Die Autoren möchten sich Vergangenheit und Gegenwart die Mitglieder des Kim Labor, Mark Nilan für Zebrafisch-Pflege und Wartung, Dr. Robert Wheeler für hilfreiche Diskussionen und gemeinsame Nutzung von Daten zu bestätigen, und NIH Zuschüsse 3RO1GM087308-02S1 und 1P20RR024475-01A2 und die Maine Agrar-und Forst Experiment Station (Veröffentlichungsnummer 3303) für die Finanzierung.

1. Zebrafisch-Pflege und Wartung <ol><li> Haltung: Massenlaich erwachsenen Zebrafisch wie zuvor beschrieben 13. Sammeln Embryonen hervorgebracht, wie zuvor beschrieben 14. </li><li> Mikroinjektion (wenn gewünscht): microinject 1-4 Zell-Stadium Zebrafischembryonen mit Morpholino Oligonukleotiden an Genprodukten oder mRNA-Knockdown, um Gen-Produkte als überexprimieren zuvor beschrieben 15. <ol><li> Sorgen Sie für ausreichende Pool von Mock injiziert Kontrollen (mindestens 48 Leben, Mock injiziert Kontrollfische und 48 Wohn-, experimentell manipuliert Fische werden benötigt, um eine 96-Well-Mikroplatte zu füllen). </li></ol></li><li> Pflegen Embryonen: Wachsen Embryonen in tiefe Petrischalen bei 28 ° C in Wasser-Ei (60 g / ml Instant Ocean Meersalz in destilliertem Wasser autoklaviert), bis die gewünschte Entwicklungsstadium (a respiratory burst Antwort ist nicht nachweisbar mit diesem Protokoll in Zebrafischembryonen jünger als 2 Tage nach der Befruchtung 12). Hinweis: Es ist o gewesenbserved, dass die Verhinderung der Pigmentierung in Zebrafischembryos durch entweder die Verwendung von 1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU) oder golden/slc24a5 mutierten Zebrafisch nicht signifikant die Induktion von Fluoreszenz, die durch PMA (unveröffentlichte Daten, Embryonen bei 48 und 72 getestet, und 96 zu verändern hpf). <ol><li> Entfernen Sie leere Embryonen täglich mit einer Kunststofftransferpipette. </li><li> Dekantieren Sie vorsichtig altes Ei Wasser und füllt mit neuen Ei-Wasser täglich. </li></ol></li><li> Dechorionate Embryonen: Am Tag des Experiments unter Verwendung von zwei feinen Pinzette 14 (das Respiratory Burst Assay kann auch auf seziert Nieren von erwachsenen Zebrafisch 12 und ausführliche Protokolle für Nieren zuvor beschrieben durchgeführt werden dechorionate Embryonen (Embryonen, wenn noch in den Chorion), wie Präparation von erwachsenen Zebrafisch wurden bereits beschrieben 16,17) wurde. </li></ol> 2. Herstellung der Lösung <ol><li> Bereiten Sie eine Stammlösung von H2DCFDA: Wiegen Sie 1 mg H2DCFDA. <ol><li> Dissolve 1 mg H2DCFDA in 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO), um eine 1 mg / ml Stammlösung zu machen. </li><li> Machen Sie 22 ul Aliquots dieser Stammlösung in 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Wickeln Sie die Portionen von H2DCFDA Stammlösung in Aluminiumfolie und in der Dunkelheit, wann immer möglich zu halten, weil H2DCFDA ist lichtempfindlich. </li><li> Speicher H2DCFDA Aliquots bei -20 ° C für bis zu 3 Monate. </li></ol></li><li> ACHTUNG - Bereiten Sie eine Stammlösung von Phorbolmyristatacetat (PMA): Wiegen Sie 1 mg PMA über geeignete persönliche Schutzausrüstung (zB Handschuhe, Schutzbrille und Maske). <ol><li> Lösen PMA in 1 ml DMSO, um eine 1 mg / ml Stammlösung zu machen. </li><li> Machen Sie 11 ul Aliquots in 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Shop Aliquots von PMA-Stammlösung bei -80 ° C für bis zu 3 Monate. </li></ol></li><li> Bereiten Sie eine Arbeitslösung H2DCFDA: Am Tag des Versuchs, einen H2DCFDA Arbeitslösung durch Zugabe von 1 Teil H2DCFDA Stammlösung auf 1Teil DMSO (500 ug / ml H2DCFDA Endkonzentration). Fügen Sie beispielsweise 20 ul H2DCFDA Stammlösung und 20 ul DMSO auf eine Folie eingewickelt 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Bereiten Sie eine Arbeitslösung von PMA: Am Tag des Experiments, machen Sie eine PMA Arbeitslösung durch Zugabe von 1 Teil PMA-Stammlösung zu 49 Teile Nuklease freiem Wasser (20 ug / ml PMA Endkonzentration). Zum Beispiel, verdünnte 10 ul