Name: in vitro analysis of myd88-mediated cellular immune response to west nile virus mutant strain infection
Uploaded: 2014-11-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
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This work was supported by NIH grants to T.W. (R01AI072060 and R01AI099123). G. Xie was supported by a Sealy Center for Vaccine Development Predoctoral Fellowship. We thank Dr. Richard Flavell (Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, New Haven) and Dr. Shizuo Akira (Osaka University, Japan) for providing the MyD88&#8211;/&#8211; mice and Dr. Y Cong (UTMB, Galveston) for providing OTII transgenic mice.

Alle Tierversuche wurden von der Animal Care und Verwenden Committee an der Universität Texas der medizinischen Niederlassung zugelassen. 1. Isolierung von DCs, die aus Nicht-Infizierte und WNV-infizierten Mäuse <ol><li> Alters- und geschlechts Spiel 6-10 Wochen alten Wildtyp C57BL / 6 (B6) und MyD88 - / - Mäusen. Inokulieren intraperitoneal (ip) mit 500 plaquebildenden Einheit (PFU) von WNV NS4B- P38G Mutante. Am Tag 3 nach der Infektion einschläfern B6 und MyD88 - / - Mäuse mit CO 2. Verwendung von nicht-infizierten Mäusen beider Gruppen als Kontrollen. Verwenden Sie drei Mäuse aus jeder Gruppe. </li><li> Nasses Fell auf der linken Seite geopfert Maus mit 70% Ethanol und das Fell weggeschnitten an der linken Seite der Maus, etwa auf halbem Weg zwischen der Vorder- und Hinterbeine. Schneiden Sie die Körperhöhle. Entfernen Sie die Milz mit Hilfe der Pinzette. Legen Sie die Milz in einer Petrischale mit RPMI. </li><li> Isolieren Milz DCs durch die Verwendung anti-CD11c magnetische Kügelchen nachAnweisungen des Herstellers. </li></ol> 2. Reinigung und Kennzeichnung von T-Zellen von OTII transgenen Mäusen <ol><li> Ernte eine Milz aus einer naiven OTII Maus, wie in Schritt 1.2 oben beschrieben und Homogenisierung der Milz zwischen den mattierten Enden von zwei Folien. Übertragen der Zellsuspension in ein 15 ml konisches Röhrchen, fügen RPMI-Medium bis zu 14 ml. Lassen die Suspension 5 min stehen und übertragen 13 ml in ein neues 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Isolieren Milz CD4 + T-Zellen unter Verwendung eines CD4 + T-Zell-Isolierungskits nach den Angaben des Herstellers. </li><li> Transfer-Zellen in einem 50 ml konischen Röhrchen zweimal mit PBS waschen. Zellen in PBS mit 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) auf 1 x 10 6 Zellen pro ml und mit 0,5 &amp; mgr; mol / ml CFSE. Bei 37 ° C für 10 min, vor Licht geschützt. </li><li> 5 ml kalter Vollmedium (RPMI-1640 mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, 1/100 VolAntibiotika / Antimykotika, 1/100 Vol L-Glutamin und 1 / 1.000 Vol 1000 · 2-Mercaptoethanol). </li><li> Inkubieren auf Eis für 5 min. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS, fix 0,2 x 10 6 beschriftet CD4 + T-Zellen in 2% PFA und erwerben mit einem Durchflusszytometer. Verwenden Sie dieses Beispiel, um das Grundniveau der CFSE bestimmen. Resuspendieren den Rest der markierten Zellen in Vollmedium. </li></ol> 3. Co-Kultur OTII T-Zellen mit DCs von WNV-infizierten Mäuse <ol><li> Kultur 2 x 10 5 gereinigten CD4 + T-Zellen von Mäusen OTII allein oder mit gereinigtem DCs von Wildtyp- oder MyD88 - / - Mäusen (2 x 10 4) in einer Platte mit 24 Vertiefungen mit oder ohne OVA 323-339 Rückstand (1 g / ml) in 1 ml Vollmedium pro Vertiefung. </li><li> Zellen bei 37 ° C für 5 Tage. Ernten Sie die Zellen, waschen zweimal in FACS-Puffer (PBS mit 1% FBS) und befestigen Sie in 0,25 ml 2% PFA. Vortex sofort. </li></ol> 4. Durchflusszytometrie Analyse der In-vitro-&lt;/ Em&gt; T-Zell-Priming <ol><li> Zur Erfassung, doppelklicken Sie auf die Durchflusszytometrie Software-Symbol. Bei einer Dichte von linearen Plot FSC-A vs. lineare SSC-A, wählen Sie die Kanäle 0 bis 200.000 auf FSC-A und 0 bis 200.000 auf SSC-A. Erstellen Sie dann ein Tor an lebenden Zellen (P2, siehe 1A). </li><li> Um die Fluoreszenzintensität von CFSE analysieren, öffnen Sie das Histogramm für die FL1-Kanal und erhalten 20.000 Events auf der gated Bevölkerung. Eine Markierung auf Samples für OTII Zellen alleine kultiviert (1A). </li><li> Erwerben Sie Proben für OTII Zellen co-kultiviert mit Wildtyp-DC (1B) oder MyD88 - / - DCs (1C) in ähnlicher Weise. </li></ol> 5. Isolierung und Stimulation von Splenozyten für Zytokin-Assays <ol><li> Infect B6 und MyD88 - / - Mäuse mit WNV NS4B-P38G Mutante mit dem gleichen Verfahren wie in ste beschriebenp 1,1. Am Tag 30 nach der Infektion erneut Herausforderung überlebenden Mäuse mit 2000 PFU des Wildtyp-Stamms WNV ip An den Tagen 8 und 21 nach der primären WNV-Infektion oder am Tag 4 nach Sekundärinfektion, einschläfern Mäuse mit CO 2 für die Sammlung von Milz . HINWEIS: Es wird verwendet, 2-3 Mäuse pro Gruppe für jeden Zeitpunkt. </li><li> Einen Einzelzellsuspension von Milzzellen wie oben in Schritt 1.2 &amp; Schritt 2.2. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer und resuspendieren sie in 10 ml Vollmedium. </li><li> Verdünnte Zellen mit komplettem Medium auf 2,5 x 10 6 Zellen / ml. 1 ml der Splenozyten in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Um CD8 + -T-Zellen zu simulieren, verdünnter WNV spezifischen NS4B und E Peptide (SSVWNATTA und IALTFLAV) auf 1 mg / ml in DMSO. Zur Stimulation von CD4 + T-Zellen, verdünnter WNV spezifischen NS3 und E Peptide (RRWCFDGPRTNTILE und PVGRLVTVNPFVSVA) auf 1 mg / ml in DMSO. Zugabe von 10 ul der Peptide an die Zellen followed von 1 ul Brefeldin A-Lösung. Verwenden Zellen ohne Peptide Behandlung als Kontrolle. Mischen Sie die Zellen. </li><li> Stanzen zwei Löcher mit einem 18 G-Nadel in die Kappe der Röhre. Zellen bei 37 ° C für 5 Stunden. </li></ol> 6. Die intrazelluläre Zytokin-Färbung <ol><li> Übertragungszellen in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Spin-Zellen für 5 Minuten bei 300 bis 400 · g und abgießen Stand. 1 ml FACS-Puffer, Spin 5 min bei 300 bis 400 · g und resuspendieren Zellen durch Pipettieren mit 120 ul FACS-Puffer. </li><li> Add 2 ul Fc-Blocker und inkubieren Zellen bei Raumtemperatur für 10 min. 1 ml FACS-Puffer zu jedem Röhrchen. Spin 5 min bei 300 bis 400 x g. </li><li> Resuspendieren Zellen in 300 &amp; mgr; l FACS-Puffer und unterteilt sie in drei Rohre (etwa 0,8 x 10 6 Zellen pro Röhrchen). Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, behalten die erste Röhre jeder Kulturbedingung für Ratten-IgG-PE-Färbung. Der zweiten Röhre, werden 3 ul anti-CD4 APC an CD4-Peptiden behandelten Zellen, 3 μl anti-CD8-FITC an CD8 Peptiden behandelten Zellen oder beide Antikörper zu Zellen ohne Peptide Behandlung. Verwenden Sie die dritte Röhre auf Ersatz Färbung. Für jede Kulturbedingungen, verwenden Sie drei Röhren von Zellen mit APC-konjugiertem CD4 FITC-konjugiertem CD8 oder PE-markierten CD3-Antikörper allein (3 ul pro Röhrchen) als Entschädigung Steuerungen für FL1, FL2 und FL4 Kanäle gefärbt. </li><li> Wirbelzellen kurz. Lassen Sie auf Eis für 20 Minuten und vor Licht schützen. Fügen Sie 1,4 ml FACS-Puffer. Spin 5 min bei 300 bis 400 · g und abgießen Stand. </li><li> Geschwenkt, um den Zellpellet (oder kurz Vortex) zu stören. Re-suspend Zellpellet in 250 ul Fixierung / Permeabilisierung solutionby Pipettieren. Inkubation bei Raumtemperatur für 20 Minuten und vor Licht schützen. </li><li> Fügen Sie 1,2 ml FACS-Puffer. Spin 5 min bei 300 bis 400 · g und resuspendieren Zellen in 300 ul FACS-Puffer. HINWEIS: An diesem Punkt können die Zellen an einen BL2 Labor zur weiteren Verarbeitung in einem Kühlschrank vor Licht u übertragen oder gespeichert und geschütztp bis drei Tage. </li><li> Fügen Sie 500 ul FACS-Puffer. Spin 5 min bei 300 bis 400 · g und resuspendieren Zellen in 500 ul 1x Permeabilisierung / Waschpuffer. Spin 5 min bei 300-400 &amp; times; g. </li><li> Re-suspend Zellen in 100 ul 1x Perm / Wash, fügen 3,5 ul anti-IFN-PE auf das Rohr zuvor mit Antikörpern für CD4 und / oder CD8-T-Zellmarker in Schritt 6.3 und 3.5 ul Ratten-IgG-PE in der Röhre vorbehalten hinzugefügt IgG-Steuerung für 25 Minuten auf Eis und vor Licht schützen. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1,4 ml 1x Permeabilisierung / Waschpuffer. Spin 5 min bei 300-400 &amp; times; g. Wiederholen Sie den Waschvorgang durch Zugabe von 1,4 ml 1x Permeabilisierung / Waschpuffer. </li><li> Spin 5 min bei 300 bis 400 · g und dekantieren Stand. Wash-Zellen durch Zugabe von 1,4 ml FACS-Puffer und resuspendieren in 400 &amp; mgr; l FACS-Puffer für die endgültige Übernahme. </li></ol> 7. Durchflusszytometrie Analyse der intrazellulären Zytokin-Färbung <ol><li> Verwenden Sie die gleichen Erfassungseinstellungen wie in Schritt 4.1. Create ein Gatter an lebenden Zellen (P2, siehe 2A). Stellen Sie die Spannung über die Entschädigung Rohre für jede Gruppe. </li><li> Öffnen Sie zwei neue Dot-Plots, ein, um Daten für FL1 vs gesammelt anzuzeigen. FL2 (CD8 vs. IFN-γ), und die andere ist, um Daten für FL4 vs gesammelt wurden. FL2 (CD4 vs. IFN-γ). Erwerben 50.000 Veranstaltungen für die geschlossene Bevölkerung von jeder Probe. </li></ol>

