450 (2009).</li><li>Hope, C. K., Clements, D., Wilson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+spatial+distribution+of+viable+and+nonviable+bacteria+in+hydrated+microcosm+dental+plaques+by+viability+profiling.">Determining the spatial distribution of viable and nonviable bacteria in hydrated microcosm dental plaques by viability profiling.</a> Journal of applied microbiology. 93 (3), 448-455 (2002).</li><li>Adams, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+laboratory+model+to+assess+the+removal+of+biofilm+from+interproximal+spaces+by+powered+tooth+brushing.">Development of a laboratory model to assess the removal of biofilm from interproximal spaces by powered tooth brushing.</a> American journal of dentistry Spec No 12B-17B. 15, 12-17 (2002).</li><li>Ledder, R. G., McBain, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+comparison+of+dentifrice+formulations+in+three+distinct+oral+microbiotas.">An in vitro comparison of dentifrice formulations in three distinct oral microbiotas.</a> Archives of oral biology. 57 (2), 139-147 (2012).</li></ol>

A. H. R. and N.S.J. have received research awards from a variety of sources such as the National Institutes of Health (NIDCR), Colgate-Palmolive (Piscataway, NJ) and the Society for Applied Microbiology to fund research studies in their lab over the past five years. All other authors: none to declare.

Diese Methodenpapier hebt die grundlegenden Schritte zur Einrichtung erforderlich und führen Sie ein Mikrofluidsystem in einer Weise, die für die Entwicklung von oralen Multi-Spezies-Biofilme aus gepoolten menschlichen Speichel abgeleitet und in filtersterilisiert 25% gepoolten menschlichen Speichel wachsen lassen. Ansätze, um den Biofilm zu charakterisieren sind, gegeben, aber es sollte daran erinnert werden, dass diese beschriebenen Ansätze modifizierbar sind und zusätzliche Technologien, wie beispielsweise Fleck...

