Diese Arbeit wurde zum Teil durch Grant-in-Aid for Scientific Research für die Anfechtung der exploratorischen Forschung (JK), und der wissenschaftlichen Forschung (A) (JK und SM) aus dem Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Science, and Technology, Japan . Ein RIKEN FPR Gemeinschaft (RCE) lieferten zusätzliche Unterstützung. Die Autoren bedanken sich für Drs. Eisuke Chikayama, Yasuyo Sekiyama und Mami Okamoto, um technische Unterstützung bei den NMR-und statistische Analysen.

1. Filter Vorbereitung auf Extrahierbare entfernen <ol><li> Verwendung von 25 mm Durchmesser 0,22 um Porengröße Durapore PVDF hydrophilen Filter (Millipore). Die Filter sollten in einem sauberen 500 ml-Pyrex-Becherglas mit einer Pinzette. Vorspülen dreimal mit destilliertem Wasser. Swirl gut wie Sie, um die Filter aus aneinander kleben zu verhindern spülen. Dann werden 300 ml Milli-Q (Millipore) oder eine gleichwertige hochwertiges Wasser. Autoklav um die vollständige Entfernung der extrahierbaren von den Filtern zu erleichtern. </li><li> Abgießen, Milli-Q und dreifach wieder spülen Sie die Filter, diesmal mit Milli-Q. Mit einer Pinzette Ort individuelle Filter auf einem sauberen und trockenen Oberfläche (z. B. Alufolie) und entweder trocken zu einem vernünftigen Temperatur (zB 37 ° C) oder an der Luft trocknen. Die Filter sind nun einsatzbereit. </li></ol> 2. Filtration des Probenmaterials <ol><li> Zur Demonstration dieses Protokolls kann ein Millipore Edelstahl 3-Platz-Filter Verteiler mit 25-mm-Filter Mikroanalyse Säulen mit Glas unterstütztund eine mechanische Pumpe verwendet werden. Unter aseptischen Bedingungen legen Sie eine einzelne 25-mm-Filter auf dem Filter Säulenfuß, wenden Sie die Spalte und spannen zusammen. </li><li> Last 15 ml der Probe auf die Säule, öffnen Sie die Stop-Ventil auf dem Filter vielfältig, und schalten Sie die Pumpe. Filtern sie unter leichtem Druck auf dem Aufbrechen der Zellen (&lt;5 kPa) zu minimieren. Andere Pumpen, wie Hand oder einer peristaltischen Pumpe kann zu diesem Protokoll angepasst werden. Für geringere Dichte Proben, aufeinanderfolgende Zugaben von Wasser kann es erforderlich sein, lassen Sie sich nicht die Filter gehen über einen längeren Zeitraum zwischen den Zugaben von Wasser trocken. </li><li> Für marine Proben, nachdem Sie Ihre Probe gefiltert haben, können Sie eine optionale Süßwasser spülen, um das restliche paramagnetischen Ionen in Ihrer Probe und auf dem Filter zu reduzieren. Dies kann mit präziser Abstimmung der Magnet des Spektrometers zu helfen. Einfach sanft fügen Sie eine kleine Menge Wasser und filtriert durch Ihre gesammelten Probe am Ende. </li><li> Nach Filterung beendet ist, schalten Sie die Pumpe, und lassen Sie das Ventil OPEn, so gibt es immer noch Unterdruck unter dem Filter. Entfernen Sie die Klammer und Filter-Spalte. </li><li> Mit der einen Hand, verwenden Sie saubere Pinzette Halt des Filters zu nehmen. Falten Sie den Filter über sich selbst, aber nicht knittert. Mit der anderen Hand mit der Lippe einer sterilen 2-ml Zentrifugenröhrchen Halten Sie die Filter. Lassen Sie die Pinzette verwenden Sie sie dann wieder greifen Sie beide Kanten des Filters. Regrip in einem 45 ° Winkel in