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	<li>Campbell, G. L., Marfin, A. A., Lanciotti, R. S., Gubler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=West+Nile+virus.">West Nile virus.</a> Lancet Infect. Dis. 2, 519-529 (2002).</li><li>Welte, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+an+attenuated+West+Nile+virus+NS4B-P38G+mutant+strain.">Immune responses to an attenuated West Nile virus NS4B-P38G mutant strain.</a> Vaccine. 29, 4853-4861 (2011).</li><li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+control+of+the+adaptive+immune+responses.">Toll-like receptor control of the adaptive immune responses.</a> Nat. Immunol. 5, 987-995 (2004).</li><li>Akira, S., Hemmi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+pathogen-associated+molecular+patterns+by+TLR+family.">Recognition of pathogen-associated molecular patterns by TLR family.</a> Immunol. Lett. 85, 85-95 (2003).</li><li>Xie, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+West+Nile+virus+NS4B-P38G+mutant+strain+induces+adaptive+immunity+via+TLR7-MyD88-dependent+and+independent+signaling+pathways.">A West Nile virus NS4B-P38G mutant strain induces adaptive immunity via TLR7-MyD88-dependent and independent signaling pathways.</a> Vaccine. 31 (38), 4143-4151 (2013).</li><li>Fang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gammadelta+T+cells+promote+the+maturation+of+dendritic+cells+during+West+Nile+virus+infection.">gammadelta T cells promote the maturation of dendritic cells during West Nile virus infection.</a> FEMS Immunol. Med. Microbiol. 59, 71-80 (2010).</li><li>Silva, M. C., Guerrero-Plata, A., Gilfoy, F. D., Garofalo, R. P., Mason, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+activation+of+human+monocyte-derived+and+plasmacytoid+dendritic+cells+by+West+Nile+virus+generated+in+different+host+cells.">Differential activation of human monocyte-derived and plasmacytoid dendritic cells by West Nile virus generated in different host cells.</a> J. Virol. 81, 13640-13648 (2007).</li><li>Shrestha, B., Samuel, M. A., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+Cells+Require+Perforin+To+Clear+West+Nile+Virus+from+Infected+Neurons.">CD8+ T Cells Require Perforin To Clear West Nile Virus from Infected Neurons.</a> J. Virol. 80, 119-129 (2006).</li><li>Wang, Y., Lobigs, M., Lee, E., Mullbacher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+cells+mediate+recovery+and+immunopathology+in+West+Nile+virus+encephalitis.">CD8+ T cells mediate recovery and immunopathology in West Nile virus encephalitis.</a> J. Virol. 77, 13323-13334 (2003).</li><li>Plebanski, M., Katsara, M., Sheng, K. C., Xiang, S. D., Apostolopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+measure+T-cell+responses.">Methods to measure T-cell responses.</a> Expert Rev. Vaccines. 9, 595-600 (2010).</li><li>Lyons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysing+cell+division+in+vivo+and+in+vitro+using+flow+cytometric+measurement+of+CFSE+dye+dilution.">Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution.</a> J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).</li><li>Kraus, A. A., Priemer, C., Heider, H., Kruger, D. H., Ulrich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+Hantaan+virus-containing+samples+for+subsequent+investigations+outside+biosafety+level+3+facilities.">Inactivation of Hantaan virus-containing samples for subsequent investigations outside biosafety level 3 facilities.</a> Intervirology. 48, 255-261 (2005).</li><li>Saxena, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hamster-derived+west+nile+virus+isolate+induces+persistent+renal+infection+in+mice.">A hamster-derived west nile virus isolate induces persistent renal infection in mice.</a> PLoS Negl. Trop. Dis. 7, 2275 (2013).</li><li>Welte, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vgamma4++T+cells+regulate+host+immune+response+to+West+Nile+virus+infection.">Vgamma4+ T cells regulate host immune response to West Nile virus infection.</a> FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 183-192 (2011).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