PMA-Stammlösung in 490 ul Nuklease-freies Wasser in einem 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Vorbereitung einer Dosierung von Lösung H2DCFDA: Am Tag des Experiments einen H2DCFDA Dosierungslösung mit einer Endkonzentration von 1 ug / ml in H2DCFDA Ei Wasser. Die hergestellten Volumen der Dosierungslösungen können nach Wunsch verändert werden, aber sicherzustellen, daß die Endkonzentrationen der Reagenzien gehalten. Für Nieren, anstelle von Ei-Wasser, das gleiche Volumen von Dulbecco modifiziertem Eagle-medium/F-12 (50% DMEM, 50% F-12, ohne Phenolrot). Zu 5 ml H2DCFDA machenDosierungslösung, verwenden Sie ein 5 ml serologische Pipette 5 ml Ei Wasser (oder DMEM/F-12) in einem 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen in Folie eingewickelt und mit &#39;H&#39; zu übertragen. <ol><li> Entfernen Sie 10 ul Ei Wasser (oder DMEM/F-12) aus den 15 ml konischen Röhrchen mit &#39;H&#39; und entsorgen. </li><li> In 10 ul H2DCFDA Arbeitslösung in die 15 ml konischen Röhrchen mit &#39;H&#39; und Wirbel zu mischen (diese Menge reicht für 48 Embryo oder Nierenproben (die Hälfte einer vollen 96-Well-Mikroplatten), und diese Bohrungen werden Messungen der Ebene stellen der Hintergrundfluoreszenz). </li></ol></li><li> Bereiten Sie eine Dosier-Lösung von H2DCFDA + PMA: Am Tag des Versuchs, einen H2DCFDA + PMA Dosierungslösung mit Endkonzentrationen von: H2DCFDA - 1 ug / ml und PMA - 400 ng / ml. Zu 5 ml H2DCFDA + PMA Dosierungslösung zu machen, verwenden Sie ein 5 ml serologische Pipette 5 ml Ei Wasser (oder DMEM/F-12) in ein neues 15 ml konischen Röhrchen mit &#39;H + P&#39; zu übertragen. <ol><li> Entfernen 110 _6; l Ei Wasser (oder DMEM/F-12) aus den 15 ml konischen Röhrchen mit &#39;H + P&#39; und entsorgen. </li><li> In 10 ul H2DCFDA Arbeitslösung, dann fügen Sie 100 ul PMA Arbeitslösung in die 15 ml konischen Röhrchen mit &#39;H + P&#39; und Wirbel zu mischen (diese Menge reicht für 48 Proben oder der anderen Hälfte einer vollen 96-Well-Mikroplatten ). </li></ol></li><li> Halten Sie die Dosierungslösungen auf Eis. </li></ol> 3. Mikroplatten-Reader Programmierung <ol><li> Bereiten Instruments: Schalten Sie den Mikroplatten-Reader. <ol><li> Wärmen Sie die Lichtquelle. </li><li> Stellen Sie ein Programm, um die Fluoreszenz zu lesen: zB Anregung: 485 nm, Emission: 528 nm; Optics Position: Top 510 nm, Empfindlichkeit: 65, mit einer 5 Sek. Schütteln Schritt vor dem Lese. </li></ol></li></ol> 4. 96 Well Mikroplatten-Set Up (siehe Abbildung 2) <ol><li> Sammeln Sie liefert: Erhalten Gerichte mit dechorionated Embryonen, schwarz 96 Well-Mikroplatte, Pipette und p200Tipps, Eiskübel mit H2DCFDA und H2DCFDA + PMA Dosierungslösungen, Mehrkanal-p200-Pipette zwei sterilen Behältern, Alufolie, und Schere. </li><li> Übertragung eines Embryos in jedes Well einer 96-Well-Mikroplatte: Verwenden Sie eine Schere, um eine Pipettenspitze geschnitten, daß Embryonen oder Nieren fit durch die Öffnung. <ol><li> Legen Sie ein p200-Pipette zu 100 ul und übertragen ein Embryo zusammen mit Ei Wasser (oder DMEM/F-12) in möglichst viele der Vertiefungen einer schwarzen 96-Well-Mikroplatten wie gewünscht (es ist nicht notwendig, die Pipettenspitze für jedes unterschiedliche ändern Embryo Probe innerhalb einer Versuchsanlage, aber es kann notwendig, um Tipps zwischen experimentellen Bedingungen zu ändern). Achten Sie darauf, die Übertragung zu vermeiden Rest Chorion, da diese dazu neigen, die gesammelten Daten zu verzerren. Für die Übertragung von Nieren, kann ein größeres Volumen Pipette (auf 100 ul eingestellt) verwendet werden und Pipettenspitzen geschnitten, um eine größere Bohrung erhalten werden, wenn nötig. Es kann notwendig sein, Vertiefungen ohne Embryo oder Nierenproben aufzunehmen, aber mitDie Dosierungslösungen für einige experimentelle Manipulationen zu steuern. </li></ol></li><li> In Dosierungslösungen: Gießen H2DCFDA Dosierungslösung in ein steriles 25 ml-Reservoir. <ol><li> Verwenden