Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss aus dem deutschen Bundesministerium für Bildung und Forschung gefördert (Projekt BiGRUDI [Bi ologische G efahrenlagen: R isikobewertung, u ltraschnelle D etektion und ich dentifizierung von bioterroristisch relevanten Agenzien, 13N9594]). Wir danken B. Diemar (Charité-Universitätsmedizin Berlin, Institut für Pharmakologie) für hervorragende technische Unterstützung.

1. Protokoll - IgY-Extraktion mittels PEG-Fällung Abb.. 1 zeigt eine schematische Darstellung des IgY-Extraktionsverfahren (siehe Tabelle 2). Das Protokoll wurde erstmals im Polson et al. 1980. Alle Schritte sollten unter Verwendung von Latex-Handschuhe werden. <ol><li> Die Eierschale ist sorgfältig geknackt und das Eigelb ist es, eine &quot;Eidotter Löffel&quot; übertragen, um so viel Eiweiß wie möglich zu entfernen. </li><li> Das Eigelb auf ein Filterpapier übertragen und gerollt, um restliche Eiklar zu entfernen, dann das Eigelb Haut mit einer Lanzette oder ein ähnliches Instrument (Pipettenspitze) geschnitten. Das Eigelb wird in eine 50 ml Tube gegossen und das Ei Volumen registriert ist (V1). </li><li> Zweimal das Eigelb Volumen von PBS ist mit dem Eigelb (ΣV1 + V2), danach 3,5% PEG 6000 (in Gramm, pulverisiert) des Gesamtvolumens gemischt zugegeben und gevortext, gefolgt von 10 min ins Rollen auf einer rollenden Mischer. Dieser Schritt der Extraktion trennt die Suspension in zwei Phasen. Eine Phase besteht aus &quot;Eigelb Feststoffe und fetthaltigen Substanzen&quot; (original Zitat von Polson et al. 1980) und eine wässrige Phase, die IgY und andere Proteine. </li><li> Die Röhrchen werden bei 4 ° C zentrifugiert für 20 min (10.000 rpm nach zu 13.000 xg, Heraeus Multifuge 3SR +, Festwinkelrotor). Der Überstand (V3) wird durch ein Faltenfilter gegossen und in einen neuen Schlauch. </li><li> 8,5% PEG 6000 in Gramm (berechnet nach dem neuen Volume) sind in das Röhrchen gegeben, gevortext und rollte auf einem rollenden Mischer wie in Schritt 3. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 4 mit dem Unterschied, dass der Überstand verworfen wird. </li><li> Das Pellet wird vorsichtig in 1 ml PBS durch ein Glas-Stick und dem Vortexer aufgelöst. PBS ist ein Endvolumen von 10 ml (V4) aufgenommen. Die Lösung wird mit 12% PEG 6000 (w / v, 1,2 Gramm) gemischt und wie in Schritt 3 (Wirbel, Walzen-Mischer). </li><li> Wiederholen Sie Schritt 6 und lösen das Pellet vorsichtig in 800 ul PBS (Glas-Stick und Vortex). Warten Sie, bis die Luftblasen verschwinden und dann übertragen (Pipette) der Extrakt einer Dialyse Kapsel. Spülen Sie den Schlauch mit 400 ul PBS und fügen Sie die Lautstärke auf den Dialyse-Gerät (V5). (Zur Herstellung von Dialyse-Geräte und Membranen siehe Anhang.) </li><li> Der Extrakt wird über Nacht in 0,1% iger Kochsalzlösung (1.600 ml) dialysiert und vorsichtig durch einen Magnetrührer gerührt. Am nächsten Morgen ist die Kochsalzlösung durch PBS ersetzt und dialysiert für weitere drei Stunden. </li><li> Danach wird der IgY-Extrakt wird aus der Dialyse Kapsel mit einer Pipette gezogen und auf 2 ml Röhrchen. Das Endvolumen beträgt ca. 2 ml (V6). </li><li> Der Proteingehalt (mg / ml) der Proben wird photometrisch bei 280 nm (1:50 verdünnt mit PBS) gemessen und berechnet nach dem Lambert-Beer-Gesetz mit einem Extinktionskoeffizienten von 1,33 für IgY (siehe Abb.. 2), Abb. . 