<html> Biofilme sind architektonisch komplexe Gemeinschaften von Bakterien, die auf Oberflächen 1 zusammengefasst sind. Diese Gemeinschaften enthalten typischerweise zahlreiche Arten, die miteinander innerhalb des Biofilms 2 interagieren. Oral Biofilme, die optisch auffälliger als Zahnbelag, sind ein ständiges Problem bei Menschen und ihre unkontrollierte Entwicklung führt zur Erzeugung von taxonomisch diverse Mehrartengemeinschaften 3. Die Komponente Bakterien dieser verschiedenen Gemeinden können bis zu 1.000 Mal resistenter gegen Antibiotika als ihre freischwebenden (Plankton) Gegen 4-6 sein. Die Nichtbeachtung dieser mündlichen Biofilm Gemeinden, die Karies und Parodontitis verursachen können, zu behandeln, hat zu einer erheblichen Belastung der öffentlichen Gesundheit ergeben: mehr als 500 Millionen Besuche in der Zahnarztpraxis pro Jahr in den USA, und ein etwa 108 Milliarden Dollar zur Behandlung oder Vorbeugung von Zahnfleisch Erkrankung und Karies 7. Inhalt &quot;&gt;&quot; Während viele Mikrobiologen befürworten Studium mikrobiellen Verhalten unter natürlichen Bedingungen, einige von ihnen tun. Das ist, weil ihre Moral für die Überwindung der Schwierigkeiten wird ständig von den attraktiven einfache Arbeit mit Laborkulturen. &quot;-Smith 8 geschwächt. Derzeit wird oral Biofilm-Forschung mit einer Vielzahl von in vivo und in vitro Ansätzen durchgeführt, benachteiligt jede mit ihren eigenen Vorteile und 9,10. In-vitro-Ansätze verwenden oft Modell Biofilmsystemen, die relativ einfach zu installieren sind, aber klinische fehlt / realen Welt Relevanz 10,11. In-vivo-Ansätze bei Tiermodellsysteme, die bestimmte Aspekte der menschlichen Mundraum aufgrund der Unterschiede in Anatomie, Physiologie, Mikrobiologie und Immunologie zwischen Tieren vermehren kann, aber wiederum leiden unter Einschränkungen und Menschen 12 der Regel verlassen, 13. Es sollte angemerkt werden, dass die orale Biofilmekann auch auf Email-Oberflächen in einem Stent innerhalb der Mündungen Probanden gehalten entwickelt werden, aber dieser Ansatz ist derzeit relativ aufwendig und arbeitsintensiv, 14,15. Letztlich werden neue Wirkstoffe und Technologien zur Verbesserung der Gesundheitsversorgung Mund beim Menschen unter kontrollierten klinischen Studie Bedingungen 11 getestet. Derzeit ist eine häufig verwendete Vorgehensweise zur Ermittlung und Bewertung neuer Zahnpflegemittel, zuerst durchführen Laborstudien zur möglichen Wirksamkeit zu erkennen, und führen Sie dann Tierversuche und &quot;Feldversuche&quot;, die Ärzte verwenden, um den Erfolg der Technologie 9 auszuwerten, 16,17. Leider neigen Laborstudien an Modellsystemen, die einen großen Platzbedarf besetzen verlassen, sind technologisch anspruchsvolle zu bedienen, und enthalten oft vereinfacht Gemeinden eine oder höchstens einige wenige Arten, potenzielle reale Bedeutung 10,18 abzuleiten. Da Zahnbelag Biofilmen enthalten mehrere Arten und Form in einem komplEx fließt Speichelmilieu, die Entwicklung von Biofilmen, die man selbst oder einige Arten in künstlichen Medien ist unwahrscheinlich, dass Gemeinden, die in einer ähnlichen Weise wie in einem realen Szenario 10,19 verhalten zu generieren. Um die Zeit, Kosten, Ausbildungsanforderungen, und die Armen Repräsentativität der Labormodell Biofilmsystemen im Vergleich zur realen Umgebung anzusprechen, haben wir vor kurzem eine Hochdurchsatz und umwelt Germane Biofilmsystem 20 (Abbildung 1). Diese Systeme profitieren von der Verwendung von zellfreien gepoolten menschlichen Speichel (CFS) als Medium und unbehandeltem menschlichem Mischbakterienzellen enthaltenden Speichel (CCS) als Inokulum. Einzigartig ist, verbindet das System auch Mikrofluidik-Technologie, einem konfokalen Laser Scanning Mikroskop und kulturunabhängige bakterielle Vielfalt Analysetechnik. Somit ist die Modellsystem umwelt Germane (mit Speichel als ein Inokulum zum Multispezies Biofilme bei 37 wachsen ° C in filtersterilisiert fließtSpeichel) und die orale Biofilme enthalten Arten (einschließlich Streptococcus, Neisseria, Veillonella und Porphyromonas-Spezies) in Häufigkeiten, die den in frühen supragingivale Plaque 20 gefunden. Wenn man bedenkt, dass diese Arbeit beschreibt den Einsatz des neu entwickelten Modellsystem, muss besonderes Augenmerk auf die Zusammenlegung der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) Mikrofluidik und kulturunabhängige Vielfalt Analysetechnologien geben. Die Vereinigung dieser Technologien von unserer Arbeitsgruppe beabsichtigt war und nicht nur fügt eine Hochdurchsatzfähigkeit des neu entwickelten Modellsystem, sondern erlaubt auch die Fragen, die gestellt werden, die nicht leicht adressiert werden, bevor mit anderen Systemen werden. Erstens hat CLSM deutliche Vorteile gegenüber traditionellen Mikroskopie, wie es für die dreidimensionale Analyse von Biofilmen. Oft unbeachtet, dies ist äußerst wichtig, da Biofilme heterogene Witzh bezüglich Artenzusammensetzung und räumliche Lage sowie die physiologischen Bedingungen an unterschiedlichen räumlichen Stellen innerhalb des Biofilms 6,21 auferlegt. Zusammen mit dreidimensionalen Rendering-Software und Bildanalyse-Software, die Biofilmarchitektur räumlichen Beziehungen zwischen Komponentenarten, und das Ausmaß der antimikrobiellen Abtötung analysiert 22-24 werden. Solche Fähigkeiten sind nicht mit Standard-Durchlicht oder Epifluoreszenzmikroskopie. Weiter hat Mikrofluidik insbesondere Aufmerksamkeit erregt auf dem Gebiet der Mikrobiologie es ermöglicht die Untersuchung von Biofilmen unter sorgfältig kontrollierten Bedingungen (Durchfluss, Temperatur, pH, etc.) und erfordert nur kleine Flüssigkeitsvolumina 25-27. Als Vergleichspunkt, Aufwachsen einer oralen Biofilm im menschlichen Speichel innerhalb einer Durchflußzelle Modellsystem (ein System, die wohl als die Hauptstütze Modell für viele oral Biofilm Studien wird) für 20 h bei einer ähnlichen Strömungsrate und Scher wie diejenige erreichtin einem mikrofluidischen System erfordert mindestens 200 ml, im Gegensatz zu 800 &amp; mgr; l in der mikrofluidischen Vorrichtung 28-31. Auf diese Weise ermöglicht ein Mikrofluidik-Modell Biofilmsystem das Studium der Menge begrenzte Material unter definierten Bedingungen. Schließlich hat Pyrosequenzierungstechnologie im letzten Jahrzehnt optimiert, dass nur geringe Mengen an Material erfordern, um eine Gemeinschaft Analyse durchzuführen, und ist vielseitig genug, um Tiefe von der Ablaufsteuerung, um die Identität auch seltene Biofilmspezies erhalten. Der Einsatz dieser Technologie, wie bakterielle Tag-kodierte FLX Amplikon Pyrosequenzierung (bTEFAP) hat für relevante Fragen der Ökologie von Biofilmen dürfen angesprochen 32,33 werden. Solche Fragen durchdrungen Schwierigkeiten in der Vergangenheit, wenn Pyrosequenzierung war nicht verfügbar, da der benötigten Zeit und Plasmid-Bibliotheken und die komplexen technischen und Analyseschritte erforderlich, um Daten abzuleiten 33,34 verursachten Kosten. Natürlich ist ein großer Vorteil, mit kulturunabhängige apAnsätze, wie Pyrosequenzierung, ist, dass die Bakterienspezies, die nicht isoliert innerhalb der üblichen Labormedien (dh lebensfähigen, aber nicht-kultivierbaren Arten) gezüchtet werden können, können gezüchtet und identifiziert innerhalb der Modellsystem und ihre relative Häufigkeit in der Community quantitativ 35, 36 . Um Sicht bereits 1963 hinzufügen schätzte die späten Sigmund Socransky dass etwa 50% der Bakterien im Material von der menschlichen Mund Sulkus isoliert nicht mit Laborwachstumsbedingungen 37 kultiviert werden. Das Ziel dieser Arbeit ist es, Methoden Beschreibung des Ansatzes zur oralen Multi-Spezies-Biofilmen in einem handelsüblichen Mikrofluid (BIOFLUX) Systems unter sich bilden: (i) Bedingungen repräsentativ für die menschliche Mundhöhle und (ii) mit einem Artenzusammensetzung und Fülle, ist vergleichbar mit supragingivale Plaque. Darüber hinaus verwenden sowohl Freeware und kommerzielle Software, markieren wir, wie Grund BiofilmArchitektur Maßnahmen von CLSM Daten abgeleitet werden, wobei der Schwerpunkt auf Ansätze zur Biofilm Biomasse, Rauheit, und Lebensfähigkeit zu quantifizieren (basierend auf Live / Dead-Färbung). Schließlich werden die erforderlich ist, um Biofilm Material für Vielfalt Analyse bTEFAP ernten Schritten beschrieben.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="951">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:525px;">SUPPLIES AND EQUIPMENT</td>
			<td style="width:224px;">AVAILABLE FROM COMPANY</td>
			<td style="width:203px;">CATALOG NUMBER</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49D</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sorval ultracentrifuge&#160; (SS-34 compatible)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>Unit-dependent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific SS-34 Rotor&#160;</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>28-020</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water</td>
			<td>Thermo&#160; Scientific Inc</td>
			<td>23-290-065</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile.</td>
			<td>VWR</td>
			<td>73520-986&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>NC0542269</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BioFlux microfluidic system</td>
			<td>Fluxion</td>
			<td>Bioflux 200 system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflux 24-channel plate</td>
			<td>Fluxion</td>
			<td>910-0004</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>10010023</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LIVE/DEAD stain (Invitrogen)&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L7012</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>SPE or eqivalent system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epifluorescence Microscope</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pyrosequencing facilities</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Decon SaniHol 70 Ethanol Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-122</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Ultra Low Temperature Freezer -80&#176;C</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tips (20, 200, and 1000uL)</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1000uL)</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SOFTWARE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflux dedicated software</td>
			<td>Bioflux</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leica SPE</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImageJ</td>
			<td>Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">COMSTAT/COMSTAT 2</td>
			<td colspan="2">Freeware (http://www.comstat.dk/)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of a high-throughput in vitro microfluidic system to develop oral multi-species biofilms