den Schoß. </li><li> Setzen Sie den Filter in die 2-ml-Tube und Freisetzung so dass es mit der Probe Seite nach innen öffnet. Sie können bis zu zwei Filter in das sterile 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen auf diese Weise. Bei Verwendung von zwei Filtern, sicherzustellen, dass sie überlappen so wenig wie möglich. Sofort einfrieren (mindestens -30 ° C). </li></ol> 3. Extraktion von wasserlöslichen Metaboliten <ol><li> Lyophilisieren Ihre Proben über Nacht oder für mindestens 10 Stunden. </li><li> Nach der Gefriertrocknung, fügen Sie ein Edelstahl-Brecher in jedes Röhrchen (Tokken). Fügen Sie 750 ul standardisierte KaliumPhosphat-NMR-Puffer in Deuteriumoxid (2 H&gt; 90%) mit 2,2-Dimethyl-2-silapentane-5-sulfonat (DSS)-Norm (KPi; 38,3 mM KH 2 PO 4, 61,7 mM K 2 HPO 4, 0,1 DSS mM, pH 7,0, 90% D 2 O) 2. </li><li> Beschallen die Proben für 5 Minuten bei 4 ° C in einem Wasserbad Ultraschallgerät (Bioruptor, Diagenode), die Zellmaterial aus dem Filter zu entfernen. Entfernen Sie die Filter mit sauberer Pinzette. </li><li> Die Zellen unter Verwendung einer Mühle Brecher (1600 rpm) für 5 Minuten. </li><li> Inkubation bei 65 ° C unter Schütteln (1400 rpm) auf einem Tisch-Schüttler (Eppendorf) für 15 Minuten. </li><li> Entfernen Sie die Metall-Schwein mit sauberer Pinzette, und zentrifugieren Sie die Probe bei 13.000 g für 5 Minuten. </li><li> Beziehen Sie den Überstand direkt an einem NMR-Röhrchen für die NMR-Spektroskopie. </li></ol> 4. NMR-Spektroskopie und Datenanalyse <ol><li> Legen Sie Ihre Probe in einem NMR-Spektrometer (hier ein Bruker-DRX-500-Spektrometer ausgestattet mitTXI Sonde mit Dreifach-Achse Gradienten von einem Computer mit XWIN-NMR) gesteuert. </li><li> Erhalten 1D-1 H-NMR-Spektren mit Hilfe geeigneter Methoden bisher veröffentlichten 2,15 aus dem XWIN-NMR-Schnittstelle. In der vorliegenden Studie 1 H-NMR-Spektren wurden an einem DRX-500 Spektrometer bei 500,03 MHz bei 298 K. Restwasser Signale aufgezeichnet wurden von der Watergate-Pulssequenz unterdrückt, mit einer Wiederholrate von 1,2 s. 128 Transienten wurden gesammelt, um 32.000 Datenpunkte pro Spektrum zu erhalten. </li><li> Übertragen Sie die NMR-Daten-Verzeichnisse auf einem PC installiert NMRPIPE Software 16. Verarbeiten Sie die Rohdaten und Set DSS als 0 ppm Verweis dann manuell Phase der Spektren. Digitalisieren Sie die spektralen Daten in eine Reihe von diskreten Werten durch die Integration oder &quot;Binning&quot; sie mit Software wie rNMR, Automics oder zum öffentlichen FT2B Paket aus dem ECOMICS Website ( <a href="https://database.riken.jp/ecomics/">https://database.riken.jp/ecomics/</a> ) 3,17. In thwird beispielsweise wurden Spektren zwischen 0,5 und 10,5 ppm über 0,032 ppm integraler Regionen mit ECOMICS und normalisierte sich entweder auf DSS oder insgesamt Signalintensität integriert. Output-Daten können nun für nachgeschaltete statistische Analyse wie z. B. Hauptkomponentenanalyse (PCA), die freie Software-Pakete wie R 18 verwendet werden. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel von 1 H-NMR-Spektren unter Verwendung der obigen Verfahren in Abbildung 1 gezeigt. Diese Proben von zwei Zeitpunkten eines Mikrokosmos Experiment zeigen deutliche Unterschiede aufgrund von Algen Stoffwechselaktivitäten. Die Tag 4-Spektrum zeigt das grosse Vorkommen Peaks, insbesondere in der 3-4 ppm-Bereich im Vergleich zum Tag 1 Probe. Diese Spitzen können Zucker durch blühende Kieselalgen innerhalb des Mikrokosmos produziert zugeschrieben werden. In einem ähnlichen Experiment vergleicht das Wachstum von natürlichem Plankton Gemeinden in künstlichen oder natürlichen Meerwasser, statistische Ansätze such als Principal Component Analysis (PCA) Score-Diagramm aus klassierten NMR-Spektren abgeleitet werden verwendet, um klare metabolische Unterschiede zwischen den beiden Behandlungen (Abb. 2) zeigen, während die Belastung Plots können Peaks innerhalb der Spektren zu identifizieren, die Form der Verteilung der Daten . Solche Ergebnisse können im Vergleich mit Daten von anderen omik Ebenen, wie aus genomischer Fingerabdruckverfahren (Abb. 3). Diese NMR-Peaks können einzeln abgefragt werden (zB an der BMRB; <a href="http://www.bmrb.wisc.edu/">http://www.bmrb.wisc.edu/</a> ) 19, oder ganze Spektren können statistisch ausgewertet werden (zB mit SpinAssign bei <a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search">http://prime.psc.riken. jp /? action = nmr_search</a> ) 2. In diesem Beispiel waren die Unterschiede zwischen den Behandlungen wegen einer Fülle von Spitzen in der Region Zucker (3,39 ppm bis 4,04 ppm) von Spektren aus natürlichen Planktongemeinschaft Metaboliten, und mehrere Gipfel Merkmal mit den Gemeinden künstlichem Meerwasser wurden vorläufig identified wie Lactat und Formiat mit SpinAssign. <img src="/files/ftp_upload/3163/3163fig1.jpg" alt="1" /> Abbildung 1. Vertreter 1 H-NMR-Spektren von Proben bearbeitet mit diesem Verfahren erhalten. Mikrokosmos Proben wurden vor (Tag 1) und während (Tag 4) einer intensiven Kieselalgenblüte genommen. NMR-Spektren wurden auf einem Bruker DRX-500 mit Signalen normiert auf den internen Standard Peakhöhe (; 0 ppm DSS) durchgeführt. <img src="/files/ftp_upload/3163/3163fig2.jpg" alt="2" /> Abbildung 2. Hauptkomponentenanalyse (PCA) Score-Diagramm gebinnten NMR-Spektren von metabolomes von natürlich abgeleitet mikrobiellen planktonischen Gemeinden in Mikrokosmen mit natürlich gewachsenen (offene Rauten) oder künstlicher (schwarze Kreise) Meerwasser. Klare metabolischen Unterschiede lassen sich im Streudiagramm beobachtet werden. Ein Be-Plot aus einer solchen Analyse können dann verwendet werden, um deutliche Spitzen in der Bedeutung identifizieren werdendas System, wobei diese Peaks können weiter analysiert werden, wie erforderlich. <img src="/files/ftp_upload/3163/3163fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Ein Beispiel für Multi-omik Analyse kombiniert NMR mit genomischen Daten. Gemeinschaft Zusammensetzung auf denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese von 18S (links) und 16S (rechts) rRNA-Gene aus den gleichen Proben wie in Abbildung 2 analysiert Basis zeigt auch verschiedene mikrobielle Gemeinschaft Muster zwischen natürlichen (offene Rauten) und künstliche (schwarze Kreise) Meerwasser Mikrokosmen. Eine solche Korrespondenz zwischen Genom und Metabolom von natürlichen Systemen zeigt den Nutzen dieses Ansatzes.