Sie eine Mehrkanal-Pipette und p200 acht Tipps, um gleichzeitig pipettieren 100 ul H2DCFDA Dosierung Lösung in einer Spalte auf der 96-Well-Mikroplatten (500 ng / ml Endkonzentration von H2DCFDA). </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang (wechselnde Tipps ist nicht notwendig) für so viele Spalten wie gewünscht (in der Regel sechs Spalten oder 48 Brunnen füllt, wenn eine gesamte 96-Well-Mikroplatten). Diese Lösung wird auf die Hälfte der Steuer Embryo Proben und die Hälfte der experimentell manipuliert Embryo Proben (ein Beispiel 96-Well-Mikroplatten-Einrichtung ist in Abbildung 2 dargestellt, diese Brunnen (orange gefärbt) werden Hintergrundfluoreszenz Daten in Proben nicht mit PMA induzierte Verfügung stellen) . </li><li> Gießen Sie die H2DCFDA + PMA Dosierungslösung in eine neue, sterile 25 ml-Reservoir. </li><li> Verwenden Sie eine Mehrkanal-Pipette und p200 acht Tipps, um SIMULTaneously pipettieren 100 ul H2DCFDA + PMA Dosierungslösung in die restlichen Spalten (rot in Abbildung 2) der 96-Well-Mikroplatte (wechselnde Tipps ist nicht notwendig, Endkonzentrationen von H2DCFDA-500 ng / ml und PMA-200 ng / ml) . </li></ol></li><li> Decken Sie die Mikrotiterplatte mit Aluminiumfolie. </li><li> Schütteln Sie die Mikroplatte für ca. 20 Sekunden bei 150 Umdrehungen pro Minute, um die Lösungen in jedem gut homogenisieren. </li><li> Die Mikrotiterplatte bei 28 ° C, wenn sie nicht gelesen wird. </li></ol> 5. Fluoreszenz Quantifizierung <ol><li> Lesen der Mikrotiterplatte zur Zeit = 0 Stunden nach der Zugabe von PMA mit den im Schritt 3.1.2 beschriebenen Parameter. <ol><li> Weiter Messungen alle paar Minuten für die gewünschte Zeitintervall oder inkubieren Sie die Folie eingewickelt Mikroplatten bei 28 ° C bis zu einem späteren Zeitpunkt, und dann nehmen Sie eine Endpunktmessung zu einer gewünschten Zeit (zB 4 Stunden nach der Zugabe von PMA). </li></ol></li><li> Mit einem Kunststoff transfer Pipette, um die Embryonen aus dem Brunnen holen. </li><li> Euthanize die Embryonen nach Ihren Tierpflege-und Nutzungsprotokoll, zB Eintauchen in Tricaine MS222. </li><li> Entsorgen Sie die Mikro und andere Einweg-Materialien in der biologische Abfälle zu entsorgen. </li></ol> 6. Datenanalyse <ol><li> Entscheiden Sie sich für den Zeitpunkt, an dem Sie gerne Fluoreszenzwerte (z. B. 4 Stunden nach der Zugabe von PMA, Tabelle 1) zu vergleichen. </li><li> Subtrahieren Fluoreszenzwert des Durchschnitts un-induzierte Kontrollgruppe von Fluoreszenzwerte der einzelnen PMA-induzierte Kontrollgruppe. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang für die Versuchsgruppe mit und ohne PMA. </li><li> Bewahren Sie diese normierten Fluoreszenzwerte in zwei Spalten, die Steuer + PMA-Gruppe und der experimentellen + PMA-Gruppe (Tabelle 2). </li><li> Berechnen Sie die Mittelwerte und Standardabweichungen für die normierten Fluoreszenzwerte des Steuer + PMA Group und die experimentelle + PMA-Gruppe. </li><li> Vergleichen der normierten Fluoreszenzwerte unter Verwendung eines ungepaarten t-Test statistisch signifikant (Tabelle 2) zu bestimmen. </li><li> Graph die Mittel des Steuer + PMA-Gruppe und der experimentellen + PMA Gruppe mit Fehlerbalken reflektieren die entsprechenden Standardabweichungen. </li><li> Nehmen Sie das Signifikanzniveau auf der Grafik in der Abbildung und Legende (Abbildung 2). </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die primäre Funktion der Fresszellen ist zu erkennen, zu verschlingen und zerstören Krankheitserreger. Die Fähigkeit der Phagozyten, um eine ausreichende Atem Burst zu erzeugen ist kritisch für diese Funktion. Somit ist die Quantifizierung des Respiratory Burst Reaktion ein Verfahren zum Vergleich der allgemeinen Gesundheit und der angeborenen Immunfunktion zwischen Gruppen von Individuen und / oder in Reaktion auf experimentelle Manipulationen ermöglichen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zu induzieren, zu quant...

