Diese Studie wurde vom Max McGee National Research Center for Juvenile Diabetesat Medical College of Wisconsin und Kinder Research Institute of Wisconsin unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerhebung und-analyse oder Erstellung des Manuskripts.

1. Vor dem Einrichten einer Unterdrückung Assay, überprüfen muss man Mantel tosylactivated Beads mit anti-human CD3 (Klon UCHT1, Endkonzentration 1μg/ml) für Zell-Stimulation und danach, ob die Perlen effizient durch die Einrichtung eines In-vitro-Proliferation-Assay mit menschlichen beschichtet T-Zellen <ol><li> Nehmen Sie 1 ml der M-450 tosylactivated Perlen aus der Original-Durchstechflasche, in Magnetfuß und halten, bis alle Perlen auf der Seite des Rohres haften geblieben sind. Entfernen Sie den Puffer, während Röhre befindet sich noch in der magnetischen stehen. Nehmen Sie Schlauch aus magnetischen stehen und 1ml von buffer1 wird das Reagenzglas in magnetischen stehen wieder und entfernen Sie die buffer1 während Röhre ist in der magnetischen stehen; resuspendieren Perlen in 1 ml buffer1 und fügen 40 ul von anti-human CD3, agitieren bei 37 ° C für 15 Minuten, fügen Sie 0,1% w / v BSA und weiter agitieren für die nächsten 16 Stunden. </li><li> Waschen Sie die Kugeln in buffer2 zweimal für 5 Minuten bei 2-8 ° C und einmal in buffer3 für 5 Minuten bei 2-8 ° C unter Verwendung magnetischer stehen, wie oben erläutert, entfernen Sie die Puffer-und resuspendieren die Perlen in 1 ml buffer2; die Perlen 4x10 8 / ml Endkonzentration und einsatzbereit. </li><li> Aliquot 50.000 und 25.000 PBMC / well in dreifacher Ausfertigung in einer 96-Well-Platte und stell &#39;variable Anzahl von CD3-beschichteten Beads (4x10 8 Perlen / ml, CD3 1μg/ml, z. B. 1, 2, 3, 4, 5 Perlen / Zelle ), um die optimale Anzahl von Kugeln pro Zelle zu bestimmen. Nach 72 Stunden in Kultur, fügen 1μCi [3 H] Thymidin und weiterhin Inkubation bei 37 ° C für die nächsten 16 Stunden. Ernten Sie die Zellen in Multiscreen Ernte Platte (Millipore), fügen Szintillationsflüssigkeit und lesen Sie zählt pro Minute (cpm) / well mit Top Count NXT (Packard, CT). Verwenden Sie die Perlen / Zell-Verhältnis, wenn cpms ab 5000, aber weniger als 15000 zu Überreizung der Tregs, die suppressive Funktion verlieren könnte, vermieden. Normalerweise stimuliert Verhältnis von 3 Perlen / Zelle sowohl Responder und Treg-Zellen in allen Fächergruppen bisher getesteten 1-4. </li></ol> 2. PBMC Isolierung aus Vollblut von gesunden Spendern oder aus menschlichem leukopacks oder Buffy-Coat (BC) in der Regel von gesunden Freiwilligen und kostenlos von örtlichen Blutspendedienst Centers übernommen (Abbildung 1) <ol><li> Verdünnen Sie die BC (~ 50ml) 1:6 mit PBS (add 250ml). Jetzt gibt es 300ml Gesamtvolumen. Langsam Schicht 25ml verdünnt BC oben auf 15ml Ficoll-Paque PLUS hinzugefügt 50ml Falcon-Röhrchen, ohne die Schichten. Zentrifuge bei 800xg (1400 in einer Sorvall-Zentrifuge mit Ausschwingrotor SH-3000) für 30 Minuten bei 4 ° C, mit Bremse ausgeschaltet. </li><li> Sorgfältig sammeln PBMC-Schicht (mittlere Phase) und überträgt es auf ein frisches 50ml Falcon-Röhrchen. Wash PBMC, indem die Rohre bis zu 50ml mit DPBS. Sammeln Sie 2-Zell-Pellets in einem Rohr. Zentrifuge bei 400xg für 10 min bei 4 ° C. Waschschritt zweimal wiederholen, jedes Mal, wenn die Kombination von 2-Zell-Pellets in einem einzigen Rohr. Kombinieren Sie alle Zellpellets in einem einzigen 50ml Tube. </li><li> Graf PBMC mit Trypanblau-Test. Machen Sie eine 1:10-Verdünnung in Trypanblau, indem 20 &amp;mgr; l von PBMC zu 180μl der Trypanblau-Färbung. Gut mischen und 20 &amp;mgr; l nehmen, um in Hämazytometer sofort verlassen. Count-Nummern aller ungefärbt und nur blau