Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Wirkung mehrerer Glykosylierungsenzyme auf das Glykoprofil eines Zielproteins zu untersuchen und zu einem besseren Verständnis der Funktionalitäten des Enzyms beizutragen. Die Art des Protokolls ermöglicht das Screening von Glykosylierungsenzymen in einer vorübergehenden, aber hochdurchlässigen Weise. Veränderte Glykosylierungsprofile können zu verbesserten Antikörperaktivitäten führen und somit die Wirksamkeit des Endprodukts erhöhen.
Biopharmazeutische Unternehmen überwachen die Glykosylierung als kritisches Qualitätsmerkmal genau. Eine abweichende Glykosylierung ist ein Kennzeichen von Krankheiten wie Krebs. Daher ist diese Methode für die pharmakologische und biomedizinische Forschung relevant.
Das Protokoll geht davon aus, dass Benutzer Erfahrung mit verschiedenen experimentellen Techniken haben, einschließlich der Transfektion von Säugetierzellen und westlichen Flecken. Es ist besser, mit weniger Proben zu beginnen und in erster Linie Haltepunkte zu verwenden. Beginnen Sie mit der Beurteilung der Dichte und Lebensfähigkeit der Ovarialzellen des chinesischen Hamsters.
Reinigen Sie dann die Biosicherheitskabine und alle Geräte sorgfältig mit 70% Ethanol und einer RNase-Inhibitorlösung, um eine Kontamination zu vermeiden. Als nächstes pelletieren Sie die Zellen bei 100 mal G für fünf Minuten und suspendieren Sie sie in einem vorerwärmten Medium bei einer Zelldichte von fünf mal 10 bis zu den sechs Zellen pro Milliliter. Übertragen Sie acht Mikroliter des DsiRNA-Master-Mixes oder der Steuerung auf eine sterile Elektroporationsküvette.
Fügen Sie 800 Mikroliter der Zellsuspension in dieselbe Küvette hinzu, mischen Sie und geben Sie den Elektroporationspuls ab. Übertragen Sie dann die Zellsuspension von der Küvette auf eine Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen und vermeiden Sie schaumartiges Material. Inkubieren Sie die Zellen für 10 Minuten ohne zu schütteln.
Nach der Inkubation 800 Mikroliter vorerwärmtes Medium hinzufügen, um ein endgültiges Volumen von 1,6 Millilitern pro Vertiefung zu erhalten. Züchten Sie die transfizierten Zellen im Inkubator, während Sie mit 150 U / min schütteln. Nach 48 Stunden den Überstand und die Zellen ernten.
Nach der IgG-Reinigung die Elution A auf einen Drei-Kilodalton-Molekulargewichts-Cutoff-Zentrifugalkonzentrator geben und bei 13.300 mal G für 40 bis 50 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Die Zentrifugation ist abgeschlossen, sobald das Restvolumen gleich oder kleiner als 50 Mikroliter ist. Verwerfen Sie den Durchfluss und fügen Sie 500 Mikroliter vorgekühltes 1X PBS hinzu, um den verbleibenden Überstand zu verdünnen.
Zentrifen Sie die Probe erneut unter den gleichen Bedingungen, bis 50 Mikroliter Restüberstand übrig sind. Um eine 100-fache Verdünnung des Überstands zu erhalten, fügen Sie 500 Mikroliter vorgekühltes 1X PBS hinzu und wiederholen Sie den Zentrifugationsprozess. Konzentrieren Sie den Überstand auf eine Endkonzentration von etwa 2,5 Gramm pro Liter in 40 Mikrolitern, um die Kompatibilität mit der Glykananalysemethode sicherzustellen.
Für die Glykananalyse werden 200 Mikroliter der magnetischen Perlenlösung in ein 2-Milliliter-PCR-Röhrchen übertragen. Legen Sie es auf den Magnetständer, um die Perlen vom Überstand zu trennen und den Überstand vorsichtig zu entfernen. Entfernen Sie dann die Röhrchen aus dem Magnetständer und fügen Sie die gereinigte Proteinprobe und den Wirbel hinzu.
Als nächstes fügen Sie den Versorgungsdenaturierungspuffer zum Probenröhrchen hinzu und inkubieren Sie acht Minuten lang bei 60 Grad Celsius. Halten Sie die Probenröhrchen offen, um eine optimale Reaktionsleistung zu erzielen. Nach der Inkubation PNGase F hinzufügen und weitere 20 Minuten bei 60 Grad Celsius inkubieren, um Glykane von den gereinigten Antikörpern zu trennen.
Nach der Freisetzung von N-Glykanen das Probenröhrchen und den Wirbel schließen. Dann fügen Sie Acetonitril zum Probenröhrchen hinzu, wirbeln Sie es vor und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für eine Minute. Legen Sie die Probenröhrchen in den Magnetständer, um die Perlen von der Lösung zu trennen.
Entfernen Sie dann vorsichtig mit einer Pipette den Überstand, ohne die Perlen zu berühren. Die fluorophorhaltige Glykan-Markierungslösung in die Probe in einem Abzug geben und durch Vortexen mischen. Nach einer 20-minütigen Inkubation bei 60 Grad Celsius mit offenen Deckeln entfernen Sie überschüssigen Farbstoff, indem Sie die Probe dreimal in Acetonitril waschen.
Dann eluieren Sie die markierten Glykane in doppelt destilliertem Wasser. Legen Sie das Probenröhrchen in den Magnetständer und sammeln Sie den mit gereinigten und markierten Glykanen angereicherten Überstand. Als nächstes bereiten Sie alle erforderlichen Standards und Proben vor und laden Sie sie in die dafür vorgesehenen Tray-Positionen.
Führen Sie das Glykananalyseprotokoll aus und analysieren und identifizieren Sie die in der Probe vorhandenen Glykane mit der entsprechenden Software. Die Western-Blot-Analyse zeigte eine reduzierte Fut8-Proteinexpression in Zellen, die mit einer Mischung aus drei Fut8-DsiRNA-Konstrukten transfiziert wurden. Glykanstrukturen aus den Knockdown-Zellen zeigten ebenfalls eine verminderte Fukosylierung.
Dieser Trend war in agalaktosylierten Strukturen am ausgeprägtesten und in geringerem Maße in galaktosylierten Strukturen zu beobachten. Eine zweifache Reduktion der Kernfucosylierung wurde durch Elektroporation unter Verwendung von zwei Rechteckwellenpulsen im Vergleich zu einem einzelnen Rechteckwellenpuls ohne signifikante Unterschiede in der Zelllebensfähigkeit beobachtet. Insgesamt hat die Erhöhung der kurzgradig störenden RNA-Konzentration eine große Störung der Kernfucosylierung als die Erhöhung der Erntezeit.
Das Verhältnis zwischen Wasser und Acetonitril bestimmt, ob Glykane in Lösung oder Teil der Kügelchen sind. Es ist wichtig, sich während der Waschschritte daran zu erinnern, um ein versehentliches Entfernen der markierten Glykane aus der Lösung zu vermeiden. Ein Folgeexperiment könnte die Charakterisierung gereinigter monoklonaler Antikörper unter Verwendung zellbasierter Assays zur Quantifizierung der Antikörper-abhängigen zellvermittelten Zytotoxizität und der komplementabhängigen Zytotoxizität beinhalten.