WNV ist ein BL3 Erregers. Aufgrund von Sicherheitsbestimmungen oder immunologische Assays mit WNV-infizierten Proben werden oft durch die Verfügbarkeit von Ausrüstung an BL3 Einrichtungen oder mehr langwierig und mühsam auszuführen beschränkt. In einer aktuellen Studie verwendeten wir zwei Durchflusszytometrie basierenden Verfahren zur zellvermittelten Immunreaktionen beim WNV-Infektion 5 untersuchen. In beiden Tests wurden WNV-infizierten Zellen, die mit 1-2% PFA direkt oder mit Fixierung / Permeabilisi...

West-Nil-Virus (WNV), einem neurotropen plus-spürte Flavivirus, ist eine neue Bedrohung der öffentlichen Gesundheit. Derzeit sind keine Impfstoffe für den menschlichen Gebrauch 1 zugelassen. Attenuiertes WNV-Stamm, der eine P38G Substitution in der nicht-strukturellen (NS) 4B Protein, ist dafür bekannt, keine Letalität in Mäusen, aber höher angeborenen Zytokine und T-Zell-Antworten in Mäusen als Wildtyp WNV NY99-Stamm 2 induzieren. Mäuse, die mit der NS4B-P38G Mutante immunisiert wurden alle von einem sekundären Herausforderung mit tödlichen Wildtyp WNV geschützt. Dies deutet darauf hin, dass der NS4B-P38G Mutante geeigneten Eigenschaften für einen optimalen Impfstoffkandidaten. Die Mechanismen, mit denen die NS4B-P38G Mutante induziert hohe Schutz adaptiven Immunität noch nicht genau geklärt. Toll-like Rezeptoren (TLR), die pathogen-associated molecular patterns erkennen, spielen eine wesentliche Rolle bei der Initiierung der angeborenen Immunität zu Virusinfektion. Der Kern TLR-Signalweges nutzt myeloische Differenzierung primäre Antwort gene 88 (MyD88) als primärer Adapter 3,4. In einer neueren Studie wurde MyD88 Signalisierungs gezeigt, eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von zellvermittelter Immunität während WNV NS4B- P38G Mutante Infektion bei Mäusen 5 zu spielen. Dendritische Zellen (DCs) sind eines der wichtigsten Antigen-präsentierenden Zellen die einzigartige Fähigkeit, primären T-Zell-Reaktionen während der viralen Infektion zu initiieren 6,7 aufweist. CD4 + und CD8 + T-Zellen sowohl für langanhaltende schützende Immunität bei und sind wichtig für die Host-Überlebensrate nach Wildtyp WNV Infektion 8,9. Zwei immunologischen Assays wurden in dieser Studie verwendet, um die Funktionen dieser Zellen in der NS4B-P38G Mutante infizierten Mäusen zu beurteilen. Zunächst wurde ein in vitro-T-Zell-Priming-Assay verwendet, um die Antigen-präsentierende Fähigkeit der DCs von WNV-infizierten Wildtyp-MyD88 und Vergleichen - / - Mäusen. Um die Empfindlichkeit des Assays, naive CD4 &lt;erhöhensup&gt; + T-Zellen wurden aus OTII transgenen Mäusen, die eine Vα2 / Vβ5 TCR spezifisch für das Hühner-Ovalbumin (OVA) Peptid exprimieren 323 isoliert - 339. DCs von WNV infizierten Mäusen wurden aufgereinigt und co-kultiviert mit Carboxyfluorescein Succinimidyl Ostern (CFSE ) -markierten CD4 + T-Zellen in Gegenwart von OVA-Peptid. Nach 5 Tagen gemeinsamer Kultur wurden die Zellen geerntet und mit Paraformaldehyd (PFA) fixiert und durch Durchflusszytometrie analysiert. Proliferationsassays wurden traditionell durch Einbau von 5-Brom-2&#39;-desoxyuridin (BrdU) oder tritiiertem Thymin desoxyribosid (3 HTdR) 10 durchgeführt. Dennoch sind diese Assays entweder radioaktive und / oder benötigen spezielle Ausrüstungen der Sicherheitsstufe (BL) 3 Anlagen, wo WNV Studien durchgeführt werden. Die durchflusszytometrische Analyse von Lymphozyten-Proliferation durch serielle Halbierung der Fluoreszenzintensität