gefärbten Zellen in zwei quadratische Blöcke mit jeweils 16 kleineren Plätzen. Der Mittelwert der beiden Zahlen und mit 10 multiplizieren. Teilen Sie diese Zahl durch 100, die Zahl der PBMC / ml erhalten. Prozentsatz der lebenden Zellen, wie berechnen [1 - (Anzahl der blauen Zellen / Gesamtzahl der Zellen) x100]. Gehen Sie, wenn die Lebensfähigkeit von ≥ 95%. </li></ol> 3. MACS Vorsortierung der CD4 T-Zellen <ol><li> Bevor Sie fortfahren, Transfer 1ml PBMC in ein neues Röhrchen, fügen 4ml von Medien, um Zellen für die Bestrahlung mit 5000rad-diese vorbereiten Antigen-präsentierende Zellen (APC) werden. </li><li> Centrifuge der Rest der Zellen bei 250xg in PBS/2mM EDTA/0.5% BSA-Puffer für 10min bei 4 ° C. Überstand abgießen und die Zellen in 4 ml PBS/2mM EDTA/0.5% BSA-Puffer. </li><li> Add 200 ul von MACS anti-CD4-Microbeads und inkubieren Sie bei 4 ° C für 20 Minuten. </li><li> Wash, indem 40ml PBS/2mM EDTA/0.5% BSA-Puffer und Zentrifuge bei 250xg für 10min bei 4 ° C. Abgießen Überstand und resuspendieren in 8ml entgastem, Raumtemperatur PBS/2mM EDTA/0.5% BSA-Puffer. </li><li> Filter-Trennung der Zellsuspension mit Vorabscheidung Filter vor dem Laden auf einem LS-Spalte. </li><li> Split der Zellsuspension und Schicht 4ml jeweils über kalibriert LS Spalte (mit 3 ml deggassed PBS/2mM EDTA/0.5% BSA-Puffer). LS-Spalte in der MidiMACS Trennzeichen festgelegt. Vor Zellsuspension ausgeht, entweder re-run Durchfluss oder fügen Sie 3ml deggassed Raumtemperatur PBS/2mM EDTA/0.5% BSA-Puffer und lassen Sie den Puffer durchlaufen. Fügen Sie mehr Puffer, bis es klar kommt. </li><li> Pipette 5ml deggassed Puffer auf die LS Spalte entfernen LS Column aus dem MidiMACS Abscheider und in einen neuen sterilen 15ml Sammelröhrchen lassen ~ 1.0ml durchlaufen. Setzen Sie den Kolben in die Spalte und langsam schieben Sie den Rest desVolumen aus. </li><li> Machen Sie dasselbe mit den beiden LS Säulen und verbinden die beiden CD4 +-Fraktionen. Fügen Sie bis zu 50 ml PBS und zählen Zellen. Erwartete Rendite von bis zu 5x10 8 Zellen. Zentrifuge bei 400xg für 10 Minuten und die Zellen auch in 2ml PBS/2mM EDTA/0.5% BSA-Puffer. </li></ol> 4. Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) isoliert (Abbildung 2) <ol><li> Machen Sie einen Cocktail an Antikörpern gegen CD-Marker auf die folgenden Zelloberflächenmarker (halten geschützt vor Licht): 20 ul Anti-Human-CD8-FITC (Klon RPA-T8), 20 ul Anti-Human-CD14-FITC (Klon M5E2; LPS-Rezeptor), 20 ul Anti-Human-CD32-FITC (Klon FLI8.26; FcyR-Typ II) und 6 ul Anti-Human-CD116-FITC (Klon M5D12; GM-CSFRα Kette) und alternativ, fügen Sie 40 ul anti -human CD4-APCCy7 (Klon RPA-T4). </li><li> Nehmen Sie 5μl aus der 2ml Zellsuspension und Fleck mit 2μl der Fleck-Cocktail, das ist ein Rohr für die Bestimmung der Schwelle (Fluorochrom Minus One-FMO) 5. </li><li> Add 50 ul Anti-Human-CD25-PE (Klon M-A251, IL-2Rα), um den Fleck Cocktail, und fügen Sie den Cocktail Zellsuspension und inkubieren Sie bei 4 ° C 30 Minuten. Wash-Zellen in PBS-Puffer, Zentrifuge bei 400xg für 10 Minuten und die Zellen auf eine Zellkonzentration von 10 7 / ml. </li><li> Bereiten ungefärbten Zellen und Zellen oder Kügelchen, die mit einzelnen Fluorochrom gefärbt, um als Ausgleich für die Kontrolle Zellsortierung am FACS Aria (BD Biosciences, San Jose, NJ) zu verwenden. </li><li> Erwerben Sie Zellen in der FMO Röhre, die dem Benutzer erlauben, die Schwelle für die Sortierung von CD25 + T-Zellen (Abbildung 2a) gesetzt wird. Setzen Sie einen Schutzzaun um FITC-negative Zellen FITC-positiven Zellen aus Monozyten, Makrophagen und alle anderen CD4 +-non-T-Zellen (Abb. 2b) auszuschließen. </li><li> In einem separaten Grundstück, ziehen Tore für CD25-, CD25low