4 zeigt die Qualität der Vorbereitung (Reinheit und Erholung sind rund 80%). </li><li> Es ist ratsam, die Proben in Aliquots bei -20 ° C (nicht einfrieren die Proben bei -70 ° C). </li><li> Die Qualität der letzten Vorbereitungen wird durch einfache SDS-PAGE analysiert, wie in JoVE Protokoll beschrieben <a href="http:/www.jove.com/details.php?id=1916">http:/www.jove.com/details.php?id=1916</a> </li></ol> 2. Appendix-vor Gebrauch der Dialyseschlauch in folgender Weise muss nach den Empfehlungen des Herstellers vorbereitet werden: <ol><li> 20 Dialyseplätze Taschen sind in Stücke von 30 cm geschnitten und da in einem 2000 ml Becherglas. </li><li> 1.750 ml einer 5 mM EDTA-Lösung versetzt. </li><li> Ein Glastrichter über dem Beutel gelegt, um sicherzustellen, dass die Beutel von der EDTA-Lösung bedeckt sind. Die Lösung wird erhitzt und für 5 min gekocht (Heizplatte). Die Lösung wird dekantiert und die Taschen sind dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen. </li><li> Noch einmal 1.750 ml EDTA-Lösung versetzt, für 5 min gekocht und dreimal mit destilliertem Wasser wie oben. </li><li> Schließlich wird die Dialyse-Taschen sind für 10 min in destilliertem Wasser gekocht und bei 4 ° C. Nehmen Sie die Dialysebeutel durch sterilisierte Pinzette. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der IgY-Extraktion mittels Polyethylenglykol Niederschläge nach der ursprünglichen Beschreibung der Polson et al. 1980. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3084/3084largefig1.jpg">Um eine größere Ansicht klicken Sie hier.</a> <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Entwicklung der Gesamt-IgY im Eidotter immunisierter Hühner in Abhängigkeit vom Alter. Da ist der wöchentliche Mittelwert der insgesamt IgY / Ei-und SD (n = 4 Legehennen). Von [Pauly et al. 2009]). <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Laying Kapazität Überwachung von vier Hennen mit verschiedenen Antigenen immunisiert. Die Pfeile zeigen die Immunisierung Datum (aus [Pauly et al. 2009]). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3084/3084largefig3.jpg">Um ein größeres Bild hier klicken Ansicht.