Die Autoren bedanken sich bei Emilie Mairey und Emmanuel Donnadieu für die Ersteinrichtung des Verfahrens zu danken.

1. Menschlichen Wirtszelle und Bakterienkultur <ol><li> Kultur HUVECs zwischen Passage 1 und 9 bei 37 ° in einem befeuchteten Inkubator mit 5% (v / v) CO 2. Passage der Zellen, wenn sie 80% Konfluenz Ansatz mit Trypsin / EDTA bis zur Wartung Kulturen auf 75 cm 2 Kulturflaschen und experimentellen Kulturen in Einweg-Flow Kammern (μ-Slides VI) liefern. </li><li> Ziehen Medium aus den Flaschen zu passagiert werden, waschen Sie die Zellen mit 10 ml PBS, zurückzutreten und ersetzen Sie sie mit 1,5 ml Trypsin / EDTA. Lassen Sie die Zellen in einer Zellkultur-Inkubator für 5 Minuten lösen bei 37 ° C. </li><li> Sammeln Sie die Zellen mit 10 ml Zellkulturmedium in eine 15 ml-Collection-Tube. Pellet die Zellen mit einem 5 Minuten Zentrifugation (bei 200 g), bei Raumtemperatur. Die Zellen in 4 ml Endo-SFM mit 10% (v / v) FBS und zählen sie auf einem Malassez Kammer nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Einführung 30 ul einer 1x10 6 HUVEC Zellen pro ml Suspension in den Kanal (3x10 4 insgesamt) und damit die Zellen für 3 Stunden bei 37 haften ° in einem befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% (v / v) CO 2. Fügen Sie ein zusätzliches Volumen von 120 ul Endo-SFM in die Vertiefungen füllen. Die Zellen sollten bilden eine subkonfluenten Monoschicht (Abbildung 2). </li><li> Wachsen Sie N. meningitidis, die GFP (in diesem Fall Stammes 8013, die GFP unter der Kontrolle eines IPTG-induzierbaren Promotor), auf GCB-Agarplatten mit Kellogg Ergänzungen und 5 ug / ml Chloramphenicol bei 37 ° C in einer feuchten Atmosphäre mit 5% (v / v) CO 2 für 16 Stunden. </li></ol> 2. Initial Haftung der einzelnen Bakterien an Wirtszellen <ol><li> Die Konzentration der Bakterien auf GCB Agarplatten zu einer OD600 von 0,05 gewachsen mit vorgewärmten Endo-SFM mit 10% (v / v) FBS und inkubieren für 120 Minuten bei 37 ° C in einer feuchten Atmosphäre mit 5% (v / v) CO 2, unter leichtem Schütteln (130 rpm). Induce GFP-Expression durch Zugabe von 1 mM IPTG in das Kulturmedium für die ganze Inkubationszeit. </li><li> Legen Sie die Einweg-μ-Slide auf der Bühne eines inversen Mikroskops mit einem beheizten Plattform, um die Temperatur der Probe bei 37 ° C zu halten ausgestattet </li><li> Gießen vorgewärmten Endo-SFM mit 2% (v / v) FBS in ein steriles Becherglas und füllen eine sterile 50 ml Spritze mit diesem Medium. Bringen Sie die &quot;Eingabe&quot;-Schlauch auf die Spritze und füllen Sie durch die Einführung Medium. </li><li> Verbinden Sie den &quot;Eintrag&quot; Schlauch an den μ-Slide, mit Sorgfalt, um zu