Angeborenen und erworbenen Immunität: Das Immunsystem besteht aus zwei Zweigen besteht. Die angeborene Immunität ist evolutionär älter als adaptive Immunität. Wirbellose Tiere werden derzeit angenommen, dass nur der angeborenen Immunität haben, während Wirbeltieren sowohl die angeborenen und erworbenen Filialen besitzen. Während adaptiven Immunität verleiht spezifische und dauerhafte Immunität gegen bestimmte Erreger, ist die angeborene Immunität eine unmittelbare Reaktion auf eindringende Bakterien, Viren und Pilze. Ein entscheidender Aspekt der angeborenen Immunantwort beinhaltet die Freisetzung von Zytokinen und Chemokinen, die Entzündung und die Rekrutierung von Phagozyten (zB Makrophagen, Neutrophile) führt zu verschlingen und zerstören fremde Eindringlinge. Erfolgreiche angeborenen Immunantwort beinhalten: (1) Anerkennung von eindringenden Mikroorganismen, (2) Induktion der entsprechenden Signalkaskaden (zB Freisetzung von Zytokinen und Chemokinen), (3) die richtige Entwicklung / ausreichende Anzahl von Fresszellen, (4) Migration von Phagozyten auf Seiten der Infektion, (5) Einwirkung von Krankheitserregern, und (6) Zerstörung der Mikroorganismen verschlungen. Ein Mangel an einem dieser Schritte können an den Host durch überwältigt zu führen und zu erliegen, die Infektion. Eine robuste angeborenen Immunantwort entscheidend für die Gesundheit von Lebewesen, weil es die erste Verteidigungslinie gegen Pathogene in allen Pflanzen und Tieren. Bei Wirbeltieren, es potenziert auch die adaptive Immunantwort ein. Daher ist es wichtig, dass wir in der Lage, alle Aspekte der angeborenen Immunreaktion, um besser zu verstehen und um ihre Funktion zu optimieren auszuwerten. Viele Modellorganismen werden zur angeborenen Immunität zu studieren, von Arabadopsis C. elegans, Drosophila, Mäuse zu kultivierten menschlichen Zellen. Ein Vorteil der Verwendung der Zebrafisch (Danio rerio) Modellsystem zur angeborenen Immunität zu studieren ist, dass der Zebrafisch ist ein Wirbeltier, sowohl mit angeborenen und adaptiven imGemeinschaft, noch die Entwicklung der angeborenen und erworbenen Immunität zeitlich getrennt. Zebrafisch verlassen sich ausschließlich auf die angeborene Immunität für den Schutz vor Infektion, bis die adaptive Immunität wird voll funktionsfähig, die um 4-6 Wochen nach der Befruchtung 2 auftritt. Zusätzlich zu den Werkzeugen zur genetischen Manipulation, optische Klarheit und eine schnelle, externe Entwicklung, angeborene Immunität als Prinzip Modus der Verteidigung in Zebrafischembryonen bietet ein vereinfachtes Modell, in dem die Komplexität der angeborenen Immunantwort in vivo zu untersuchen. Mehrere Protokolle entwickelt worden, um verschiedene Aspekte der angeborenen Immunantwort in Zebrafischembryos zu beurteilen. Microarrays und RNAseq haben bestätigt, dass die Cytokin-Profile von Zebrafisch angeborene Immunantwort hervorgerufen sind ähnlich wie die von Menschen und haben auch vorgeschlagen, die Beteiligung der Gene, die in unerwarteter angeborenen Immunität 3,4. Die Transparenz des Zebrafisch-Embryos und Leuchtstofflampen, transgenic Stämme von Krankheitserregern