</a> <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Polyacrylamid-Gelelektrophorese einzelner IgY-Präparationen aus verschiedenen Eiern unter reduzierenden Bedingungen Lane 1 - Molekulargewichtsmarker, Spur 2 - IgY-Standard, Lane 3-5 - verschiedene IgY Proben hergestellt, wie im Protokoll beschrieben. Dies sind die letzten Vorbereitungen nach 10 des Protokolls Schritt. HC - schwere Ketten, LC - Licht chaines,? - Geringfügige Verunreinigungen entsprechend Molekulargewicht ca. 35 kDa (wahrscheinlich die C-terminale Fragment von Vitellogenin II-Vorstufe [Klimentzou et al, 2006.]). <table border="1"><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td> Huhn 21 (Antigen A) </td><td> Huhn 22 (Antigen A) </td><td> Huhn 19 (Antigen B) </td><td> Huhn 23 (Antigen C) </td></tr><tr><td> Egg (Gesamtzahl IgY) 1, 2-Jahres-Zeitraum </td><td> 625 (38 g) </td><td> 626 (38 g) </td><td> 545 (33 g) </td><td> 608 (37 g) </td></tr><tr><td> Egg (Gesamtzahl IgY), im ersten Jahr </td><td> 345 (20 g) </td><td> 304 (16 g) </td><td> 326 (18 g) </td><td> 308 (17 g) </td></tr><tr><td> Egg (Gesamtzahl IgY), zweites Jahr </td><td> 280 (18 g) </td><td> 322 (21 g) </td><td> 219 (15 g) </td><td> 300 (20 g) </td></tr><tr><td> % Der max. möglichen Keim-Nummer (erstes Jahr) 2 </td><td> 106 </td><td> 93 </td><td> 100 </td><td> 95 </td></tr><tr><td> % Der max. möglichen Keim-Nummer (zweites Jahr) </td><td> 86 </td><td> 99 </td><td> 67 </td><td> 92 </td></tr><tr><td> Anzahl der verarbeiteten Eier </td><td> 565 </td><td> 620 </td><td> 283 </td><td> 401 </td></tr></tbody></table> 1 Die Höhe der insgesamt IgY wird durch Multiplikation der Zahl der Eier durch einen mittleren Wert von 60 mg Protein pro Ei nach den Angaben in Abbildung 2 berechnet. 2 Die max. möglichen Keim-Anzahl pro Jahr liegt bei 325 nach einer Information des Züchters. Tabelle 1. Zwei Jahre Statistik der Eiablage Kapazität von Hühnern, die mit verschiedenen Antigenen immunisiert. Legen Kapazität in Prozent der maximal vier Hennen nach Immunisierung mit verschiedenen Antigenen sowie die IgY-Ergebnis innerhalb von zwei Jahren (siehe auch Abb.. 3), [Pauly et al. 2009]). <table border="1"><tbody><tr><td> Egg Nr. </td><td> Hen Nr. Legedatum </td><td> V1 [ml] Eigelb </td><td> V2 [ml] PBS </td><td> 1. PEG prec. [G] </td><td> Vol [ml] nach </td><td> 2. PEG prec. [G] </td><td> Pellet </td><td> 3. PEG prec. [G] </td><td> Pellet </td><td> Vol [ml] </td><td> Insgesamt Protein mg / ml </td><td> Korrigierte gesamten Proteins mg / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 2xV1 ΣV1 + V2 </td><td> 3,5% [w / v] ΣV1 + V2 </td><td> prec., centrif. und Filtration V3 </td><td> 8,5% [w / v] V3 </td><td> gelöst in ml PBS V4 </td><td> 12% [w / v] V4 </td><td> Gelöst in ml PBS V5 </td><td> Nach der Dialyse gegen PBS V6 </td><td> A280/ml </td><td> A280/ml: 1,33 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> H293 / 22.10. </td><td> 15 </td><td> 30 45 </td><td> 1,58 </td><td> 31 </td><td> 2,63 </td><td> 10 </td><td> 1,2 </td><td> 1,2 </td><td> 1,7 </td><td> 35,0 </td><td> 26,3 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> H293 / 23.10. </td><td> 13 </td><td> 26 39 </td><td> 1,37 </td><td> 25 </td><td> 2,12 </td><td> 10 </td><td> 1,2 </td><td> 1,2 </td><td> 1,7 </td><td> 28,8 </td><td> 21,6 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Beispielhafte Protokoll der PEG-Fällung