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Chem. 82, 1643-1652 (2011).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Filtration und Metaboliten Extraktionsverfahren hier gezeigt ermöglicht mikrobiellen Biomasse planktonischen in ausreichender Menge für die NMR-Metabolomik gesammelt werden. Während nur Extraktion von wasserlöslichen Metaboliten mit KPi und 1D 1 H-NMR nachgewiesen wird, können andere Extraktionslösungsmittel und spektroskopische Methoden verwendet werden. Ein gutes Beispiel ist die Verwendung von deuteriertem Methanol als semi-polaren Lösungsmittel, von dem gezeigt wurde, um überlegene NMR-Spektre...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> 0,22 um hydrophile Durapore-PVDF-Filter, 25 mm </td><td> Millipore </td><td> GVWP02500 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroanalyse Siebträger, 25 mm, Glasfritte Unterstützung </td><td> Millipore </td><td> XX1002500 </td><td></td></tr><tr><td> 3-Platz vielfältigen, 47 mm, Edelstahl </td><td> Millipore </td><td> XX2504735 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Wako </td><td> 169-04245 </td><td></td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 </td><td> Wako </td><td> 164-04295 </td><td></td></tr><tr><td> Deuteriumoxid, 2 H&gt; 90% </td><td> Campridge Isotope Laboratoties </td><td> DLM-4 </td><td></td<html> &gt; </tr><tr><td> DSS </td><td> Fluka </td><td> 92754 </td><td></td></tr><tr><td> Automill </td><td> Tokken </td><td> TK-AM4 </td><td> Edelstahl-Brecher enthalten </td></tr><tr><td> Thermomixer comfort </td><td> Eppendorf </td><td> 5355 000.011 </td><td></td></tr><tr><td> Bioruptor </td><td> Diagenode </td><td> UCD-200 </td><td></td></tr><tr><td> Vakuumverdampfer </td><td> EYELA </td><td> CVE-3100 </td><td></td></tr><tr><td> NMR- </td><td> Bruker </td><td> DRX-500 mit 5-mm-TXI Sonde </td><td></td></tr><tr><td> Spectral Binning-Tool </td><td> Ursprünglich entwickelt </td><td> FT2DB </td><td> <a href="https://database.riken.jp/ecomics/">https://database.riken.jp/ecomics/</a> </td></tr><tr><td> Metabolit Annotation Tool und Datenbank </td><td> Ursprünglich entwickelt </td><td> SpinAssign </td><td>= Nmr_search &quot;&gt; http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search </td></tr></tbody></table>