und Zebrafisch ermöglichen Visualisierung dynamischer Wirt-Pathogen-Interaktionen in vivo in Echtzeit. Transgene Zebrafischembryonen, die GFP unter der Kontrolle der Neutrophilen-spezifischen Promoter Myeloperoxidase 5,6 oder Makrophagen-spezifischen Promoter mpeg1 7 haben es möglich, zu den Orten der lokalisierten Infektionen 8 visualisieren und quantifizieren Phagozyten Migration sowie Phagozytose und Zerstörung sichtbar gemacht Fluoreszenz-markierten Krankheitserreger 8,9. Zebrafisch-Embryonen sind ebenfalls für die Erzeugung von Hochdurchsatz-Assays und chemischen Bildschirme. Dementsprechend haben Hochdurchsatz-Methoden der Transkriptom-Analyse bei der Infektion 10 und Phagozyten Migration auf Websites von chemisch induzierte Verletzung 11 vor kurzem entwickelt worden. Von den oben aufgeführten Verfahren keine quantitativ beurteilen die letzte Stufe der Erreger Zerstörung durch Phagozyten. Diese letzte Stufebeinhaltet eine Respiratory Burst (dh Produktion von ROS und andere giftige Verbindungen), die die Krankheitserreger abzutöten verschlungen. Die NADPH-Oxidase ist eine wichtige Quelle von ROS in phagozytischen Zellen. Zusammenbau der Untereinheiten der NADPH-Oxidase-Enzym führt Übertragung von Elektronen, Sauerstoff, Erzeugen Superoxidanionen. Durch nachfolgende enzymatische Reaktionen kann dann Superoxid zu Wasserstoffperoxid und hypochlorige Säure (1A) umgewandelt werden. Es ist der Respiratory Burst von Phagozyten, die Krankheitserreger abtötet, und somit ist die Quantifizierung des Respiratory Burst Potential des Zebrafischembryos anzeigt Gesamt angeborenen Immun Gesundheit. Wir entwickelten ein Fluoreszenz-basierten Assays, um den respiratorischen Burst in Gruppen einzelner Zebrafischembryonen 12 zu quantifizieren. Dieser Assay verwendet den nicht-fluoreszierenden, reduzierte Form eines im Handel erhältlichen zellgängigen Farbstoff. Dieser Farbstoff, 2 &#39;, 7&#39;-dichlorodihydrofluorescein Diacetat (H2DCFDA), ist in die Fluoreszenz umgewandeltCent-Verbindung, 2 &#39;, 7&#39;-Dichlorfluorescein (DCF), die bei der Oxidation. Die vielfältigen ROS durch die Phagozyten Respiratory Burst erzeugte H2DCFDA oxidieren und erzeugen Fluoreszenz 24. Das Aussehen der Fluoreszenz kann verwendet werden, um zu quantifizieren und vergleichen Sie die Atem Burst Reaktion zwischen Gruppen von Zebrafisch werden. Die Proteinkinase-C-Agonist Phorbol-Myristat-Acetat (PMA) verwendet wird, um chemisch zu induzieren NADPH-Oxidase zu produzieren ROS und erhöhen somit Fluoreszenzmesswerte (Abbildung 1B). Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll einer modifizierten und optimierte Version dieses Zebrafischembryo Respiratory Burst Test. Dieser Test kann verwendet werden, um den Respiratory Burst von Gruppen einzelner Zebrafischembryonen im Laufe der Zeit und / oder in Reaktion auf experimentelle Manipulationen (z. B. Morpholino-vermittelte Protein Knockdown) zu vergleichen. Die Anwendung dieser Methode, in Verbindung mit anderen Zebrafisch-Assays angeborenen Immunität, wird ein vollständigeres Bild der komplexen und kritischen bietenangeborenen Immunantwort.