vermeiden, Einleiten von Luft in die Kammer. Dann füllen Sie das Anbringen der &quot;exit&quot; Rohr an das andere Ende und vorsichtig den Kanal mit mittleren bis ca. 1 cm Abstand von der Kammer &quot;exit&quot;. </li><li> Messen Sie die bakterielle OD600 und passen auf 0,15 in Endo-SFM mit 2% (v / v) FBS. Um an den einzelnen Bakterien aussehen, müssen alle Aggregate durch kräftiges Vortexen der bakteriellen Probe gestört werden. </li><li> Platz 100 ul der Endo-SFM mit 2% (v / v) FBS-Medium in das Reservoir ergänzt und 100 ul der bakteriellen Lösung von der Oberseite des gevortext Lösung zu vermeiden, Probenahme alle verbleibenden bakteriellen Aggregaten genommen. </li><li> Sorgfältig stellen die 200 ul Volumen in den μ-Slide, indem Sie den Hahn, um die Bakterien in die Kammer zu injizieren. </li><li> Einführung Endo-SFM mit 2% (v / v) FBS, bei 37 ° C mit dem erhitzten Plattform, in die Kammer mit Hilfe einer Spritzenpumpe mit einer Schubspannung mit Adhäsion von 0,044 dyn / cm 2 für 15 Minuten. </li></ol> Siehe zum Beispiel Video-1 oder Abbildung 3 dargestellt. Nach diesem Schritt, entweder den § § 3, 4 oder 6 zu bewegen. 3. Die Quantifizierung der Anfangshaftung von einzelnen Bakterien an Wirtszellen <ol><li> Nach anfänglichen Haftung für die 15 Minuten, zu erwerben Bildern von zehn Feldern zufällig während Flüssigkeit immer noch im Umlauf ist. </li><li> Analysieren Sie die aufgenommenen Bilder mit dem ImageJ-Software 8, um die mittlere Anzahl der adherant Bakterien pro Feld zuzugreifen. Dies geschieht wie folgt: Zunächst einmal, jedes Bild wird Schwellenwert mit dem &quot;Threshold&quot;-Fenster in der &quot;Bild&quot;-Menü auf einzelne haftende fluoreszierende Bakterien zu markieren, bei gleichzeitiger Minimierung der Hintergrund aus den Zellen. Dann wird jedes einzelne Bakterium gezählt, mit dem Plug-In &quot;Cell Counter&quot; ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html</a> ). Die Daten für jedes Bild in einer Excel-Tabelle angegeben und sind gemittelt, um die mittlere Anzahl der adhärenten Bakterien pro Feld zu quantifizieren. </li></ol> 4. Die Messung der Strömungswiderstand einzelner Bakterien Anhänger Wirtszellen <ol><li> Programm der Spritzenpumpe Set-up zu Schubspannung zwischen 3 bis 100 dyn / cm 2 für 5 Minuten zu generieren. </li><li> Am Ende der 5 Minuten zu erwerben zehn Felder zufällig gewählt, wie in Schritt 3.1 beschrieben, aber mit der Strömung gestoppt prior auf den Erwerb. </li><li> Analysieren Sie die aufgenommenen Bilder wie in Schritt 3.2 beschrieben und quantifiziert die mittlere Anzahl der verbleibenden Bakterien pro Feld. </li></ol> 5. Die Messung des Wachstums eines isolierten Anhänger