und CD25high T-Zellen-Tregs (Top 1% der Zellen, die die höchste Zahl an CD25) (Abbildung 2c). Zell-Untergruppen zeigen typischerweise hohe Reinheit (Abbildung 2d, 2e und 2f). </li><li> Centrifuge Sammelröhrchen mit Zellen in 400xg für 10 Minuten und halten sie auf Eis, bis Plattierung. </li></ol> 5. Set up Zellkultur in 96-Well-Platte (Schema wie Tabelle 1 im Anhang) in 200μl/well <ol><li> Aliquot 50 ul CD3-beschichteten Beads (1 pg / ml) berechnet bis 3 Perlen / Responder-Zelle in einen Brunnen, in komplettem Medium mit 10% gepooltem humanem AB-Serum resuspendiert in U-Boden 96-well Platten werden. (Zum Beispiel, um 2ml Medien mit CD3-beschichteten machen, 7.5μl nehmen ab Lager der CD3-beschichteten Beads-Endkonzentration 4x10 8 / ml und verdünnen in 2ml Medien, jeder 50 ul werden 75.000 beads-3beads/cell enthalten). </li><li> Verdünnen Sie bestrahlten APC auf 5x10 5 / ml Zellkonzentration und fügen 50 ul (wird 2,5 x 10 4 Zellen enthalten) in jedes Well mit zuvor hinzugefügt Stimulation, einschließlich Brunnen als &quot;Tregs nur&quot; bezeichnet, &quot;APC nur&quot; und &quot;Medien nur&quot; in der Tabelle 1. </li><li> Add 2,5 x 10 4 / well CD4CD25-oder CD4CD25low T-Zellen in dreifacher Ausfertigung folgende Design in Tabelle 1. </li><li> Add Tregs zu Co-Kulturen (Reihe B, Tabelle 1) im Verhältnis 1:10 (2.500 Treg-Zellen) und in die Vertiefungen als &quot;Tregs nur&quot; beschriftet und inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C in CO 2-Inkubator mit 5% CO 2 , in gesättigten Luftfeuchtigkeit für 72 Stunden. </li><li> Pulse Brunnen mit 1μCi [3 H] Thymidin und weiterhin Inkubation bei 37 ° C für die nächsten 16 Stunden. </li></ol> 6. Ernten und Zählen <ol><li> Ernten Sie die Zellen auf Multiscreen Ernte Platte mit Packard Filtermate Mähdrescher oder alternatives System. </li><li> Add Szintillationsflüssigkeit (Microscint 20), decken Ernte Platte mit transparenten Kunststoff-Abdeckung in der Vorbereitung für den letzten Schritt. </li><li> Lesen Sie zählt pro Minute (cpm) / well mit Top Count NXT (Packard, CT) oder alternatives System. </li></ol> 7. Computing Prozentsatz der Unterdrückung <ol><li> Wie Zellen in dreifacher Ausführung kultiviert wurden, ist durchschnittlich für jede Bedingung berechnet. Wenn der Variationskoeffizient&gt; 30% ist die Ausreißer eliminiert und nur cpm aus zwei Brunnen gemittelt werden. Prozentsatz der Unterdrückung durch die Berechnung erhalten [(sc) / s] x 100%, wobei s = cpm in einzelnen Kultur und c = cpm in Co-Kultur. </li><li> Wie naiv (CD25-) und in vivo aktiviert (CD25low) Effektor-T-Zellen werden als Responder T-Zellen ausplattiert, ist der Unterschied in der Fähigkeit der Tregs auf jede dieser Teilmengen zu unterdrücken gefangen genommen und als potentielle funktionelle prognostischer Indikator auf der Prämisse, verwendet dass aktivierte Zellen sind schwerer zu unterdrücken. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse: Große Variabilität in der verwendeten Methoden und Ergebnisse aus in vitro menschliche Unterdrückung Assay abgeleitet hat uns veranlasst, eine umfassende Studie über Bedingungen beeinflussen den Test 1 durchzuführen. Wir haben einen Test, der nicht nur Treg Funktionstests, sondern auch ihre Reinheit entwickelt, unter Berücksichtigung der niedrigen Verhältnis zwischen Tregs: Teffs (1:10), die wir bestimmt früher 6. Darüber hinaus Tregs in th unterscheideneir Fähigkeit, erfolgreich zu unterdrücken naiv und in vivo-aktivierten T-Zellen auch bei gesunden Probanden, wie in Abbildung 3 und in unseren früheren Studien 2,4, die mehr hervortritt angezeigt, wenn Immunbalance gefährdet ist, als bei Personen mit Risiko für die Entwicklung von T1D . Der Test