<ol>
	<li>Akita, E. M., Nakai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+four+purification+methods+for+the+production+of+immunoglobulins+from+eggs+laid+by+hens+immunized+with+an+enterotoxigenic+E.+coli+strain.">Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E. coli strain.</a> J. Immunol. Methods. 160, 207-214 (1993).</li><li>De Meulenaer, B., Huyghebaert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+chicken+egg+yolk+immunoglobulins:+a+review.">Isolation and purification of chicken egg yolk immunoglobulins: a review.</a> Food Agricult. Immunol. 13, 275-288 (2001).</li><li>Klimentzou, P., Paravatou-Petsotas, M., Zikos, C. h., Beck, A., Skopeliti, M., Czarnecki, J., Tsitsilonis, O., Voelter, W., Livaniou, E., Evangelatos, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+immunochemical+evaluation+of+antibodies+Y+for+the+poorly,+immunogenic+polypeptide+prothymosin+alpha.">Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly, immunogenic polypeptide prothymosin alpha.</a> Peptides. 27, 183-193 (2006).</li><li>Pauly, D., Dorner, M., Zhang, X., Hlinak, A., Dorner, B., Schade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+laying+capacity,+immunoglobulin+Y+concentration,+and+antibody+titer+development+in+chickens+immunized+with+ricin+and+botulinum+toxins+over+a+two-year+period.">Monitoring of laying capacity, immunoglobulin Y concentration, and antibody titer development in chickens immunized with ricin and botulinum toxins over a two-year period.</a> Poultry Science. 88, 281-290 (2009).</li><li>Polson, A., von Wechmar, M. B., van Regenmortel, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+viral+IgY+antibodies+from+yolks+of+immunized+hens.">Isolation of viral IgY antibodies from yolks of immunized hens.</a> Immunol. Commun. 9, 475-493 (1980).</li><li>Schade, R., Behn, I., Erhard, M., Hlinak, A., Staak, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chicken egg yolk antibodies, production and application : IgY-Technology. , (2001).</li><li>Schade, R., Calzado, E. G., Sarmiento, R., Chacana, P. A., Porankiewicz-Asplund, J., Terzolo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+egg+yolk+antibodies+(IgY-technology):+a+review+of+progress+in+production+and+use+in+research+and+human+and+veterinary+medicine.">Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): a review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine.</a> Altern. Lab Anim. 33, 129-154 (2005).</li><li>Witkowski, P. T., Bourquain, D. R., Hohn, O., Schade, R., Nitsche, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+gun-supported+DNA+immunisation+of+chicken+for+straightforward+production+of+poxvirus-specifiv+IgY+antibodies.">Gene gun-supported DNA immunisation of chicken for straightforward production of poxvirus-specifiv IgY antibodies.</a> J. Immunol. Methods. 341, 146-153 (2009).</li></ol>