Bakterium zu einem Mikrokolonie <ol><li> Einführung Endo-SFM mit 10% (v / v) FBS, bei 37 ° C mit dem erhitzten Plattform, in die Kammer mit Hilfe einer Spritzenpumpe mit dem gewählten Schubspannung für mehrere Stunden. Bilder aufzeichnen für die Echtzeit-Video-Mikroskopie mit einem Bild alle 5 Minuten. </li><li> Nach Video-Mikroskopie, stoppen Sie die Schubspannung durch Abschalten der Spritzenpumpe, erwerben 2-3 zusätzliche Bilder und beenden Sie den Bildaufnahme-Sequenz auf die Software. Ein Beispiel der bakteriellen Vermehrung kann auf Video 2 zu sehen. </li></ol> 6. Die Messung der Strömungswiderstand von anhaftenden Bakterien Mikrokolonien <ol><li> Nach der Bildung der großen Mikrokolonien auf der Zelloberfläche (step5.2) erwerben 2-3 Bilder der beiden Zellen (durch Phasenkontrast) und Bakterien (durch GFP-Fluoreszenz), bevor flow Anwendung. Für den Rest des Experiments wird die Übernahme-Protokoll-Monitor nur die Fluoreszenz. </li><li> Die Anwendung hoher Scherspannung für 5 Minuten (300 bis 100 dyn / cm 2) und Aufnehmen von Bildern in einem Frame pro 5 Sekunden. </li><li> Stoppen Sie die Schubspannung durch Abschalten der Spritzenpumpe, erwerben 2-3 zusätzliche Bilder und beenden Sie den Bildaufnahme-Sequenz auf die Software. </li><li> Dann entfernen Sie den &quot;exit&quot;-Schlauch erste und sorgfältig zu vermeiden, das Leeren des Kanals und fügen Sie dann vorgewärmte frisches Medium in die Vertiefungen vor dem Entfernen der &quot;entry&quot;-Schlauch zu füllen. </li><li> Zur quantitativen Bestimmung der Wirkung von Schubspannung auf bakterielle Resistenz kann eine Beschichtung Test wie folgt durchgeführt werden: collect die übrigen mittel-und waschen Sie die μ-Slide zweimal mit 120 ul PBS, die verbleibenden Medium entfernt vom Kanal (beide Waschungen werden auch gesammelt). </li><li> Lösen Sie die infizierten Zellen mit der Zugabe von 50 ul von Trypsin / EDTA für 5 Minuten bei 37 ° und mischen dieses freistehende Probe mit der Suspension in den vorherigen Schritt gesammelt. </li><li> Führen Sie serielle Verdünnungen in PBS und Platte eine 10 ul Bruchteil auf GCB Agarplatten, in dreifacher Ausfertigung, um die Anzahl der Kolonie bildenden Einheiten (KBE) auf den nächsten Tag zu bestimmen, nach der Inkubation der Platten bei 37 ° C in einem Inkubator mit 5% (v / v) CO 2. </li></ol> Videos 3 und 4 vergleichen die Wildtyp-Stamm mit der pilV Mutante. 