funktionierte sehr gut in der Studie, wo wir im Vergleich suppressive Funktion der natürlichen (nTregs), induzierbare (iTregs) und in vitro erweitert nTregs, so dass wir ihre Funktion zwischen gesunden Kontrollgruppe zu vergleichen, kürzlich aufgetretenen (RO) T1D und langjährige (LS ) T1D Themen. Wir schlossen daraus, dass RO T1D Themen besser Kapazitäten zur Erzeugung funktionaler sowohl iTregs und erweitert nTregs im Vergleich zum LS T1D und gesunden Kontrollpersonen 7 hatte. Somit kann dieser Test als besonders geeignetes Mittel in der Anerkennung der sowohl eine frühe und späte Zustand des Immunsystems Ungleichgewicht verwendet werden. Schema 1: Schematische Darstellung der Schritte in in vitro-Assay Unterdrückung beteiligt <img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Schritte der In-vitro-Assay-Unterdrückung mit Fotos vorgestellt <img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Gating-Strategie in FACS Zellisolation. a) CD25 + Schwelle wurde nach Fluorochrom Minus One (FMO), b bereinigt)-Zellen wurden gated als FITC-negative, c) FITC-negative Zellen wurden weiter gated gesammelt und als CD + CD25-, CD + CD25low und CD + CD25high ( Tregs) mit Prozentsätzen, d gezeigt) FACS sortiert Tregs nach dem Sortieren) e FACS sortiert CD + CD25low nach dem Sortieren und f) FACS sortiert CD4 + CD25-T-Zellen nach der Sortierung <img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Repräsentative Ergebnisse von gesunden Probanden a) Repräsentative Ergebnisse der Zählungen pro Minute (cpm) von gesunden Probanden als Einzel-Kulturen für alle Zell-Untergruppen befassten (naiv-CD25-, in vivo aktiviert-CD25low, Antigen-präsentierende Zellen-APC und regulatorischen T-Zellen-Treg) sowie Co-Kulturen von Responder T-Zellen (CD25-oder CD25low) und Tregs. b) Prozentsatz der Unterdrückung jedes CD25-und CD25low Responder T-Zellen durch autologe Tregs ist für gesunde Kontrollpersonen dargestellt (n = 4). Suppression wurde als [(sc) / s] berechnet x 100%, wobei s = cpm in einzelnen Kultur und c = cpm in Co-Kultur. Obwohl geringe Unterschied in Leistung von Tregs zu Responder T-Zellen unterdrücken bemerkt wurde, war es nicht signifikant (gepaarter t-Test p = 0,08). C) Präsentiert werden cpm gefährdet Themen für jede einzelne Kultur, einschließlich CD25-und CD25low als Responder T-Zellen sowie APC und Tregs und Co-Kulturen, in denen jeweils Responder T-Zell-Untergruppe mit Tregs (CD25-/Tregs und CD25low/Tregs). d) Prozentsatz der Unterdrückung jedes CD25-und CD25low Responder T-Zellen durch autologe ist ausgesät Tregs ist in Gefahr Probanden (n = 4) vorgestellt. Der Unterschied in der Kapazität der Tregs auf CD25-versus CD25low Responder T-Zellen zu unterdrücken war signifikant (gepaarter t-Test p = 0,04). Tabelle 1. Schematische Aufbau von in vitro-Assay-Unterdrückung <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 1-3 </td><td> 4-6 </td><td> 7-9 </td><td> 10-12 </td></tr><tr><td> A </td><td> CD4CD25- </td><td> CD4CD25low </td><td> Medien nur </td><td> Medien nur </td></tr><tr><td> B </td><td> CD4CD25-/ Tregs </td><td> CD4CD25low / Tregs </td><td> Tregs nur </td><td> APC nur </td></tr><tr><td> C </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> D </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> F </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> G </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> H </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+characterization,+and+biological+evaluation+of+integrin+&#945;V&#946;3-targeted+PAMAM+dendrimers.">Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin &#945;V&#946;3-targeted PAMAM dendrimers.</a> Mol. Pharm. 5, 527-539 (2008).</li></ol>