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her, indem Landesamt für Gesundheit und Soziales Berlin (H 0069/03) eingestellt durchgeführt.

Die Wahl eines geeigneten IgY Reinigungsverfahren ist nach Skala der Reinigung (Labor oder Industrie), Wirtschaftlichkeit, Technik (Laborausstattung) und Auswirkungen auf die Umwelt (Abfallwirtschaft) beeinflusst. Verschiedene IgY Extraktionsmethoden wurden im Detail durch De Meulenaer &amp; Huyghebaert (2001, zur Überprüfung siehe auch Schade et al. 2005) überprüft. Im Allgemeinen können diese Methoden in drei Hauptgruppen eingeteilt werden: <ol><li> Niederschlag Methoden: mit Ammonium-oder Natriumsulfat, Polyethylenglykol (PEG), Caprylsäure und caragenean. </li><li> Chromatographische Methoden: Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Interaktions-Chromatographie, thiophylic Interaktionschromatographie und Gelfiltration gereinigt. </li><li> Ultrafiltration. </li></ol> Die Reinheit eines IgY Vorbereitung kann durch eine Kombination von Methoden erhöht werden, z. B. PEG-Fällung mit Affinitätschromatographie kombiniert werden. In einigen Fällen, abhängig von der endgültigen Anwendung wird ein wässriger Extrakt der IgY ausreichend, um gute Ergebnisse (Akita &amp; Nakai 1993) zu erreichen. Nach unserer Erfahrung, arbeiteten die IgY-Probe, die wir durch PEG-Fällung erhalten sehr gut in vielen verschiedenen immunologischen Tests. Durch die Standardisierung der PEG-Fällungsverfahren eine technische Assistentin in der Lage, ungefähr 84 Eier pro Woche, was zu einem Betrag von insgesamt IgY zwischen 4 und 7 g pro Woche entspricht Prozess. Eine einfache Rechnung: Eine Legehenne ist mit einem Antigen immunisiert. Nach ein paar steigern Impfungen die Henne produziert spezifische Antikörper (Ab) mit einem Titer von 1:50.000 in einem Zeitraum von 30 Tagen. 30 Eier x 2 ml IgY-Extrakt (siehe Protokoll und Bild. 3) entspricht 60 ml insgesamt IgY, was wiederum entspricht einer Ab-Verdünnung von 3.000 l (die Kapazität einer Schaufel 10 l), die mit 3.000 l bedeutet von Ab Lösung 300 Eimer gefüllt werden kann. Also, im Hinblick auf so große Ab-Menge ist es kein Problem, eine Ab-Pool von konstanter Qualität und Spezifität zu speichern. Diese Technik reduziert die Lade / viel Variabilität sonst in polyspezifischen Ab beobachtet. Trotz der Aspekt der Quantität haben IgY Ab weitere Vorteile im Vergleich zu Säugetieren IgG: Keine Aktivierung von Säugetier-Komplement-System, keine Kreuzreaktivität mit HAMA (human anti-Maus-Antikörper), Rheumafaktoren oder menschlichen Blutgruppen-Antigene (fehlende heteroagglutinins). Ein herausragender Vorteil der IgY-Ab ist die sogenannte phylogenetische Distanz. Phylogenetische Distanz ist der Grund für die häufig beschriebenen Unterschiede zwischen den Ab Besonderheiten von Säugetieren und Geflügel, auch wenn identisch immunisiert. Neben den Unterschieden zwischen den Säugetieren und die Vogelgrippe Immunsystem selbst trägt Unterschiede in stammesgeschichtlichen Entwicklung in diesen beiden Tierklassen auf die verschiedenen Ab Besonderheiten. Mehrere Autoren haben berichtet, dass Hühner produzieren häufig Abs gegen phylogenetisch hochkonservierte Säugetieren gewonnenen Proteinen oder Peptiden effizienter als die Kaninchen (für eine Übersicht siehe Schade et a. 2005). Als Folge davon kann eine konservierte Antigen bleiben &quot;maskiert&quot;, um das Kaninchen Immunsystem und verursachen so nur einen schwachen oder eine &quot;stille&quot; Antwort. Außerdem, wenn Hühner und Kaninchen mit der gleichen Säugetieren Antigen immunisiert, sehr oft die Hühner mit einem Ab-Spezifität, die nur selten bei Kaninchen erzielt werden können reagieren. Auch der Aspekt des Tierschutzes ist wichtig, da die Ab non-invasiv werden extrahiert aus Eigelb. In Kombination mit Gene-Gun (Plasmid) Immunisierung der IgY-Produktion ist komplett nicht-invasive (Witkowski et al. 2009). Im Ergebnis ist die Herstellung von Ab in Hennen und die IgY-Extraktion mittels PEG-Fällung sehr kostengünstig und führt zu sehr spezifischen Ab mit stabilen Titer von bis zu 1:1.000.000. Aufgrund der phylogenetischen Abstand zwischen Aves und Mammalia sind Hühner in der Lage, spezifische Ak gegen hochkonservierte Säugetieren Antigene im Gegensatz zu zB Kaninchen zu produzieren. Die außergewöhnliche Höhe der Ab durch IgY-Technologie erhalten die Tür öffnet auch für den Einsatz von IgY-Ab in Human-und Veterinärmedizin zu therapeutischen / prophylaktischen Zwecken.

<ol><li> Dialyse Bag Visking, Typ 27/32, ab -14 kD, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland geschnitten </li><li> Falcon-Röhrchen Blue Max, 50 ml Polypropylen konisches Röhrchen, Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes NY, USA </li><li> Faltenfilter MN 615 ¼, ∅ 150 mm, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland Heraeus </li><li> Magnetrührer, Variomag Mono, H + P Labortechnik AG, Oberschleißheim, Deutschland </li><li> Micro-Dialyse-Capsule 5,0 ml, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland </li><li> Multifuge 3SR +, Thermo Scientific, Langenselbold, Deutschland </li><li> Photometer UV-160A, Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg, Deutschland </li><li> Polyethylenglykol 6000, Rotipuran Ph.Eur., Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland </li><li> Premixed PBS-Puffer 10x, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland </li><li> Roller Mixer SRT2, Stuart, Staffordshire, UK </li><li> Vibrofix VF2, Janke &amp; Kunkel, IKA-Labortechnik, Staufen i. Br., Deutschland </li><li> Yolk Löffel, Fackelmann (houshold Effekte), Deutschland </li></ol>

igy technology: extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (peg) precipitation