des Vitalfarbstoffs CFSE geworden üblicherweise in immunologischen Assays verwendet werden, wie der Farbstoff stabilerund gleichmäßig in Zellen eingebaut, leicht durch Flusszytometrie nachgewiesen und ist nicht-radioaktiven 11. Der Test hat auch die Fähigkeit, die Anzahl der Zellteilungen zu beurteilen. Ein wesentlicher Vorteil der Verwendung dieser Assays in WNV Studien ist, dass die Fixierung der infizierten Zellen mit 1-2% PFA könnte WNV 12, die Probennahme mit einem Durchflußzytometer in einen BL2 Labor ermöglichen inaktivieren. Als nächstes wurde ein modifiziertes intrazellulärem Zytokinfärbung (ICS) Verfahren verwendet, um die Rolle von MyD88 Signalisierung in der Regulation der WNV spezifische T-Zellantworten in NS4B-P38G Mutante infizierten Mäusen untersucht. In diesem Test wurden Splenozyten aus infizierten Mäusen isoliert in vitro mit WNV spezifischen Peptiden behandelt. Brefeldin A wurde zugegeben, um die Cytokine in der Zelle zurückzuhalten. Nach 5 h Inkubation wurden die Zellen geerntet, gewaschen und für die T-Zell-Subpopulationen gefärbt. Die Zellen wurden dann in PFA fixiert, permeabilisiert und für Interferon (IFN) -γ gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert.Wie bei anderen auf Basis der Durchflusszytometrie-Assay, nachdem die Zellen mit Fixierung und Permeabilisierung Puffer mit PFA behandelten, infizierten Proben können auf eine BL2 Labor zur weiteren Verarbeitung und Analyse übertragen. In mehreren veröffentlichten Studien haben wir ICS verwendet, um T-Zell-Effektorfunktionen in WNV-infizierten Mäusen 13,14 messen. Obwohl es gut etabliert ist, ist einen großen Nachteil dieses Tests, dass das Verfahren ist sehr langwierig und könnte mehr Zeit in Anspruch, wenn sie innerhalb BL3 Einrichtungen durchgeführt werden. Hier wurde ein Mikrozentrifugenröhrchen Basis ICS Verfahren gezeigt, dass mehr möglich ist, leichter zu gehen und weniger zeitaufwendig, wenn sie innerhalb einer BL3 Labor.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875</td><td>warm up at 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>anti-CD11c magnetic beads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-001</td><td>follow the manufacturer&amp;rsquo;s instructions</td></tr><tr><td>anti-CD4 magnetic beads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-248</td><td>follow the manufacturer&amp;rsquo;s instructions</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>OVA residue 323-339</td><td>Genscript Corporation</td><td>RP10610</td><td></td></tr><tr><td>Peptides</td><td>Proimmune</td><td>PC0AD-D</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A solution</td><td>BD Bioscience</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Fc Blocker</td><td>e-Bioscience</td><td>14-0161-85</td><td></td></tr><tr><td>APC-conjugated CD4</td><td>e-Bioscience</td><td>17-0041-81</td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated CD8</td><td>e-Bioscience</td><td>11-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>Fixation/Permeabilization Solution</td><td>BD-Bioscience</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>Permeabilization/wash buffer</td><td>BD-Bioscience</td><td>554723</td><td></td></tr><tr><td>anti-IFN&amp;gamma;-PE</td><td>e-Bioscience</td><td>12-7311-82</td><td></td></tr><tr><td>Accuri flow cytometer</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro analysis of myd88-mediated cellular immune response to west nile virus mutant strain infection