Als einzige Besonderheit an Tregs, sollte suppressive Funktion zuverlässig und gleichmäßig zwischen den Fächern geprüft werden in verschiedenen Phasen der Entwicklung der Krankheit innerhalb der gleichen und zwischen unterschiedlichen Studien. Wir bieten Ihnen Details der Unterdrückung Test in unserem Labor als unseren Beitrag zur Standardisierung von diesem Assay entwickelt. In unserem umfangreichen Studie zur Optimierung, haben wir festgestellt, dass T-Zell-Stimulation mit anti-human CD3-beschichteten Beads (UCH...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes oder Instrument </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Ficoll-Paque PLUS </td><td> Amersham Pharmacia Biotech </td><td> 17-1440-03 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS-1X </td><td> Gibco </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> Trypanblau </td><td> Invitrogen </td><td> 15250-061 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD4-Microbeads </td><td> Miltenyi </td><td> 130-045-101 </td><td></td></tr><tr><td> Pre-Trennfilter </td><td> Miltenyi </td><td> 130-041-407 </td><td></td></tr><tr><td> LS Spalte </td><td> Miltenyi </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 15575-020 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B4287 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-human CD4-APCCy7 (Klon RPA-T4) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557852 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-human CD25-PE (Klon M-A251, IL-2Rα) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555432 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-human CD8-FITC (Klon RPA-T8) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555366 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-human CD14-FITC (Klon M5E2; LPS-Rezeptor) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555397 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-human CD32-FITC (Klon FLI8.26; FcyR-Typ II) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555448 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-human CD116-FITC (Klon M5D12; GM-CSFRα Kette) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 554532 </td><td></td></tr><tr><td> Dynalbeads M-450 tosylactivated </td><td> Invitrogen </td><td> 140-13 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-human CD3 </td><td> Ancell </td><td> 144-024 </td><td></td></tr><tr><td> Buffer1 </td><td> Homemade </td><td></td><td> 0,1 M Na 2 B 4 O 7 pH 7,6 </td></tr><tr><td> Buffer2 </td><td> Homemade </td><td></td><td> PBS/2mM EDTA / 0,1% BSA pH-Wert 7,4 </td></tr><tr><td> Buffer3 </td><td> Homemade </td><td></td><td> 0,2% BSA pH 8,5 Tris/0.1 </td></tr><tr><td> Vollständige RPMI Medien </td><td> Homemade </td><td></td><td> RPMI 1640 Medium 2 mM L-Glutamin 5 mM HEPES 100 U / ug / ml peni / Strept 0,5 mM Natriumpyruvat </td></tr><tr><td> [3 H] Thymidin </td><td> Perkin Elmer </td><td> NET027Z005MC </td><td></td></tr><tr><td> Menschen gebündelt AB-Serum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S40110 </td><td></td></tr><tr><td> Multiscreen Ernte Platte </td><td> Millipore </td><td> MAHFC1H60 </td><td></td></tr><tr><td> Microscint 20 </td><td> Perkin Elmer </td><td> 6013621 </td><td></td></tr></tbody></table>