Hens kann durch im Impfung (Musculus pectoralis, links und rechts, Injektionsvolumen 0,5-1,0 ml) oder mit Hilfe von Gene-Gun-Plasmid-Immunisierung immunisiert werden. Abhängig von der Immunogenität des Antigens, hohe Antikörper-Titer (bis 1:100.000 - 1:1.000.000) kann nach nur einem oder 3 erreicht werden - 4 steigern Impfungen. Normalerweise legt eine Henne Eier kontinuierlich für etwa 72 Wochen, danach wird die Legeleistung sinkt. Dieses Protokoll beschreibt die Extraktion von insgesamt IgY aus Eigelb durch ein Niederschlag Verfahren (PEG. Polson et al. 1980). Das Verfahren beinhaltet zwei wichtige Schritte. Die erste ist die Entfernung von Lipiden und das zweite ist die Fällung von insgesamt IgY aus dem Überstand von step one. Nach der Dialyse gegen einen Puffer (in der Regel PBS) der IgY-Extrakt kann bei -20 ° C für mehr als ein Jahr gelagert werden. Die Reinheit des Extraktes beträgt rund 80%, variiert die Summe IgY pro Ei 40 bis 80 mg, abhängig vom Alter der Legehennen. Der gesamte Inhalt IgY steigt mit dem Alter der Henne von rund 40 mg / Ei bis zu 80 mg / Ei (über PEG-Fällung). Die Legeleistung einer Henne pro Jahr rund 325 Eier. Das bedeutet insgesamt möglichen Ernte von 20 g insgesamt IgY / Jahr bezogen auf eine mittlere IgY-Gehalt von 60 mg insgesamt IgY / Ei (siehe Tabelle 1).

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IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol PEG Precipitation

Dieses Protokoll beschreibt insbesondere die Extraktion der Gesamt-IgY aus Eigelb mittels Polyethylenglykol Niederschlag und gibt allgemeine Informationen über IgY-Technologie.

IgY-Technologie: Extraction of Chicken Antikörper aus Eidotter durch Polyethylenglykol (PEG) Niederschlag

Hens can be immunized by means of  i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume  0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation

64.1K Aufrufe.  Robert Koch-Institute. Dieses Protokoll beschreibt insbesondere die Extraktion der Gesamt-IgY aus Eigelb mittels Polyethylenglykol Niederschlag und gibt allgemeine Informationen über IgY-Technologie.

Serie: IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol PEG Precipitation

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In genetically predisposed individuals, tTG2 triggers autoimmune responses that are characterized by the production of tTG2 antibodies and their direct deposition into small intestinal wall 1,2. The presence of such antibodies constitutes one of the major hallmarks of the celiac disease (CD). Epidermal transglutaminase (eTG) is another member of the transglutaminase family that can also function as an autoantigen in a small minority of CD patients. In these relatively rare cases, eTG triggers an autoimmune reaction (a skin rash) clinically known as dermatitis herpetiformis (DH). Although the exact mechanism of CD and DH pathogenesis is not well understood, it is known that tTG2 and eTG share antigenic epitopes that can be recognized by serum antibodies from both CD and DH patients 3,4.
In this study, the confocal microscopy examination of biopsy samples from skin lesions of two rhesus macaques (Macaca mulatta) with dermatitis (Table 1, Fig. 1 and 2) was used to study the affected tissues. In one animal (EM96) a spectral overlap of IgA and tTG2 antibodies (Fig. 3) was demonstrated. The presence of double-positive tTG2+IgA+ cells was focused in the deep epidermis, around the dermal papillae. This is consistent with lesions described in DH patients 3. When EM96 was placed on a gluten-free diet, the dermatitis, as well as tTG2+IgA+ deposits disappeared and were no longer detectable (Figs. 1-3). Dermatitis reappeared however, based on re-introduction of dietary gluten in EM96 (not shown). In other macaques including animal with unrelated dermatitis, the tTG2+IgA+ deposits were not detected. Gluten-free diet-dependent remission of dermatitis in EM96 together with presence of tTG2+IgA+ cells in its skin suggest an autoimmune, DH-like mechanism for the development of this condition. This is the first report of DH-like dermatitis in any non-human primate.