Es gibt nur wenige Hochdurch in vitro-Systeme, die die Entwicklung von Multi-Spezies in Biofilmen zahlreiche Arten üblicherweise in in vivo oral Biofilmen detektiert enthalten erleichtern. Darüber hinaus ist ein System, das natürliche humane Speichel verwendet als Nährstoffquelle, statt künstlicher Medien, um die Expression von zellulären und Biofilm-spezifische Eigenschaften, die in vivo nachahmen Gemeinschaften unterstützt besonders wünschenswert. Wir beschreiben ein Verfahren für die Entwicklung von Mehrarten oralen Biofilmen, die vergleichbar sind, mit Bezug auf die Artenzusammensetzung, um Zahnbelag supragingivalen, unter ähnlichen Bedingungen wie die menschliche Mundhöhle. Genauer gesagt, wird diese Methoden Artikel beschreiben, wie ein im Handel erhältlicher Mikrofluidsystem kann angepasst werden, um die Entwicklung von Multi-Spezies orale Biofilme abgeleitet erleichtern und innerhalb gepoolt Speichel gezüchtet. Darüber hinaus kann eine Beschreibung, wie das System in Verbindung mit einem confoca verwendet werdenl Laserabtastmikroskop zur 3-D Biofilm Rekonstruktionen für architektonische und Lebensfähigkeit Analysen erzeugen vorgestellt. Angesichts des breiten Vielfalt von Mikroorganismen, die in Biofilmen in der mikrofluidischen Systems (einschließlich Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella und Porphyromonas) wachsen, wird ein Protokoll auch beschreiben, wie Sie die Biofilm-Zellen für die weitere Subkultur oder DNA-Extraktion und Analyse Ernte vorgelegt werden. Die Grenzen sowohl der Mikrofluidik Biofilm System und die aktuellen State-of-the-art Datenanalysen angesprochen. Letztlich ist es vorstellbar, dass dieser Artikel eine Basistechnik, die die Untersuchung der oralen Biofilmen verbessern und helfen bei der Entwicklung von weiteren Technologien, die mit dem Mikrofluid-Plattform integriert werden können, bereitzustellen.