concentration of metabolites from low-density planktonic communities for environmental metabolomics using nuclear magnetic resonance spectroscopy

Environmental Metabolomik ist ein aufstrebendes Gebiet, die Förderung der neuen Verständnis ist in, wie Organismen reagieren und interagieren mit der Umwelt und miteinander auf biochemischer Ebene ein. Kernspinresonanz (NMR)-Spektroskopie ist eine von mehreren Technologien, einschließlich der Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS), mit äußerst viel versprechend für solche Studien. Vorteile bei NMR sind, dass sie für ungezielte Analysen ist, eine strukturelle Informationen und Spektren können in quantitativer und statistische Weise vor kürzlich verfügbaren Datenbanken der einzelnen Spektren Metaboliten 2,3 abgefragt werden. Darüber hinaus können NMR-Daten mit Daten aus anderen omik Ebenen (zB Transcriptomics, Genomik), um ein umfassenderes Verständnis der physiologischen Reaktionen von Taxa zueinander und die Umwelt bieten 4,5,6 kombiniert werden. Jedoch ist die NMR weniger empfindlich als andere Techniken metabolomische, was es schwierig macht apLage zur natürlichen mikrobiellen Systemen, bei denen Probe Populationen mit geringer Dichte und Metabolit-Konzentrationen niedrig, um Stoffwechselprodukte von gut definierten und leicht extrahierbar Quellen wie ganze Gewebe, Körperflüssigkeiten oder Zellkulturen. verglichen werden können Folglich haben die wenigen direkten Umweltaspekte metabolomische Studien von Mikroben durchgeführt, um Datum, um Kultur-oder leicht definiert High-Density-Ökosysteme wie Wirt-Symbiont-Systeme, konstruiert Co-Kulturen oder Manipulationen des Darms Umgebung, in der Markierung mit stabilen Isotopen kann beschränkt zusätzlich verwendet werden, um zu verbessern NMR-Signale 7,8,9,10,11,12. Methoden, die die Konzentration und Sammlung von Umweltdaten zu erleichtern Metaboliten in Konzentrationen für die NMR fehlen. Seit den letzten Augenmerk wurde auf die Umwelt Metabolomics von Organismen im Gewässer, in denen viel von der Energie-und Materialfluss von der Plankton-Gemeinschaft 13,14 vermittelt wird, gegeben worden ist, haben wir eine Methode zur Konzentration entwickelttion und Extraktion der gesamten Gemeinde-Metaboliten aus planktonischen mikrobiellen Systemen durch Filtration. Im Handel erhältliche hydrophilen Poly-1 ,1-Difluorethen (PVDF) Filter sind speziell behandelt, um vollständig zu entfernen extrahierbaren, die ansonsten als Verunreinigungen in den nachfolgenden Analysen auftreten. Diese behandelten Filter werden dann verwendet, um die Umwelt oder experimentellen Proben von Interesse zu filtern. Filter, die das nasse Probenmaterial werden lyophilisiert und wasserlöslichen Metaboliten werden direkt für die konventionelle NMR-Spektroskopie mit Hilfe eines standardisierten Kaliumphosphat Extraktionspuffer 2 extrahiert. Die Daten aus diesen Methoden abgeleitet werden können statistisch ausgewertet werden, um sinnvolle Muster zu identifizieren, oder mit anderen omik Ebenen für umfassende Verständnis von Gemeinschaft und Funktion des Ökosystems.

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Concentration of Metabolites from Low-density Planktonic Communities for Environmental Metabolomics using Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Ein Verfahren zur Extraktion aus mikrobiellen Metaboliten planktonischen Gemeinden vorgestellt. Ganze Gemeinde Probenahme durch Filtration auf speziell präparierten Filter erreicht. Nach der Gefriertrocknung sind wasserlösliche Metaboliten extrahiert. Dieser Ansatz ermöglicht eine Anwendung des Umweltrechts Metabolomik zu trans-omik Untersuchungen von natürlichen oder experimentellen mikrobiellen Gemeinschaften.

Konzentration der Metabolite von Low-Density-Planktonic Gemeinschaften für Umweltforschung Metabolomics mit Kernresonanzspektroskopie

Environmental metabolomics is an emerging field that is promoting new understanding in how organisms respond to and interact with the environment and each ...

concentration-metabolites-from-low-density-planktonic-communities-for

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K Aufrufe.  RIKEN Advanced Science Institute. Ein Verfahren zur Extraktion aus mikrobiellen Metaboliten planktonischen Gemeinden vorgestellt. Ganze Gemeinde Probenahme durch Filtration auf speziell präparierten Filter erreicht. Nach der Gefriertrocknung sind wasserlösliche Metaboliten extrahiert. Dieser Ansatz ermöglicht eine Anwendung des Umweltrechts Metabolomik zu trans-omik Untersuchungen von natürlichen oder experimentellen mikrobiellen Gemeinschaften.

Serie: Concentration of Metabolites from Low-density Planktonic Communities for Environmental Metabolomics using Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Microbial Communities in Nature and Laboratory - Interview

Mikrobielle Gemeinschaften in Natur und Labor - Interview

Forschung

Biologie

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

In-vitro-Markierung von humanen embryonalen Stammzellen für Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Analyzing Gene Expression from Marine Microbial Communities using Environmental Transcriptomics