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		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Instant Ocean Sea Salt</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>H2DCFDA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>35845-1G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP6851</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2438-5X10ML</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tricaine S MS222</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>100 grams</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM/F-12, No Phenol Red </td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Deep Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89107-632</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plastic Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>#5 Dumont Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72700-D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1.7 ml Micro Centrifuge Tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>10011-724</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>15 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-918</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5 ml Serological Pipettes</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>606180</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Contact BioTek</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Black 96 Well Microplate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-728</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>25 ml Sterile Reservoirs</td>
			<td>VistaLab</td>
			<td>3054-2003</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>P200 Pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Multichannel Pipettor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-948</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipette Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-478</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

quantification of the respiratory burst response as an indicator of innate immune health in zebrafish

Phagozyten Respiratory Burst ist Teil der angeborenen Immunantwort gegen Pathogenbefall und umfasst die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). ROS sind giftig und Funktion phagozytierten Mikroorganismen abzutöten. In vivo Quantifizierung von Phagozyten abgeleitete ROS gibt Auskunft über die Fähigkeit eines Organismus, um eine robuste angeborenen Immunantwort. Hier beschreiben wir ein Protokoll, im ganzen Zebrafischembryonen auf chemische Induktion des Phagozyten Respiratory Burst quantifizieren und vergleichen ROS. Dieses Verfahren ermöglicht die Verwendung eines nicht-fluoreszierende Verbindung, die bei der Oxidation von Fluoreszenz ROS wird. Einzelzebrafischembryos werden in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte pipettiert und in diesem fluorogenen Substrat mit oder ohne einen chemischen Induktor des Respiratory Burst inkubiert. Fluoreszenz-in jede Vertiefung wird zu gewünschten Zeitpunkten mit Hilfe eines Mikroplatten-Reader quantifiziert. Fluoreszenz-Messwerte werden angepasst, um die Hintergrundfluoreszenz zu beseitigen und dann zusammenmpared mit einem ungepaarten t-Test. Dieses Verfahren ermöglicht einen Vergleich der Respiratory Burst Potential des Zebrafischembryos in verschiedenen Entwicklungsstadien und als Reaktion auf experimentelle Manipulationen wie Protein Zuschlagsüberexpression, oder die Behandlung mit pharmakologischen Mitteln. Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um den respiratorischen Burst Reaktion vollständig seziert Nieren oder Zellpräparate aus Nieren von erwachsenen Zebrafisch und einige andere Fischarten zu überwachen. Wir glauben, dass die relative Einfachheit und Anpassungsfähigkeit dieses Protokoll wird die bestehenden Protokolle ergänzen und wird von Interesse für Forscher, die die angeborene Immunantwort besser zu verstehen suchen.

Hier bieten wir den Vergleich der Daten Respiratory Burst-Antwort in Zebrafischembryonen (Wildtyp-, AB-Hintergrund) bei 48 und 72 Stunden nach der Befruchtung (hpf). Die 48 hpf Embryonen als unsere Kontrollgruppe und den 72 hpf Embryonen als unsere Versuchsgruppe handelte. Die Stichprobengröße betrug 24 un-induzierte Embryonen und 24 PMA-induzierte Embryonen pro Entwicklungsstadium. Roh Fluoreszenzmesswerte (in relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU)) wurden durch Lesen der Mikroplatte 4 Stunden nach der Zugabe von PMA e...