human in vitro suppression as screening tool for the recognition of an early state of immune imbalance

Regulatorische T-Zellen (Tregs) sind kritische Mediatoren der Immuntoleranz gegenüber Selbst-Antigenen. Darüber hinaus sind sie von entscheidender Bedeutung Regulatoren der Immunantwort auf eine Infektion. Trotz der Bemühungen um eine einzigartige Oberfläche Marker auf Tregs zu identifizieren, ist die einzige Besonderheit ihrer Fähigkeit, die Proliferation und Funktion der Effektor-T-Zellen unterdrücken. Es ist zwar klar, dass nur in vitro-Untersuchungen können bei der Beurteilung der menschlichen Treg-Funktion verwendet werden, wird diese Problematik bei der Beurteilung der Ergebnisse von Querschnitts-Studien, in denen gesunder Zellen und Zellen von Patienten mit Autoimmunerkrankungen (wie Typ 1 Diabetes-T1D) müssen isoliert verglichen werden. Es gibt eine große Variabilität zwischen den Labors in der Anzahl und Art der Responder-T-Zellen, Art und Stärke der Stimulation Treg: Responder-Verhältnisse und die Anzahl und Art der Antigen-präsentierenden Zellen (APC) in der menschlichen In-vitro-Suppression-Tests verwendet. Diese Variabilität macht einen Vergleich zwischen Studien zur Messung Treg-Funktion schwierig. Die Treg-Feld muss ein standardisiertes Unterdrückung Assay, die gut funktionieren wird sowohl mit gesunden Probanden und Patienten mit Autoimmunerkrankungen. Wir haben eine in vitro-Assay-Unterdrückung, die sehr wenig Intra-Assay-Variabilität in der Stimulation von T-Zellen von gesunden Freiwilligen im Vergleich zu Patienten mit zugrunde liegenden autoimmune Zerstörung der Bauchspeicheldrüse β-Zellen isoliert zeigt entwickelt. Das Hauptziel dieses Stückes ist es, ein in vitro menschliche Unterdrückung Assay, der Vergleich zwischen den verschiedenen Fächergruppen ermöglicht beschreiben. Darüber hinaus hat dieser Test das Potenzial, einen kleinen Verlust in nTreg Funktion beschreiben und rechnen mit weiteren Verlust in der Zukunft, also die Identifizierung von Personen, die präventive immunmodulatorische Therapie 1 profitieren könnten. Im Folgenden bieten wir ausführliche Beschreibung der Schritte in diesem Verfahren beteiligt. Wir hoffen, dass die Standardisierung der in vitro Suppression Assay verwendet werden, um Treg-Funktion Maßnahme beitragen. Darüber hinaus bieten wir diesen Test als ein Werkzeug zu einem frühen Zustand des Immunsystems Ungleichgewicht und eine mögliche funktionelle Biomarker für T1D zu erkennen.