Attenuiertes West Nile-Virus (WNV), eine nicht-strukturellen (NS) 4B-P38G Mutante induziert höhere angeborenen Cytokin und T-Zell-Antworten als die Wildtyp-WNV in Mäusen. Vor kurzem myeloischer Differenzierungsfaktor 88 (MyD88) Signalisierung wurde gezeigt, während WNV NS4B-P38G mutierte Infektion wichtig für erste T-Zell-Priming und Gedächtnis-T-Zell-Entwicklung zu sein. In dieser Studie wurden zwei Durchflusszytometrie basierenden Verfahren - eine in vitro T-Zell-Priming-Assay und eine intrazelluläre Zytokinfärbung (ICS) - wurden verwendet, um dendritische Zellen (DCs) und T-Zell-Funktion zu bewerten. Markierten CD4 + T-Zellen von OTII transgenen Mäusen - im T-Zell-Priming-Assay wurde die Zellproliferation durch Durchflusszytometrie folgenden Co-Kultur von DCs, die aus den beiden Gruppen von Mäusen mit Carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE) analysiert. Dieser Ansatz vorgesehen eine genaue Bestimmung des Prozentsatzes von proliferierenden CD4 + T-Zellen mit deutlich verbesserten Gesamtempfindlichkeit als der Traditional-Assays mit radioaktiven Reagenzien. Ein Reaktionsgefäß-System wurde in beiden Zellkultur und Zytokin Färbeverfahren des ICS-Protokoll verwendet. Im Vergleich zum herkömmlichen Gewebekulturplatte-basierte System, das war modifiziertes Verfahren einfacher, der Sicherheitsstufe (BL) 3 Einrichtungen durchzuführen. Außerdem wurden WNV- infizierten Zellen mit Paraformaldehyd in beiden Assays, die die weitere Analyse außerhalb BL3 Einrichtungen aktiviert behandelt. Insgesamt können diese in vitro immunologischen Assays verwendet werden, um zellvermittelte Immunreaktionen beim WNV-Infektion wirksam zu beurteilen.