3D-Rendering von Biofilmen Repräsentative Ergebnisse sind in 3 gezeigt. Ein nützliches Werkzeug in Imaris Software ist die Möglichkeit, jede Scheibe des gesammelten Biofilm Stapel zu untersuchen und zu kombinieren, um dreidimensionale Rekonstruktionen zu erstellen. Zusätzlich können künstliche Abschattungseffekte hinzugefügt werden visuell zur Interpretation dreidimensionalen Strukturen. Die erbrachten Biofilmen kann in jede Richtung mit unte...

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Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Das Ziel dieser Verfahren ist es, die Papier Verwendung eines mikrofluidischen Systems für die Entwicklung von Mehrarten Biofilmen, die typischerweise bei humanen supragingivale Plaque identifiziert Arten enthalten beschreiben. Methoden, um die Biofilmarchitektur Biofilm Lebensfähigkeit und ein Konzept für die Ernte Biofilm für kulturabhängig oder kulturunabhängige Analysen hervorgehoben zu beschreiben.

Verwendung eines Hochdurchsatz-<em&gt; In-vitro-</em&gt; Mikrofluidik-System auf die mündliche Multi-Spezies-Biofilme entwickeln

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

use-high-throughput-vitro-microfluidic-system-to-develop-oral-multi

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

13.4K Aufrufe.  The University of Michigan.  Das Ziel dieser Verfahren ist es, die Papier Verwendung eines mikrofluidischen Systems für die Entwicklung von Mehrarten Biofilmen, die typischerweise bei humanen supragingivale Plaque identifiziert Arten enthalten beschreiben. Methoden, um die Biofilmarchitektur Biofilm Lebensfähigkeit und ein Konzept für die Ernte Biofilm für kulturabhängig oder kulturunabhängige Analysen hervorgehoben zu beschreiben. 