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Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Die angeborene Immunantwort gegen Krankheitserreger schützt Organismen Infektion. Eine kritische Komponente des angeborenen Immunantwort, die Phagozyten Atmungsstoß erzeugt reaktive Sauerstoffspezies, die eindringende Mikroorganismen zu töten. Wir beschreiben einen Assay, der Respiratory Burst reaktiven erzeugt, wenn der angeborenen Immunantwort chemisch induzierte Sauerstoffspezies quantifiziert.

Die Quantifizierung der Atem Burst Antwort als Indikator für Angeborene Immunsystem Gesundheit in Zebrafisch

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

quantification-respiratory-burst-response-as-an-indicator-innate

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

21.5K Aufrufe.  University of Maine.  Die angeborene Immunantwort gegen Krankheitserreger schützt Organismen Infektion. Eine kritische Komponente des angeborenen Immunantwort, die Phagozyten Atmungsstoß erzeugt reaktive Sauerstoffspezies, die eindringende Mikroorganismen zu töten. Wir beschreiben einen Assay, der Respiratory Burst reaktiven erzeugt, wenn der angeborenen Immunantwort chemisch induzierte Sauerstoffspezies quantifiziert. 

Serie: Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Mensch In Vitro Suppression als Screening-Tool für die Anerkennung von Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Forschung

Immunologie und Infektion

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

Eine Einführung in die parasitischen Wespen<em&gt; Drosophila</em&gt; Und die antiparasitäre Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

Quantitative Messung der Immunantwort und Sleep in<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

Zergliedern Angeborene Immunsystem Signaling in Viral Evasion von Zytokin-Produktion

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Mit RNA-Interferenz, um die angeborene Immunantwort in Makrophagen der Maus Untersuchen

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

In-vitro-Analyse Myd88-vermittelte zelluläre Immunantwort gegen das West-Nil-Virus-Infektion Mutantenstamm

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Nicht-invasive Bildgebung von der angeborenen Immunantwort in einem Zebrafisch-Larven Modell<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infektions

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

Nicht-invasive Probenahme von Schleimhaut-Flüssigkeit für die Quantifizierung von In Vivo oberen Atemwegen immun-Mediator-Level

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Quantifizierung der Efferocytosis durch einzellige Fluoreszenz-Mikroskopie

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence rates of S. aureus infection climbing annually, there is a demand for additional research in its&#160;pathogenicity. Animal models of infectious disease advance our understanding of the host-pathogen response and lead to the development of effective therapeutics. Neutrophils play a primary role in the innate immune response that controls S. aureus infections by forming an abscess to wall off the infection and facilitate bacterial clearance; the number of neutrophils that infiltrate an S. aureus skin infection often correlates with disease outcome. LysM-EGFP mice, which possess the enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the Lysozyme M (LysM) promoter region (expressed primarily by neutrophils), when used in conjunction with in vivo whole animal fluorescence imaging (FLI) provide&#160;a means of quantifying neutrophil emigration noninvasively and longitudinally into wounded skin. When combined with a bioluminescent S. aureus strain and sequential in vivo whole animal bioluminescent imaging (BLI), it is possible to longitudinally monitor both the neutrophil recruitment dynamics and in vivo bacterial burden at the site of infection in anesthetized mice from onset of infection to resolution or death. Mice are more resistant to a number of virulence factors produced by S. aureus that facilitate effective colonization and infection in humans. Immunodeficient mice provide a more sensitive animal model to examine persistent S. aureus infections and the ability of therapeutics to boost innate immune responses. Herein, we characterize responses in LysM-EGFP mice that have been bred to MyD88-deficient mice (LysM-EGFP&#215;MyD88-/- mice) along with wild-type LysM-EGFP mice to investigate S. aureus skin wound infection. Multispectral simultaneous detection enabled study of neutrophil recruitment dynamics by using in vivo FLI, bacterial burden by using in vivo BLI, and wound healing longitudinally and noninvasively over time.

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

An approach is described for real-time detection of the innate immune response to cutaneous wounding and Staphylococcus aureus infection of mice. By comparing LysM-EGFP mice (which possess fluorescent neutrophils) with a LysM-EGFP crossbred immunodeficient mouse strain, we advance our understanding of infection and the development of approaches to combat infection.

Ein Mausmodell zu beurteilen, angeborene Immunantwort auf Staphylococcus Aureus -Infektion

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...