In der T-Zell-Priming-Assay wurden CFSE markierten CD4 + T-Zellen mit gereinigtem DCs aus der NS4B-P38G Mutante infizierten Wildtyp-MyD88 und kultiviert - / - Mäusen in der Anwesenheit oder Abwesenheit von OVA-Peptide. Markierten T-Zellen alleine mit oder ohne OVA kultiviert für 5 Tage wurden als negative Kontrollen verwendet. Wie in 1A gezeigt ist, wurden die gesamten T-Zellen für die Analyse der Fluoreszenzintensität von der FL1-Kanal torge. Die Markierung wurde auf der Grund...

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In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

In-vitro-Analyse Myd88-vermittelte zelluläre Immunantwort gegen das West-Nil-Virus-Infektion Mutantenstamm

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

in-vitro-analysis-myd88-mediated-cellular-immune-response-to-west

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

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Serie: In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human &gamma;-HVs, such as EBV and KSHV, has severely hindered detailed pathogenic studies. Murine &gamma;-herpesvirus 68 (&gamma;HV68) shares extensive genetic and biological similarities with human &gamma;-HVs and is a natural pathogen of murid rodents2. As such, evaluation of &gamma;HV68 infection of mice inbred strains at different stages of viral infection provides an important model for understanding viral lifecycle and pathogenesis during &gamma;-HVs infection.
Upon intranasal inoculation, &gamma;HV68 infection results in acute viremia in the lung that is later resolved into a latent infection of splenocytes and other cells, which may be reactivated throughout the life of the host3,4. In this protocol, we will describe how to use the plaque assay to assess infectious virus titer in the lung homogenates on Vero cell monolayers at the early stage (5 - 7 days) of post-intranasal infection (dpi). While acute infection is largely cleared 2 - 3 weeks postinfection, a latent infection of &gamma;HV68 is established around 14 dpi and maintained later on in the spleen of the mice. Latent infection usually affects a very small population of cells in the infected tissues, whereby the virus stays dormant and shuts off most of its gene expression. Latently-infected splenocytes spontaneously reactivate virus upon explanting into tissue culture, which can be recapitulated by an infectious center (IC) assay to determine the viral latent load. To further estimate the amount of viral genome copies in the acutely and/or latently infected tissues, quantitative real-time PCR (qPCR) is used for its maximal sensitivity and accuracy. The combined analyses of the results of qPCR and plaque assay, and/or IC assay will reveal the spatiotemporal profiles of viral replication and infectivity in vivo.

&#947;-Herpesviruses (&#947;-HVs) establish life-long persistency in their host. Infection of mice with &#947;-HV68 provides a genetically tractable in vivo model for the characterization of the lifecycle/pathogenesis of &#947;HVs. This protocol describes the detection and quantitation of &#947;HV68 infection at acute and latent stages following infection by plaque-forming, infectious center, and qPCR assays.

Die Messung der γHV68 Infektion bei Mäusen

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

Zergliedern Angeborene Immunsystem Signaling in Viral Evasion von Zytokin-Produktion

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Zika Virus Infectious Zellkultursystem und die<em&gt; In Vitro</em&gt; Prophylaktische Wirkung von Interferonen

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.