Analogous to metagenomics, environmental transcriptomics (metatranscriptomics) retrieves and sequences environmental mRNAs from a microbial assemblage without prior knowledge of what genes the community might be expressing. Thus it provides the most unbiased perspective on community gene expression in situ. Environmental transcriptomics protocols are technically difficult since prokaryotic mRNAs generally lack the poly(A) tails that make isolation of eukaryotic messages relatively straightforward 1 and because of the relatively short half lives of mRNAs 2. In addition, mRNAs are much less abundant than rRNAs in total RNA extracts, thus an rRNA background often overwhelms mRNA signals. However, techniques for overcoming some of these difficulties have recently been developed. A procedure for analyzing environmental transcriptomes by creating clone libraries using random primers to reverse-transcribe and amplify environmental mRNAs was recently described was successful in two different natural environments, but results were biased by selection of the random primers used to initiate cDNA synthesis 3. Advances in linear amplification of mRNA obviate the need for random primers in the amplification step and make it possible to use less starting material decreasing the collection and processing time of samples and thereby minimizing RNA degradation 4. In vitro transcription methods for amplifying mRNA involve polyadenylating the mRNA and incorporating a T7 promoter onto the 3 end of the transcript. Amplified RNA (aRNA) can then be converted to double stranded cDNA using random hexamers and directly sequenced by pyrosequencing 5. A first use of this method at Station ALOHA demonstrated its utility for characterizing microbial community gene expression 6.

We present a method for generating cDNA from environmental mRNA. In general, total RNA is first collected from the environment, rRNA is selectively removed, mRNA is selectively amplified, and cDNA synthesized from the enriched mRNA pool is sequenced. Recovered sequences can be annotated using standard bioinformatics techniques to identify the expressed genes.

Analyse von Genexpressionsdaten aus marinen mikrobiellen Gemeinschaften mit Environmental Transcriptomics

Analogous to metagenomics, environmental transcriptomics (metatranscriptomics) retrieves and sequences environmental mRNAs from a microbial assemblage ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in unregulated concentrations are detrimental to cell viability1, 2. While living systems have evolved with endogenous and dietary antioxidant defense mechanisms to regulate ROS generation, ROS are produced continuously as natural by-products of normal metabolism of oxygen and can cause oxidative damage to biomolecules resulting in loss of protein function, DNA cleavage, or lipid peroxidation3, and ultimately to oxidative stress leading to cell injury or death4. 
Superoxide radical anion (O2&bull;-) is the major precursor of some of the most highly oxidizing species known to exist in biological systems such as peroxynitrite and hydroxyl radical. The generation of O2&bull;- signals the first sign of oxidative burst, and therefore, its detection and/or sequestration in biological systems is important. In this demonstration, O2&bull;- was generated from polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Through chemotactic stimulation with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), PMN generates O2&bull;- via activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase5. 
Nitric oxide (NO) synthase which comes in three isoforms, as inducible-, neuronal- and endothelial-NOS, or iNOS, nNOS or eNOS, respectively, catalyzes the conversion of L- arginine to L-citrulline, using NADPH to produce NO6. Here, we generated NO from endothelial cells. Under oxidative stress conditions, eNOS for example can switch from producing NO to O2&bull;- in a process called uncoupling, which is believed to be caused by oxidation of heme7 or the co-factor, tetrahydrobiopterin (BH4)8.
There are only few reliable methods for the detection of free radicals in biological systems but are limited by specificity and sensitivity. Spin trapping is commonly used for the identification of free radicals and involves the addition reaction of a radical to a spin trap forming a persistent spin adduct which can be detected by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. The various radical adducts exhibit distinctive spectrum which can be used to identify the radicals being generated and can provide a wealth of information about the nature and kinetics of radical production9.
The cyclic nitrones, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide, DMPO10, the phosphoryl-substituted DEPMPO11, and the ester-substituted, EMPO12 and BMPO13, have been widely employed as spin traps--the latter spin traps exhibiting longer half-lives for O2&bull;- adduct. Iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 is commonly used to trap NO due to high rate of adduct formation and the high stability of the spin adduct14.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was employed to detect nitric oxide from bovine aortic endothelial cells and superoxide radical anion from human neutrophils using iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 and 5,5-dimethyl-1-pyroroline-N-oxide, DMPO, respectively.