7. Bakterielle Loslösung von Mikrokolonien <ol><li> Zellen infizieren in der Strömungskammer durch Wiederholen der Schritte 2,1 bis 2,8 und damit die Infektion für 30 Minuten gehen. </li><li> Entfernen ungebundenen Bakterien durch zunehmenden Durchfluss bis 10 dyn / cm 2 für einen Zeitraum von 2 Minuten und lassen Infektion für 2h weiter. </li><li> Durchfluss reduzieren auf 0,15 dyn / cm 2. </li><li> Jede Stunde, sammeln ein Tropfen des Mediums, die aus dem Strömungsraum. </li><li> Führen Sie serielle Verdünnungen der Proben und die Platte sie auf GCB Agarplatten. </li><li> Bestimmen Sie die Anzahl der Kolonie bildenden Einheiten (KBE) am nächsten Tag, nach Inkubation der Platten bei 37 ° C in einem Inkubator mit 5% (v / v) CO 2. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig1.jpg" /> Abbildung 1: Verschiedene Stufen eines zellulären Monoschicht, die beobachtet und gemessen werden kann in der Gegenwart fließen in das Verfahren. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig2.jpg" /> Abbildung 2: Endothelial Zellmonolayer in der Strömungskammer am Anfang eines Experiments (ohne Scherbeanspruchung). Etwa 50 Endothelzellen sind in einem sub-Monolayer organisiert. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig3.jpg" /> Abbildung 3: Grafische Darstellung der anfänglichen Anhaften von Bakterien auf der Zelloberfläche. Die Werte für die drei Felder sind angegeben, um eine Vorstellung von der Feld-zu-Feld-Variante, die zu erwarten (0044 dyn / cm 2) ist zu geben. Video 1. Visualisierung der anfänglichen Anhaften von Bakterien auf der zellulären Monoschicht als eine Funktion der Zeit (0044 dyn / cm 2). GFP-exprimierenden Bakterien sind nach der Richtung des strömenden Mediums. Der Film beschleunigt wird 60-fache, ist die wirkliche Dauer des Videos 10 Minuten. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video1.mov">Klicken Sie hier, um das Video anzuschauen.</a> Video 2. Nach anfänglichen Haftung Bakterien durften auf der Zelloberfläche vermehren für einen Zeitraum von 7 Stunden (beschleunigte 1000-fach). <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video2.mov">Klicken Sie hier, um das Video anzuschauen.</a> Video 3. Nach Proliferation auf der Zelloberfläche der Mechanikeral Widerstand von Mikrokolonien wurde durch eine Erhöhung der Schubspannung auf 10 Dyn / cm 2 für 5 Minuten, aber Wildtyp Mikrokolonien sind beständig beschleunigt 60-fach getestet. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video3.mov">Klicken Sie hier, um das Video anzuschauen.</a> Video 4. Mikrokolonien durch die pilV Mutanten gebildet werden von Durchfluss zu erhöhen (10 dyn / cm 2) gestört. Diese Mutante nicht die Umgestaltung der Plasmamembran unter Mikrokolonien induzieren und ist somit sehr empfindlich auf erhöhte Schubspannung (Video ist 60-fach beschleunigt) 5. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video4.mov">Klicken Sie hier, um das Video anzuschauen.</a>