Influenza-A-Virus-Studien in einem Mausmodell der Infektion

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

Eine Methode zur Bewertung von Fc-vermittelten Effektor-Funktionen durch Influenza Hämagglutinin spezifische Antikörper induziert

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

Bewertung der Zika-Virus-spezifischen T-Zell-Reaktionen in Organe der Immunabwehr von infizierten Ifnar1- / - Mäusen

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Arboviren Infektionen als Screening-Tools für die Identifizierung von viralen Immunmodulatoren und Host antiviralen Faktoren

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our knowledge of prevention and treatment of viral infection. The fruit fly Drosophila melanogaster has proven to be one of the most efficient and productive model organisms to screen for antiviral factors and investigate virus-host interaction, due to powerful genetic tools and highly conserved innate immune signaling pathways. The procedure described here demonstrates a nano-injection method to establish viral infection and induce systemic antiviral responses in adult flies. The precise control of the viral injection dose in this method enables high experimental reproducibility. Protocols described in this study include the preparation of flies and the virus, the injection method, survival rate analysis, the virus load measurement, and an antiviral pathway assessment. The influence effects of viral infection by the flies' background were mentioned here. This infection method is easy to perform and quantitatively repeatable; it can be applied to screen for host/viral factors involved in virus-host interaction and to dissect the crosstalk between innate immune signaling and other biological pathways in response to viral infection.

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

This protocol describes how to establish viral infection in vivo in Drosophila melanogaster using the nano-injection method and basic techniques to analyze virus-host interaction.

Gründung der Virusinfektion und Analyse von Host-Virus-Wechselwirkung in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral load. The purpose of the procedure is to quantify viral titers in peripheral and CNS areas of the mouse at different time points post infection or under different experimental conditions to identify virologic and immunological factors that regulate Zika virus infection. The organ isolation procedures demonstrated allow for both focus forming assay quantification and quantitative PCR assessment of viral titers. The rapid organ isolation techniques are designed for the preservation of virus titer. Viral titer quantification by focus forming assay allows for the rapid throughput assessment of Zika virus. The benefit of the focus forming assay is the assessment of infectious virus, the limitation of this assay is the potential for organ toxicity reducing the limit of detection. Viral titer assessment is combined with quantitative PCR, and using a recombinant RNA copy control viral genome copy number within the organ is assessed with low limit of detection. Overall these techniques provide an accurate rapid high throughput method for the analysis of Zika viral titers in the periphery and CNS of Zika virus infected animals and can be applied to the assessment of viral titers in the organs of animals infected with most pathogens, including Dengue virus.

The goal of the protocol is to demonstrate the techniques used to investigate viral disease by isolating and quantifying Zika virus, from multiple organs in a mouse following infection.

Isolierung und Quantifizierung des Zika-Virus aus mehreren Organen in einer Maus

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation of RNA virus transmission using Wolbachia-transfected mosquitoes. Key strategies to control viruses include the manipulation of host reproduction via cytoplasmic incompatibility and the inhibition of viral transcripts via immune priming and competition for host-derived resources. However, the underlying mechanisms of the responses of Wolbachia-transfected mosquitoes to viral infection are poorly understood. This paper presents a protocol for the in vitro identification of Wolbachia infection at the nucleic acid and protein levels in Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23 cells to enhance the understanding of the interactions between Wolbachia and its insect vectors. Through the combined use of polymerase chain reaction (PCR), quantitative PCR, western blot, and immunological analytical methods, a standard morphologic protocol has been described for the detection of Wolbachia-infected cells that is more accurate than the use of a single method. This approach may also be applied to the detection of Wolbachia infection in other insect taxa.

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Four methods were used to detect intracellular Wolbachia, which complemented each other and improved the detection accuracy of Wolbachia infection of Aedes albopictus-derived Aa23 and Aa23-T&#160;cured of native Wolbachia infection using antibiotics.

Nachweis des Wolbachia-Stammes wAlbB in Aedes albopictus-Zelllinien

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation ...

In-vitro-Analyse Myd88-vermittelte zelluläre Immunantwort gegen das West-Nil-Virus-Infektion Mutantenstamm

Zusammenfassung

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