Nachweis von Stickstoffmonoxid und Superoxid-Radikalanion von paramagnetischer Resonanzspektroskopie von Zellen mit Spinfallen

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Quantifying Mixing using Magnetic Resonance Imaging

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture. This work involves mixing two viscous liquid streams using an in-line static mixer. The mixer is a split-and-recombine design that employs shear and extensional flow to increase the interfacial contact between the components. A prototype split-and-recombine (SAR) mixer was constructed by aligning a series of thin laser-cut Poly (methyl methacrylate) (PMMA) plates held in place in a PVC pipe. Mixing in this device is illustrated in the photograph in Fig. 1. Red dye was added to a portion of the test fluid and used as the minor component being mixed into the major (undyed) component. At the inlet of the mixer, the injected layer of tracer fluid is split into two layers as it flows through the mixing section. On each subsequent mixing section, the number of horizontal layers is duplicated. Ultimately, the single stream of dye is uniformly dispersed throughout the cross section of the device.
 Using a non-Newtonian test fluid of 0.2% Carbopol and a doped tracer fluid of similar composition, mixing in the unit is visualized using magnetic resonance imaging (MRI). MRI is a very powerful experimental probe of molecular chemical and physical environment as well as sample structure on the length scales from microns to centimeters. This sensitivity has resulted in broad application of these techniques to characterize physical, chemical and/or biological properties of materials ranging from humans to foods to porous media 1, 2. The equipment and conditions used here are suitable for imaging liquids containing substantial amounts of NMR mobile 1H such as ordinary water and organic liquids including oils. Traditionally MRI has utilized super conducting magnets which are not suitable for industrial environments and not portable within a laboratory (Fig. 2). Recent advances in magnet technology have permitted the construction of large volume industrially compatible magnets suitable for imaging process flows. Here, MRI provides spatially resolved component concentrations at different axial locations during the mixing process. This work documents real-time mixing of highly viscous fluids via distributive mixing with an application to personal care products.

Magnetic resonance imaging (MRI) provides a powerful tool to evaluate the effectiveness of process equipment during operation. We discuss the use of MRI to visualize mixing in a static mixer. The application is relevant to personal care products, but can be applied to a broad range of food, chemical, biomass and biological fluids.

Quantifizierung Mixing mit Magnetic Resonance Imaging

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture.  This work involves mixing two viscous liquid streams using an ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Reinigung von Transcripts und Metaboliten aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Köpfe

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect conditions over vast time periods and investigation of biological materials harbored inside could provide insight of ancient environments. To appropriately analyze these ecosystems and extract meaningful biological information from frozen soils and ice, proper collection and processing of the frozen samples is necessary. This is especially critical for microbial and DNA analyses since the communities present may be so uniquely different from modern ones. Here, a protocol is presented to successfully collect and decontaminate frozen cores. Both the absence of the colonies used to dope the outer surface and exogenous DNA suggest that we successfully decontaminated the frozen cores and that the microorganisms detected were from the material, rather than contamination from drilling or processing the cores.

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. A protocol is presented to collect and decontaminate permafrost cores of soils and ice. The absence of exogenous colonies and DNA suggest that microorganisms detected represent the material, rather than contamination from drilling or processing.

Entfernen von exogenen Materialien aus dem äußeren Teil der gefrorenen Kerne der Antike biologische Gemeinschaften beherbergte Innen zur Untersuchung

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect ...

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ecologically-important endpoints, though they are rarely considered in toxicological studies. D. melanogaster is emerging as a toxicology model for the behavioral, neurological, and genetic impacts of toxicants, to name a few. More importantly, species in the genus Drosophila can be utilized as a model system for an integrative framework approach to incorporate emergent properties and answer ecologically-relevant questions in&#160;toxicology research. The aim of this paper is to provide a protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants to be used as a model system for a range of phenotypic outputs and ecologically-relevant questions. More specifically, this protocol can be used to 1) link multiple biological levels of organization and understand the impact of toxicants on both individual- and population-level fitness; 2) test the impact of toxicants at different stages of developmental exposure; 3) test multigenerational and evolutionary implications of pollutants; and 4) test multiple contaminants and stressors simultaneously.