<ol>
	<li>Mairey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+microcirculation+shear+stress+levels+determine+Neisseria+meningitidis+attachment+sites+along+the+blood-brain+barrier.">Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier.</a> J Exp Med. 203, 1939-1950 (2006).</li><li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+Principles+of+Vascular+Beds.">Design Principles of Vascular Beds.</a> Circ Res. 77, 1017-1023 (1995).</li><li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow.">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16, 31-42 (2009).</li><li>Tissot, O., Pierres, A., Foa, C., Delaage, M., Bongrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motion+of+cells+sedimenting+on+a+solid+surface+in+a+laminar+shear+flow.">Motion of cells sedimenting on a solid surface in a laminar shear flow.</a> Biophys J. 61, 204-215 (1992).</li><li>Mikaty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+bacterial+pathogen+induces+host+cell+surface+reorganization+to+resist+shear+stress.">Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress.</a> PLoS Pathog. 5, e1000314-e1000314 (2009).</li><li>Chamot-Rooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+modification+of+pili+upon+cell+contact+triggers+N.+meningitidis+dissemination.">Posttranslational modification of pili upon cell contact triggers N. meningitidis dissemination.</a> Science. 331, 778-782 (2011).</li><li>Soyer, M., Dum&#237;nil, G., Christodoulides, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesion+under+shear+stress.">Bacterial adhesion under shear stress.</a> Neisseria meningitidis: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). , (2011).</li><li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesion+to+target+cells+enhanced+by+shear+force.">Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force.</a> Cell. 109, 913-923 (2002).</li><li>Tchesnokova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-enhanced+binding+of+intestinal+colonization+factor+antigen+I+of+enterotoxigenic+Escherichia+coli.">Shear-enhanced binding of intestinal colonization factor antigen I of enterotoxigenic Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 76, 489-502 (2010).</li><li>Konto-Ghiorghi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+role+for+pilus+in+adherence+to+epithelial+cells+and+biofilm+formation+in+Streptococcus+agalactiae.">Dual role for pilus in adherence to epithelial cells and biofilm formation in Streptococcus agalactiae.</a> PLoS Pathog. 5, e1000422-e1000422 (2009).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Bedeutung der Schubspannung und in der Regel von mechanischen Aspekte in der Biologie wird zunehmend anerkannt. Zum Beispiel die stark angepasst Hafteigenschaften der Selektin-Familie von Proteinen in den Prozess der Lymphozyten Haftung und rollt auf der Gefäßwand hat durch die Einführung von Schubspannung in den Prozess erkannt worden. Das oben beschriebene Verfahren wurde auf die Gram-negative Bakterien Neisseria meningitidis aufgebracht, sondern sollte auch für ein breites Spektrum von Krankheitserregern. Die Bedeutung der Schubspannung wurde auch für andere Krankheitserreger und andere Infektionen Seiten im Browser angezeigt. Bakterielle Adhäsion durch Schubspannung bedingt durch das Studium der FimH Adhäsin auf uropathogene Escherichia coli (UPEC) 9 gefunden beschrieben worden. Ähnlich wie Selektine, die Interaktion zwischen FimH und seine Host-Zell-Rezeptor wurde gezeigt, dass durch Scher-induzierte mechanische Kräfte 9 und die CFAE Adhäsin von enterotoxische E.coli gestärkt werden wurde auch die Haftung auf intestinalen Epithelzellen vermitteln über eine scherabhängige gemeldet Mechanismus 10. Wir berichteten, mit dem Laminar-Flow-Kammer-Assay-Protokoll in diesem Kapitel, dass Streptococcus agalactiae Pili essentiell für die Einhaltung dieses Erregers an Epithelzellen unter Strömungsbedingungen 11 wurden beschrieben. Solche Studien bestätigen, dass unsere Flusskammer Test ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung von Wirtszell-Pathogen-Interaktionen unter den Bedingungen der Schubspannung ist.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> μ-Slide VI 0,4 Flow Kit </td><td> Ibidi </td><td> 80606 </td></tr><tr><td> Spritze Plastipak 50 ml Luer-Lock </td><td> Becton Dickinson </td><td> 300865 </td></tr><tr><td> Tygon Schlauch R3603 3,2 x 4,8 mm </td><td> Fisher-Scientific </td><td> R3603 </td></tr><tr><td> 3-Wege-Hahn, 2 weibliche Luer zu männlichen Luer </td><td> Bio-Rad </td><td> 7328103 </td></tr><tr><td> Spritzenpumpe </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PHD 2000 </td></tr><tr><td> Inverse Mikroskop Nikon </td><td> Nikon </td><td> Eclipse-T i </td></tr><tr><td> CCD-Kamera </td><td> Hamamatsu </td><td> ORCA 285 CCD oder ORCA 3-CCD </td></tr><tr><td> ImageJ-Software </td><td> NIH </td><td> Freeware ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) </td></tr></tbody></table>

