Primäre Präadipozyten sind ein wertvolles experimentelles System zum Verständnis der molekularen Signalwege, die den Adipozytenstoffwechsel steuern. Hühnerembryonen bieten die Möglichkeit, Präadipozyten vom frühesten Stadium der Adipozytenentwicklung an zu isolieren. Diese Methode wurde optimiert, um Zellen mit hoher Lebensfähigkeit und erhöhter Differenzierungsfähigkeit in reife Adipozyten zu erhalten, die für die funktionelle Analyse des frühen Lebensfettwachstums und der Entwicklung von Embryonen bei Küken verwendet werden können.
Der Prozess der adipogenen Differenzierung ist zwischen Hühnern und Menschen in hohem Maße vergleichbar. Daher können isolierte Präadipozyten als Dual-vorgeschlagenes Modell für Studien verwendet werden, die für Mensch und Geflügel relevant sind. Um den Embryonenkörper mit 70% Ethanol abzutupfen.
Um Interferenzen während der Filtration bei späteren Schritten nach der Verdauung zu vermeiden, schrubben Sie die Hautoberfläche vorsichtig mit steriler Gaze, um Federn zu entfernen. Schneiden Sie dann die Haut zwischen den Beinen und der Bauchregion ab, um das Paar femoraler Fettdepots freizulegen. Verwenden Sie gebogene Pinzetten mit einer Hand, um die Haut um das Bein zu halten und das femure subkutane Fett vorsichtig zu entfernen.
mit der anderen Hand. Verwenden Sie später eine gebogene Pinzette, um das Depot vorsichtig vom Bein wegzuziehen. Geben Sie das Gewebe in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit fünf Millilitern Sammelmedien und wiederholen Sie die Dissektion für die andere Seite des Fettpolsters.
Geben Sie nun die gesammelten Fettpolster in eine 60-Millimeter-Petrischale mit Sterilisationslösung und spülen Sie sie kurz ab, indem Sie die Schale einige Male schwenken. Dann spülen Sie die Sterilisationslösung ab, indem Sie die Fettpads in eine 60-Millimeter-Petrischale mit PBS geben. Den Teller vorsichtig schwenken und erneut mit PBS waschen.
Zur Verdauung des Fettgewebes in ein 15-Millimeter-Rohr mit vorwarmer enzymatischer Lösung überführen. Tauchen Sie dann eine lange gerade Schere in die Tube und zerkleinern Sie schließlich das Fettgewebe in der Lösung in möglichst kleine Stücke. Überführen Sie das gehackte Gewebe und die enzymatische Lösung in einen 25-Milliliter-Autoklavenkolben.
Umwickeln Sie den Kolben mit Paraffinfolie und legen Sie den Kolben zur Verdauung in einen orbitalen Shaker-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Nach der Verdauung vorsichtig auf und ab pipettieren, um sich gut zu vermischen. Entfernen Sie dann alle unverdauten Gewebestücke und Ablagerungen, indem Sie durch ein 250 Mikrometer langes Gewebesieb durch Pipettieren in ein 15-Milliliter-Rohr filtern.
Entfernen Sie nun die am Kolben haften Zellen, indem Sie den Kolben mit vier Millilitern Wachstumsmedien spülen und die Zellsuspension in das gleiche 15-Milliliter-Rohr filtern. Als nächstes spülen Sie das Sieb ab, indem Sie das Wachstumsmedium erneut pipettieren, um alle im Filter eingeschlossenen Zellen zu entfernen. Zentrifugieren Sie bei 300 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellfraktion zu pelletieren und den Überstand abzusaugen, ohne das Zellpellet zu stören.
Suspendieren Sie das Pellet vorsichtig in einem Milliliter Lysepuffer für rote Blutkörperchen, mischen Sie gut durch Pipettieren und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Dann verdünnen Sie die Zellen, indem Sie fünf Milliliter Wachstumsmedien in die Röhre geben, die die Zellen enthält, und mischen Sie sie vorsichtig durch Pipettieren. Pipettieren Sie nun die Zellen auf ein 40-Mikrometer-Zellsieb und filtern Sie sie in ein neues 50-Milliliter-Rohr.
Dann spülen Sie das Sieb mit zusätzlichen fünf Millilitern Wachstumsmedien aus und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 300 mal G für sieben Minuten bei Raumtemperatur. Den Überstand vorsichtig abspritzen. Resuspendiert das verbleibende Zellpellet in einem Milliliter Wachstumsmedien durch Pipettieren Um die Zelldichte und Lebensfähigkeit zu bestimmen, mischen Sie 10 Mikroliter jeder Probe in Trypanblau durch Pipettieren.
Laden Sie 10 Mikroliter der Mischung auf das Hämozytometer und zählen Sie die Zellen. Die Analyse der Präadipozyten nach 24, 48 und 72 Stunden zeigte eine normale Zellmorphologie und -anzahl. Die adipogene Induktion von Präadipozyten zeigte eine schnelle Differenzierung und Akkumulation von Lipidtröpfchen.
Der aggressive Umgang mit Präadipozyten während der Isolierung führte zu Zellschäden und geringer Zellzahl. Eine mikrobielle Kontamination kann trotz vorbeugender Maßnahmen beobachtet werden. Die Lipidfärbung mit ölrotem O zeigte, dass die Präadipozyten unter adipogenem Anreiz schnell Lipidtröpfchen entwickeln und die Akkumulation im Laufe der Zeit fortschreitet, wie in 24, 48 und 72 Stunden beobachtet.
Die Lipidakkumulation relativ zur Zellzahl wurde mit Hilfe von Lipid- und DNA-Flecken quantifiziert. Sowohl die Lipidakkumulation als auch die Zellproliferation nahmen im Laufe der Zeit zu. Niedrige Zellzahlen oder beschädigte Zellen können beobachtet werden, wenn die Gewebefraktionen zu lange verdaut werden.
Daher wird empfohlen, dass eineinhalb Stunden Verdauung nicht überschritten werden. Isolierte Präadipozyten können für Genexpressionsstudien verwendet werden. Es kann ausreichend RNA für den Einsatz in der cDNA-Synthese und der anschließenden qPCR oder RNAseq gewonnen werden.