Serie: Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in vitro. Nutrients delivered by vasculature fail to reach all parts of tumors, giving rise to heterogeneous microenvironments consisting of viable, quiescent and necrotic cell types. Many cancer drugs fail to effectively penetrate and treat all types of cells because of this heterogeneity. Monolayers of cancer cells do not mimic this heterogeneity, making it difficult to test cancer drugs with a suitable in vitro model. Our microfluidic devices were fabricated out of PDMS using soft lithography. Multicellular tumor spheroids, formed by the hanging drop method, were inserted and constrained into rectangular chambers on the device and maintained with continuous medium perfusion on one side. The rectangular shape of chambers on the device created linear gradients within tissue. Fluorescent stains were used to quantify the variability in apoptosis within tissue. Tumors on the device were treated with the fluorescent chemotherapeutic drug doxorubicin, time-lapse microscopy was used to monitor its diffusion into tissue, and the effective diffusion coefficient was estimated. The hanging drop method allowed quick formation of uniform spheroids from several cancer cell lines. The device enabled growth of spheroids for up to 3 days. Cells in proximity of flowing medium were minimally apoptotic and those far from the channel were more apoptotic, thereby accurately mimicking regions in tumors adjacent to blood vessels. The estimated value of the doxorubicin diffusion coefficient agreed with a previously reported value in human breast cancer. Because the penetration and retention of drugs in solid tumors affects their efficacy, we believe that this device is an important tool in understanding the behavior of drugs, and developing new cancer therapeutics.

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We present the procedure for fabrication and operation of a microfluidic device that recreates heterogeneous tumor microenvironments in vitro. The variability in apoptosis within tumor tissue was quantified using fluorescent stains and the effective diffusion coefficient of the chemotherapeutic drug doxorubicin into tumor tissue was evaluated.

Mikrofluidik-Vorrichtung für die Neuerstellung eines Tumor-Mikroumgebung<em&gt; In Vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Forschung

Biotechnik

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

High-throughput Protein Expression Generator mit einem mikrofluidischen Plattform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging techniques.
The one-time use packaging technique employs UV-based and temperature curing epoxies to connect microtubes to access holes, wire-bonding for integrated circuit connections, and silver epoxy for electrical connections. This method is based on a robust assembly technique that can support relatively high pressure close to 1 psi and does not need any support to strengthen the microfluidic architecture.
Reusable packaging techniques consist of PDMS-based microtube interconnectors and anisotropic adhesive films for electrical connections. These devices are more sensitive and fragile. Consequently, Plexiglas support is added to the microfluidic structure to improve the electrical contact when anisotropic adhesive films are used, and also to strengthen the microfluidic architecture. In addition, a micromanipulator is needed to maintain tubes while using a thin PDMS layer to connect them to the access holes. Different PDMS layer thicknesses, ranging from 0.45-3 mm, are tested to compare the best adherence versus injection rates. Applied injection rates are varied from 50-300 &#956;l/hr for 0.45-3 mm PDMS layers, respectively. These techniques are mainly applicable for low-pressure applications. However, they can be extended for high-pressure ones through plasma-oxygen process to permanently seal the PDMS to glass substrates. The main advantage of this technique, besides the fact that it is reusable, consists of keeping the device observable when the microchannel length is very short (in the range of 3 mm or lower).

In this article we describe different techniques for microfluidic rapid prototyping platforms. The proposed techniques are based on ultraviolet (UV) sensitive and temperature curing epoxies, polydimethylsiloxane (PDMS) based tubing, wire-bonding, and anisotropic adhesive films. The assembling procedures presented are developed for both one-time use devices as well as reusable microfluidic systems.

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of interest following intravenous or intraarterial infusion. Consequently, increasing cell homing is currently studied as a strategy to improve cell therapy. Cell rolling on the vascular endothelium is an important step in the process of cell homing and can be probed in-vitro using a parallel plate flow chamber (PPFC). However, this is an extremely tedious, low throughput assay, with poorly controlled flow conditions. Instead, we used a multi-well plate microfluidic system that enables study of cellular rolling properties in a higher throughput under precisely controlled, physiologically relevant shear flow1,2. In this paper, we show how the rolling properties of HL-60 (human promyelocytic leukemia) cells on P- and E-selectin-coated surfaces as well as on cell monolayer-coated surfaces can be readily examined. To better simulate inflammatory conditions, the microfluidic channel surface was coated with endothelial cells (ECs), which were then activated with tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), significantly increasing interactions with HL-60 cells under dynamic conditions. The enhanced throughput and integrated multi-parameter software analysis platform, that permits rapid analysis of parameters such as rolling velocities and rolling path, are important advantages for assessing cell rolling properties in-vitro. Allowing rapid and accurate analysis of engineering approaches designed to impact cell rolling and homing, this platform may help advance exogenous cell-based therapy.