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

In this paper, we provide a detailed protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants with the goal of studying the impact of exposure on a range of phenotypic outputs at different developmental stages and for more than one generation.

Experimentelles Protokoll für die Verwendung von Drosophila als ein Wirbellosen Modellsystem für Toxizitätstests im Labor

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

Synthesis of 68Ga Core-doped Iron Oxide Nanoparticles for Dual Positron Emission Tomography /(T1)Magnetic Resonance Imaging

Here, we describe a microwave synthesis to obtain iron oxide nanoparticles core-doped with 68Ga. Microwave technology enables fast and reproducible synthetic procedures. In this case, starting from FeCl3 and citrate trisodium salt, iron oxide nanoparticles coated with citric acid are obtained in 10 min in the microwave. These nanoparticles present a small core size of 4.2 &#177; 1.1 nm and a hydrodynamic size of 7.5 &#177; 2.1 nm. Moreover, they have a high longitudinal relaxivity (r1) value of 11.9 mM-1&#183;s-1 and a modest transversal relaxivity value (r2) of 22.9 mM-1&#183;s-1, which results in a low r2/r1 ratio of 1.9. These values enable positive contrast generation in magnetic resonance imaging (MRI) instead of negative contrast, commonly used with iron oxide nanoparticles. In addition, if a 68GaCl3 elution from a 68Ge/68Ga generator is added to the starting materials, a nano-radiotracer doped with 68Ga is obtained. The product is obtained with a high radiolabeling yield (&#62; 90%), regardless of the initial activity used. Furthermore, a single purification step renders the nano-radiomaterial ready to be used in vivo.

Synthesis of 68Ga Core-doped Iron Oxide Nanoparticles for Dual Positron Emission Tomography /T1Magnetic Resonance Imaging

Here, we present a protocol to obtain 68Ga core-doped iron oxide nanoparticles via fast microwave-driven synthesis. The methodology renders PET/(T1)MRI nanoparticles with radiolabeling efficiencies higher than 90% and radiochemical purity of 99% in a 20-min synthesis.

Synthese von 68-Ga-Kern-dotierte Eisenoxid-Nanopartikeln für Dual Positronen-Emissions-Tomographie / (T1) Magnetic Resonance Imaging

Here, we describe a microwave synthesis to obtain iron oxide nanoparticles core-doped with 68Ga. Microwave technology enables fast and reproducible ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, microbiome modification is designed to concentrate genomic DNA of a target foodborne pathogen contaminant to facilitate the detection and subtyping of the pathogen in a single workflow. Here, we explain and demonstrate the sample preparation steps for the quasi-metagenomics analysis of Salmonella enterica from representative food and environmental samples including alfalfa sprouts, ground black pepper, ground beef, chicken breast and environmental swabs. Samples are first subjected to the culture enrichment of Salmonella for a shortened and adjustable duration (4&#8211;24 h). Salmonella cells are then selectively captured from the enrichment culture by immunomagnetic separation (IMS). Finally, multiple displacement amplification (MDA) is performed to amplify DNA from IMS-captured cells. The DNA output of this protocol can be sequenced by high throughput sequencing platforms. An optional quantitative PCR analysis can be performed to replace sequencing for Salmonella detection or assess the concentration of Salmonella DNA before sequencing.

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Here, we present a protocol to prepare DNA samples from food and environmental microbiomes for concerted detection and subtyping of Salmonella through quasimetagenomic sequencing. The combined use of culture enrichment, immunomagnetic separation (IMS), and multiple displacement amplification (MDA) allows effective concentration of Salmonella genomic DNA from food and environmental samples.&#160;