Ziel dieses Verfahrens ist es, Pflanzenextrakte mittels reiner Shift-NMR zu analysieren. Das folgende Protokoll enthält Schlüsselaspekte bei der Probenvorbereitung aus verschiedenen Pflanzenmatrizen, Vanilleblättern, Kartoffelknollen und Kapstachelbeerfrüchten sowie das detaillierte Schritt-für-Schritt-NMR-Verfahren zur Aufzeichnung optimaler reiner Shift-Psyche- und SAPPHIRE-Psyche-Spektren. Metabolic Profiling mittels Protonen-NMR ist die Kunst, Signal für Signal in den unzähligen Signalen innerhalb der NMR-Spektren eines komplexen biologischen Gemisches zu analysieren, mit dem Ziel, jeden Metaboliten in diesem Gemisch zu identifizieren.
Ziel ist es, Biomarker abzubilden, die unter anderem mit Chemotaxonomie, Phänotypisierung, organoleptischen Eigenschaften, Herkunftsbezeichnung, Stoffwechselreaktionen in Verbindung gebracht werden könnten. Die Protonen-NMR wird häufig bei der Erstellung von Stoffwechselprofilen eingesetzt. Die große Anzahl von Signalen mit expandierenden Multiplizitäten, die auf einen engen Produktspektralbereich beschränkt sind, führt jedoch zu einer starken Überlappung, die die Analyse und Interpretation des Spektrums erschwert.
Typischerweise hat eine einzelne Resonanz eine Breite von einem bis fünf Hertz. Ein stark gekoppeltes Signal kann sich jedoch über 25 bis sogar 50 Hertz ausbreiten, was die Wahrscheinlichkeit einer Signalüberlappung erhöht. Um diese Einschränkung zu überwinden, verwenden wir die moderne reine Shift-NMR-Methode, um die spektrale Auflösung bekannt zu geben, wie hier in drei verschiedenen Anlagenszenarien gezeigt.
Die Probenvorbereitung, die Vorbereitung von Pflanzenextrakten kann auf viele Arten durchgeführt werden und das Verfahren hängt von der Matrix ab. Die Kapstachelbeerfrüchte wurden zunächst zu einem Saft homogenisiert. Die Vanilleblätter wurden intakt verwendet und die Kartoffeln in Scheiben geschnitten, um sie vor Oxidation zu schützen.
In allen Fällen wurde das Material lyophilisiert, gemahlen und anschließend extrahiert. Für die Kapstachelbeerfrüchte und die Kartoffeln wurde Wasser für die Extraktion mit Hilfe von Ultraschall verwendet. Der Überstand wurde durch Zentrifugation zurückgewonnen, die Flüssigkeit wurde durch Lyophilisation oder Speed-Vac getrocknet.
Der Trockenextrakt wurde in Oxalatpuffer resuspendiert, bis zur Trockenheit verdampft und in D2O-haltigem TMSP wieder gelöst. Im Falle von Vanille erfolgte die Extraktion direkt unter Verwendung von deuteriertem Phosphatpuffer, der TMSP und deuteriertes Methanol enthielt. Der Überstand wurde ebenfalls durch Zentrifugation zurückgewonnen.
Alle Proben wurden durch einen PTFE-Spritzenvorsatzfilter filtriert, und die NMR-Röhrchen wurden mit 0,6 Millilitern der gefilterten Lösung gefüllt. Die Probenvorbereitung in der NMR-Metabolomik ist entscheidend. Da das Verfahren vielleicht hunderte Male wiederholt wird, sollte es genau auf die gleiche Weise zubereitet werden, um sicherzustellen, dass die beobachtete Varianz nicht auf die Probenvorbereitung zurückzuführen ist, sondern auf reale Unterschiede zwischen den untersuchten Pflanzen.
Reine Shift-NMR. Das NMR-Spektrum wird nach der Fourier-Transformation des FID-Signals erhalten. Das FID-Signal kann in zwei Komponenten zerlegt werden, die chemische Verschiebungsmodulation und die J-Kopplungsmodulation, die für das J-Kopplungsaufteilungsmuster verantwortlich ist.
Die J-Kopplungsmodulation könnte durch ein J-Kopplungs-Refokussierungselement refokussiert werden, das passive Spins selektiv invertiert, während die aktiven Spins unbeeinflusst bleiben. Nach zwei gleichen Verzögerungen wird die chemische J-Kopplung vollständig neu fokussiert. Das Psyche-Element, das auf einem Anti-z-COSY-Experiment basiert, ist eines der robustesten und empfindlichsten Breitband-Refokus-Elemente, was es für die NMR-Metabolomik geeignet macht.