introducing shear stress in the study of bacterial adhesion

Während bakterielle Infektionen eine Folge von Wechselwirkungen zwischen Erreger und seinem Wirt. Bakterielle Adhäsion an der Zelloberfläche ist oft der erste und entscheidende Schritt der Pathogenese. Obwohl experimentell Haftung ist vor allem in statischen Bedingungen untersucht Haftung tatsächlich erfolgt in Anwesenheit von Flüssigkeit. Erste Begegnungen zwischen Bakterien und ihren Wirt oft an der Schleimhaut auf, Mund, Lunge, Darm, Auge, etc., wo Schleim fließt entlang der Oberfläche von Epithelzellen auftreten. Später in Infektion Erreger gelegentlich auf die Durchblutung verursacht lebensbedrohliche Krankheiten wie Blutvergiftung, Sepsis und Meningitis. Ein bestimmendes Merkmal dieser Infektionen ist die Fähigkeit dieser Erreger mit Endothelzellen in Anwesenheit von zirkulierenden Blut interagieren. Die Anwesenheit von strömenden Flüssigkeit, Schleim oder Blut zum Beispiel fest, Haftung, weil es eine mechanische Kraft auf den Erreger erzeugt. Zur Charakterisierung der Wirkung von strömenden Flüssigkeit man in der Regel bezieht sich auf den Begriff der Schubspannung, die Tangentialkraft pro Flächeneinheit durch eine Flüssigkeit bewegt in der Nähe einer stationären Wand, in dyn / cm 2 ausgedrückt ausgeübt wird. Die Intensitäten der Schubspannung variieren stark je nach den verschiedenen Schiffen Art, Größe, Orgel, Standort etc. (0-100 dyn / cm 2). Circulation in Kapillaren können sehr geringe Scherbeanspruchung Werte und auch nur vorübergehend während der Perioden zwischen wenigen Sekunden bis zu mehreren Minuten 1 zu stoppen. Am anderen Ende des Spektrums Schubspannung in Arteriolen können bis zu 100 dyn / cm 2 2. Die Auswirkungen der Schubspannung auf verschiedene biologische Prozesse wurde deutlich, wie zum Beispiel während der Interaktion von Leukozyten mit dem Endothel 3 gezeigt. Zur Berücksichtigung dieser mechanischen Parameter in den Prozess der bakteriellen Adhäsion nutzten wir ein experimentelles Verfahren auf die Verwendung einer Einweg-flow Kammer 4 auf. Wirtszellen werden in der Strömungskammer gewachsen und fluoreszierende Bakterien sind in der Strömung durch eine Spritzenpumpe kontrolliert eingeführt. Wir haben uns zunächst konzentrieren unsere Untersuchungen auf die bakterielle Erreger Neisseria meningitidis, ein Gram-negative Bakterium verantwortlich für Sepsis und Meningitis. Das hier beschriebene Verfahren erlaubt es uns, die Auswirkungen der Schubspannung auf die Fähigkeit der Bakterien zur Studie: haften die Zellen 1, um die Zelle Oberfläche 5 vermehren und zu lösen, um neue Standorte 6 (Abb. 1) zu besiedeln. Ergänzende technische Informationen finden Sie in Hinweis 7 zu entnehmen. Schubspannung Werte hier vorgestellten wurden auf der Grundlage unserer bisherigen Erfahrungen 1 und die Werte in der Literatur gefunden repräsentieren gewählt. Das Protokoll sollte für eine breite Palette von Erregern mit speziellen Anpassungen je nach Zielsetzung der Studie.

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Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Während der Infektion Prozess ist ein wichtiger Schritt der Adhäsion der Erreger mit Wirtszellen. In den meisten Fällen diese Haftung Schritt erfolgt in Gegenwart von mechanischer Beanspruchung durch fließende Flüssigkeit erzeugt. Wir beschreiben eine Technik, die Schubspannung führt als ein wichtiger Parameter bei der Untersuchung der bakteriellen Adhäsion.

Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.6K Aufrufe.  INSERM U970. Während der Infektion Prozess ist ein wichtiger Schritt der Adhäsion der Erreger mit Wirtszellen. In den meisten Fällen diese Haftung Schritt erfolgt in Gegenwart von mechanischer Beanspruchung durch fließende Flüssigkeit erzeugt. Wir beschreiben eine Technik, die Schubspannung führt als ein wichtiger Parameter bei der Untersuchung der bakteriellen Adhäsion.

Serie: Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

In-vitro-Assay der bakteriellen Adhäsion auf Mammalian Epithelzellen

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood vessels resulting in vascular leak, the development of purpuric rashes and eventual tissue necrosis. Studying the pathogenesis of this infection was previously limited by the human specificity of the bacteria, which makes in vivo models difficult. In this protocol, we describe a humanized model for this infection in which human skin, containing dermal microvessels, is grafted onto immunocompromised mice. These vessels anastomose with the mouse circulation while maintaining their human characteristics. Once introduced into this model, N. meningitidis adhere exclusively to the human vessels, resulting in extensive vascular damage, inflammation and in some cases the development of purpuric rash. This protocol describes the grafting, infection and evaluation steps of this model in the context of N. meningitidis infection. The technique may be applied to numerous human specific pathogens that infect the blood stream.