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Dermatitis herpetiformis (DH) is a chronic inflammatory condition characterized by an autoimmune reaction between IgA and epidermal transglutaminase (eTG). DH develops in a very small portion of gluten-sensitive and/or celiac patients. The results of this study indicate that DH can also develop in a rhesus monkey host with symptoms of idiopatic dermatitis.

Die Anerkennung der Epidermal Transglutaminase von IgA und Tissue Transglutaminase 2 Antikörper in einem seltenen Fall von Rhesus Dermatitis

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

A Simple Chelex Protokoll zur DNA-Extraktion aus<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell transplant recipients1. Detection of IPA represents a formidable diagnostic challenge and, in the absence of a 'gold standard', relies on a combination of clinical data and microbiology and histopathology where feasible. Diagnosis of IPA must conform to the European Organization for Research and Treatment of Cancer and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycology Study Group (EORTC/MSG) consensus defining "proven", "probable", and "possible" invasive fungal diseases2. Currently, no nucleic acid-based tests have been externally validated for IPA detection and so polymerase chain reaction (PCR) is not included in current EORTC/MSG diagnostic criteria.
Identification of Aspergillus in histological sections is problematic because of similarities in hyphal morphologies with other invasive fungal pathogens3, and proven identification requires isolation of the etiologic agent in pure culture. Culture-based approaches rely on the availability of biopsy samples, but these are not always accessible in sick patients, and do not always yield viable propagules for culture when obtained.
An important feature in the pathogenesis of Aspergillus is angio-invasion, a trait that provides opportunities to track the fungus immunologically using tests that detect characteristic antigenic signatures molecules in serum and bronchoalveolar lavage (BAL) fluids. This has led to the development of the Platelia enzyme immunoassay (GM-EIA) that detects Aspergillus galactomannan and a 'pan-fungal' assay (Fungitell test) that detects the conserved fungal cell wall component (1 &rarr;3)-&beta;-D-glucan, but not in the mucorales that lack this component in their cell walls1,4. Issues surrounding the accuracy of these tests1,4-6 has led to the recent development of next-generation monoclonal antibody (MAb)-based assays that detect surrogate markers of infection1,5.
Thornton5 recently described the generation of an Aspergillus-specific MAb (JF5) using hybridoma technology and its use to develop an immuno-chromatographic lateral-flow device (LFD) for the point-of-care (POC) diagnosis of IPA. A major advantage of the LFD is its ability to detect activity since MAb JF5 binds to an extracellular glycoprotein antigen that is secreted during active growth of the fungus only5. This is an important consideration when using fluids such as lung BAL for diagnosing IPA since Aspergillus spores are a common component of inhaled air. The utility of the device in diagnosing IPA has been demonstrated using an animal model of infection, where the LFD displayed improved sensitivity and specificity compared to the Platelia GM and Fungitell (1 &rarr; 3)-&beta;-D-glucan assays7.
Here, we present a simple LFD procedure to detect Aspergillus antigen in human serum and BAL fluids. Its speed and accuracy provides a novel adjunct point-of-care test for diagnosis of IPA in haematological malignancy patients.

A rapid and accurate point-of-care test for invasive pulmonary aspergillosis is presented. It takes advantage of lateral-flow technology using a specific monoclonal antibody that binds to an Aspergillus antigen secreted during pulmonary infections. The assay is compatible with serum and brochoalveolar lavage and represents a novel adjunct test for disease diagnosis.