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

This study used a multi-well plate microfluidic system, significantly increasing throughput of cell rolling studies under physiologically relevant shear flow. Given the importance of cell rolling in the multi-step cell homing cascade and the importance of cell homing following systemic delivery of exogenous populations of cells in patients, this system offers potential as a screening platform to improve cell-based therapy.

Systematische Analyse von<em&gt; In-vitro-</em&gt; Zellroll Mit einer Multi-Well-Platte mikrofluidischen System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Test auf Augenreizung (EIT) zur Kennzeichnung der Gefahr von Augen Reizt Chemicals mit rekonstruierter menschlicher Hornhaut-ähnlichen Epithelial (RhCE) Gewebemodell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Ein Mikrofluidik-Plattform für Hochdurchsatz-Einzelzell-Isolierung und Kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

Chemical genetics is increasingly being employed to decode traits in plants that may be recalcitrant to traditional genetics due to gene redundancy or lethality. However, the probability of a synthetic small molecule being bioactive is low; therefore, thousands of molecules must be tested in order to find those of interest. Liquid handling robotics systems are designed to handle large numbers of samples, increasing the speed with which a chemical library can be screened in addition to minimizing/standardizing error. To achieve a high-throughput forward chemical genetics screen of a library of 50,000 small molecules on Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protocols using a bench-top multichannel liquid handling robot were developed that require minimal technician involvement. With these protocols, 3,271 small molecules were discovered that caused visible phenotypic alterations. 1,563 compounds induced short roots, 1,148 compounds altered coloration, 383 compounds caused root hair and other, non-categorized, alterations, and 177 compounds inhibited germination.

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

A high throughput screen of synthetic small molecules was conducted on the model plant species, Arabidopsis thaliana. This protocol, developed for a liquid handling robot, increases the speed of forward chemical genetics screens, accelerating the discovery of novel small molecules affecting plant physiology.

Optimierung der Nutzung eines Liquid Handling Roboters, einen hohen Durchsatz nach vorn Chemische Genetik Bildschirm von Arabidopsis Thaliana durchzuführen

Chemical genetics is increasingly being employed to decode traits in plants that may be recalcitrant to traditional genetics due to gene redundancy or ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Einsatz von Hochdurchsatz-automatisierte Microbioreactor-System für die Produktion des Modells IgG1 in CHO-Zellen

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. The tomato-P. syringae pv. tomato pathosystem is widely used to dissect the genetic basis of plant innate responses and disease resistance. While disease was successfully managed for many decades through the introduction of the Pto/Prf gene cluster from Solanum pimpinellifolium into cultivated tomato, race 1 strains of P. syringae have evolved to overcome resistance conferred by the Pto/Prf gene cluster and occur worldwide.
Wild tomato species are important reservoirs of natural diversity in pathogen recognition, because they evolved in diverse environments with different pathogen pressures. In typical screens for disease resistance in wild tomato, adult plants are used, which can limit the number of plants that can be screened due to their extended growth time and greater growth space requirements. We developed a method to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance, which minimizes plant growth time and growth chamber space, allows a rapid turnover of plants, and allows large sample sizes to be tested. Seedling outcomes of survival or death can be treated as discrete phenotypes or on a resistance scale defined by amount of new growth in surviving seedlings after flooding. This method has been optimized to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance to two P. syringae strains and can easily be adapted to other P. syringae strains.

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

The seedling flood assay facilitates rapid screening of wild tomato accessions for the resistance to the Pseudomonas syringae bacterium. This assay, used in conjunction with the seedling bacterial growth assay, can assist in further characterizing the underlying resistance to the bacterium, and can be used to screen mapping populations to determine the genetic basis of resistance.

High-Throughput Identifikation der Resistenz gegen Pseudomonas syringae pv. Tomate in Tomaten mit Seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Erzeugung dynamischer Umgebungsbedingungen mit einem hochdurchsatzstarken mikrofluidischen Gerät

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...