Neisseria meningitidis is a human specific pathogen that infects blood vessels. In this protocol human microvessels are introduced into a mouse by grafting human skin onto immunocompromised mice. Bacteria adhere extensively to the human vessels, leading to vascular damage and development of the purpuric rash typically observed in human cases.

Humanisierten Maus-Modell, um bakterielle Infektionen Studieren Targeting der Mikrogefäß

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Ein Flow-Assay zur Haftung Leukozyten-Rekrutierung Human Lebersinus Endothel unter den Bedingungen der Schubspannung Studieren

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

Statische Haftung Assay für das Studium der Integrin-Aktivierung in T-Lymphozyten

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Generation und Multi-phänotypischen High-Content-Screening<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon-Mutanten

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In-vitro- und In-vivo-Modell, um die bakterielle Adhäsion an der Gefäßwand unter Strömungsbedingungen Studieren

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H2O2 into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H2O2 compared to a no H2O2 control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H2O2. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

Verfahren zur Inhibierung Bakterielle Pyomelanin Produktion und Bestimmen der entsprechenden Erhöhung der Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Test der Haftung unter Scherspannung für das Studium der T-Lymphozyten-Adhäsions-Molekül-Wechselwirkungen

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin acquisition at the bacterial cell surface plays in resistance to the host immune system. Flow cytometry experiments identified human plasma vitronectin as a ligand for the bacterial receptor outer membrane protein H of Haemophilus influenzae type f. An enzyme-linked immunosorbent assay was employed to characterize the protein-protein interactions between purified recombinant protein H and vitronectin, and binding affinity was assessed using bio-layer interferometry. The biological importance of the binding of vitronectin to protein H at the bacterial cell surface in evasion of the host immune response was confirmed using a serum resistance assay with normal and vitronectin-depleted human serum. The importance of vitronectin in bacterial adherence was analyzed using glass slides with and without vitronectin coating, followed by Gram staining. Finally, bacterial adhesion to human alveolar epithelial cell monolayers was investigated. The protocols described here can be easily adapted to the study of any bacterial species of interest.

This report describes protocols for characterizing interactions between bacterial outer membrane proteins and the human complement regulator vitronectin. The protocols can be used to study the binding reactions and biological function of vitronectin in any bacterial species.

Assays für die Untersuchung der Rolle von Vitronectin in bakterielle Adhäsion und Serum-Widerstand

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of infected cells, including organelle ultrastructure, cytoskeletal network organization, as well as cellular processes such as Stress Granule (SG) formation. The characterization of how pathogens subvert host processes is an important and integral part of the field of pathogenesis. While variable phenotypes may be readily visible, the precise analysis of the qualitative and quantitative differences in the cellular structures induced by pathogen challenge is essential for defining statistically significant differences between experimental and control samples. SG formation is an evolutionarily conserved stress response that leads to antiviral responses and has long been investigated using viral infections1. SG formation also affects signaling cascades and may have other still unknown consequences2. The characterization of this stress response to pathogens other than viruses, such as bacterial pathogens, is currently an emerging area of research3. For now, quantitative and qualitative analysis of SG formation is not yet routinely used, even in the viral systems. Here we describe a simple method for inducing and characterizing SG formation in uninfected cells and in cells infected with a cytosolic bacterial pathogen, which affects the formation of SGs in response to various exogenous stresses. Analysis of SG formation and composition is achieved by using a number of different SG markers and the spot detector plug-in of ICY, an open source image analysis tool.

We describe a method for the qualitative and quantitative analysis of stress granule formation in mammalian cells after the cells are challenged with bacteria and a number of different stresses. This protocol can be applied to investigate the cellular stress granule response in a wide range of host-bacterial interactions.

Immunfluoreszenzanalyse der Stressgranulat-Bildung nach bakterieller Herausforderung von Säugetierzellen

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...