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Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs sind potente Suppressoren des Immunsystems. Es besteht ein Mangel an einzigartigen Oberflächenmarker um sie zu definieren, damit sind die Definitionen der Tregs in erster Linie funktional. Hier beschreiben wir eine optimierte<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assay ermöglicht die Identifizierung immune Ungleichgewicht bei den Probanden mit Risiko für die Entwicklung von T1D.

Mensch In Vitro Suppression als Screening-Tool für die Anerkennung von Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

14.4K Aufrufe.  Medical College of Wisconsin. Tregs sind potente Suppressoren des Immunsystems. Es besteht ein Mangel an einzigartigen Oberflächenmarker um sie zu definieren, damit sind die Definitionen der Tregs in erster Linie funktional. Hier beschreiben wir eine optimierte In-vitro- Assay ermöglicht die Identifizierung immune Ungleichgewicht bei den Probanden mit Risiko für die Entwicklung von T1D.

Serie: Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ROS are toxic and function to kill phagocytized microorganisms. In vivo quantification of phagocyte-derived ROS provides information regarding an organism's ability to mount a robust innate immune response. Here we describe a protocol to quantify and compare ROS in whole zebrafish embryos upon chemical induction of the phagocyte respiratory burst. This method makes use of a non-fluorescent compound that becomes fluorescent upon oxidation by ROS. Individual zebrafish embryos are pipetted into the wells of a microplate and incubated in this fluorogenic substrate with or without a chemical inducer of the respiratory burst. Fluorescence in each well is quantified at desired time points using a microplate reader. Fluorescence readings are adjusted to eliminate background fluorescence and then compared using an unpaired t-test. This method allows for comparison of the respiratory burst potential of zebrafish embryos at different developmental stages and in response to experimental manipulations such as protein knockdown, overexpression, or treatment with pharmacological agents. This method can also be used to monitor the respiratory burst response in whole dissected kidneys or cell preparations from kidneys of adult zebrafish and some other fish species. We believe that the relative simplicity and adaptability of this protocol will complement existing protocols and will be of interest to researchers who seek to better understand the innate immune response.

The innate immune response protects organisms against pathogen infection. A critical component of the innate immune response, the phagocyte respiratory burst, generates reactive oxygen species that kill invading microorganisms. We describe a respiratory burst assay that quantifies reactive oxygen species produced when the innate immune response is chemically induced.

Die Quantifizierung der Atem Burst Antwort als Indikator für Angeborene Immunsystem Gesundheit in Zebrafisch

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

Untersuchung der Effekte von Probiotika auf Pneumokokken-Kolonisation Mit ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Einhaltung Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

In-vitro-Analyse Myd88-vermittelte zelluläre Immunantwort gegen das West-Nil-Virus-Infektion Mutantenstamm

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell zur Messung der Immunantwort auf Malaria im Kontext der HIV-Koinfektion

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Einrichtung eines Setup-Hochdurchsatz-Screening für kleine Moleküle, die Modulate c-di-GMP-Signalisierung in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Determining Immune System Suppression versus CNS Protection for Pharmacological Interventions in Autoimmune Demyelination

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in myelin destruction, which not only slows conduction of nerve impulses, but causes axonal injury resulting in motor and cognitive decline. Current treatments for MS focus on attenuating immune cell infiltration into the central nervous system (CNS). These treatments decrease the number of relapses, improving quality of life, but do not completely eliminate relapses so long-term disability is not improved. Therefore, therapeutic agents that protect the CNS are warranted. In both animal models as well as human patients with MS, T cell entry into the CNS is generally considered the initiating inflammatory event. In order to assess if a drug protects the CNS, any potential effects on immune cell infiltration or proliferation in the periphery must be ruled out. This protocol describes how to determine whether CNS protection observed after drug intervention is a consequence of attenuating CNS-infiltrating immune cells or blocking death of CNS cells during inflammatory insults. The ability to examine MS treatments that are protective to the CNS during inflammatory insults is highly critical for the advancement of therapeutic strategies since current treatments reduce, but do not completely eliminate, relapses (i.e., immune cell infiltration), leaving the CNS vulnerable to degeneration.

This protocol describes how to determine whether pharmacological treatments for experimental autoimmune encephalomyelitis show CNS protection as a consequence of suppressing immune cell infiltration or are neuroprotective during the onslaught of immune cell infiltration.

Die Bestimmung Unterdrückung des Immunsystems gegen ZNS-Schutz für pharmakologische Interventionen im Bereich der Autoimmun- Demyelinisierung

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Analyse von Lymphozyten-Extravasation einer Verwendung<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell des Barrier Menschliches Blut-Hirn

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

Analyse der 18FDG PET/CT Imaging als Werkzeug für Studium Mycobacterium-Tuberkulose -Infektion und Behandlung bei nicht-menschlichen Primaten

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...