Nachweis des invasiven Pulmonale Aspergillose bei malignen hämatologischen Patienten mit Lateral-Flow-Technologie

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Lipopolysaccharide (LPS) is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of lipid A, which is embedded in the outer membrane, a core oligosaccharide and repeating O-antigen units that extend outward from the surface of the cell1, 2. LPS is an immunodominant molecule that is important for the virulence and pathogenesis of many bacterial species, including Pseudomonas aeruginosa, Salmonella species, and Escherichia coli3-5, and differences in LPS O-antigen composition form the basis for serotyping of strains. LPS is involved in attachment to host cells at the initiation of infection and provides protection from complement-mediated killing; strains that lack LPS can be attenuated for virulence6-8. For these reasons, it is important to visualize LPS, particularly from clinical isolates. Visualizing LPS banding patterns and recognition by specific antibodies can be useful tools to identify strain lineages and to characterize various mutants. 
In this report, we describe a hot aqueous-phenol method for the isolation and purification of LPS from Gram-negative bacterial cells. This protocol allows for the extraction of LPS away from nucleic acids and proteins that can interfere with visualization of LPS that occurs with shorter, less intensive extraction methods9. LPS prepared this way can be separated by sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and directly stained using carbohydrate/glycoprotein stains or standard silver staining methods. Many anti-sera to LPS contain antibodies that cross-react with outer membrane proteins or other antigenic targets that can hinder reactivity observed following Western immunoblot of SDS-PAGE-separated crude cell lysates. Protease treatment of crude cell lysates alone is not always an effective way of removing this background using this or other visualization methods. Further, extensive protease treatment in an attempt to remove this background can lead to poor quality LPS that is not well resolved by any of the aforementioned methods. For these reasons, we believe that the following protocol, adapted from Westpahl and Jann10, is ideal for LPS extraction.

We describe a modified hot aqueous-phenol extraction method for purifying lipopolysaccharide (LPS) from Gram-negative bacteria. Once extracted, the LPS can be subsequently analyzed by SDS-PAGE and visualized by direct staining or Western immunoblot.

Reinigung und Visualisierung von Lipopolysaccharid aus Gram-negativen Bakterien durch heiße wäßrige-Phenol-Extraktion

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Influenza Virus Vermehrung in embryonierten Hühnereiern

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

Erzeugung von rekombinanten humanen IgG monoklonalen Antikörpern aus Immortalisierte Sortiert B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.

An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridomtechnologie

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

Eine Methode zur Bewertung von Fc-vermittelten Effektor-Funktionen durch Influenza Hämagglutinin spezifische Antikörper induziert

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

Generation von diskriminierendem menschlichen monoklonalen Antikörpern aus seltenen Antigen-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the goal of this protocol is to develop a method to visualize the pathogen invasion in a specific immune compartment of flies, namely hemocytes. Using the method presented here, up to 3 &#215; 106 live hemocytes can be obtained from 200 Drosophila 3rd instar larvae in 30 min for ex vivo infection. Alternatively, hemocytes can be infected in vivo through injection of 3rd instar larvae followed by hemocyte extraction up to 24 h post-infection. These infected primary cells were fixed, stained, and imaged using confocal microscopy. Then, 3D representations were generated from the images to definitively show pathogen invasion. Additionally, high-quality RNA for qRT-PCR can be obtained for the detection of pathogen mRNA following infection, and sufficient protein can be extracted from these cells for Western blot analysis. Taken together, we present a method for definite reconciliation of pathogen invasion and confirmation of infection using bacterial and viral pathogen types and an efficient method for hemocyte extraction to obtain enough live hemocytes from Drosophila larvae for ex vivo and in vivo infection experiments.

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

This method demonstrates how to visualize pathogen invasion into insect cells with three-dimensional (3D) models. Hemocytes from Drosophila larvae were infected with viral or bacterial pathogens, either ex vivo or in vivo. Infected hemocytes were then fixed and stained for imaging with a confocal microscope and subsequent 3D cellular reconstruction.

Extraktion von Hemocytes aus Drosophila Melanogaster Larven für mikrobielle Infektionen und Analyse

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...