Reine Verschiebungsexperimente basieren auf der Neufokussierung der Entwicklung der J-Kopplung während der Aufzeichnung chemischer Verschiebungen. Dies wird typischerweise durch Erhöhen der Verzögerungen erreicht, um den Refokussierungspunkt der J-Kopplung zu verschieben. Da sich die chemische Verschiebung mit einer höheren Frequenz als die J-Kopplung entwickelt, kann ein homonukleares entkoppeltes Experiment in Interferogramm-Form aufgezeichnet werden.
Die Interferogrammerfassung besteht in der Aufzeichnung der FID in kleinen Blöcken mit dem Refokussierungspunkt der J-Kopplungsentwicklung, der immer mit dem Zentrum des erfassten Chunks zusammenfällt. Die entkoppelte FID wird erstellt, indem jeder nachfolgende Chunk verkettet wird. Einrichtung der NMR-Datenerfassung, übertragen Sie die Proben an das NMR-Spektrometer.
Stimmen Sie den Sondenkopf ab und passen Sie ihn an, sperren und unterlege die Probe. Kalibrieren Sie den 90-Grad-Hartimpuls. Führen Sie ein standardmäßiges 1D-Protonen-NMR-Spektrum durch.
Psyche-Experiment. Wählen Sie die zurückgesetzte psyche 1D-Pulssequenz aus der Bruker TopSpin-Bibliothek aus. Stellen Sie die Spektralbreite auf fünf Kilohertz ein.
Die Verzögerung der Entspannungswiederherstellung beträgt mindestens ein oder zwei Sekunden. Der Dummy scannt bis 16. Die Anzahl der Scans auf 64 oder 128 und die Anzahl der komplexen Datenpunkte pro Block, entweder 64 oder 128, legen die gewünschte Anregung des Chirp-Puls-Flip-Winkels fest.
Eine gute Mischung aus Empfindlichkeit und geringen Rekopplungsartefakten besteht darin, die Konstante von 61 bis 20 Grad, 10 Kilohertz für die Chirp-Impulsbandbreite einzustellen. Stellen Sie die Länge des harten Pulses auf das zuvor kalibrierte Volumen und die Pulslänge der Psyche-Form auf 30 Millisekunden ein. Wählen Sie die Crp_psyche aus.
20 Formimpulse für das Psyche-Element. Die Stärke des Pulsfeldgradienten, der während des Psyche-Elements angelegt wird, wird normalerweise je nach Sonde zwischen einem und 4 % der maximalen Stärke des Gradienten eingestellt. Wählen Sie RECT aus.
1 für den Gradientenformimpuls. Legen Sie die Anzahl der Blöcke fest, die abgerufen werden sollen, um die reine Shift-FID zu rekonstruieren. In der Regel bieten 16 oder 32 Blöcke mit 64 oder 128 komplexen Punkten pro Block eine ausreichende digitale Auflösung, leiten das Spektrum ab und verarbeiten die Daten.
Mit Brukers proc_reset AU-Programm und dann Fourier-Transformation. Wir empfehlen, das Spektrum mit Nullfüllung und einer Sinusglocken-Apodisierung zu transformieren. Psyche ist ein Pseudo-2D-Interferogramm-Experiment.
Es handelt sich um eine Software von periodischen Seitenspannenartefakten, die aus der Entwicklung der kleinen J-Kopplung während der Erfassung jedes Blocks stammen, die typischerweise zwischen fünf und 20 Millisekunden liegen, bei der Analyse reiner Verbindungen können diese Artefakte vernachlässigt werden, da sie normalerweise weniger als 5% des übergeordneten Peaks ausmachen. In komplexen Gemischen kann das Seitenspannenartefakt eines Metaboliten jedoch genauso groß oder größer sein als das Signal weniger konzentrierter Metaboliten, was die Genauigkeit der Stoffwechselanalyse beeinträchtigt. Diese Artefakte können effizient entfernt werden, indem ein Experiment zur Modifikation der Psyche namens SAPPHIRE psyche verwendet wird, das im Morris Lab SAPPHIRE Psyche Experiment entwickelt wurde.
Um das entkoppelte Spektrum zu erreichen, erhält die Pulssequenz kleine Stücke des FID-Refokussierung in der J-Kopplung in der Mitte jedes Blocks. Während jedes Blocks tritt jedoch eine kleine J-Kopplungsentwicklung auf, die die periodischen Seitenbandartefakte erzeugt. Das SAPPHIRE-Psyche-Experiment ist eine Modifikation der regulären Psyche-Sequenz, bei der diese periodischen Artefakte durch systematische Phasenmodulation entfernt werden, die durch eine Verschiebung des J-Refokussierungspunktes erreicht wird.
Nach dem Hinzufügen jeder Phasenmodulation wird die Entwicklung der verbleibenden J-Kopplung stark unterdrückt, was zu einem viel saubereren reinen Verschiebungsspektrum führt. Wählen Sie die SAPPHIRE Psyche-Pulssequenz aus und stellen Sie die Parameter der Pulssequenz ein. Diese Sequenz gehört nicht zu Brukers Repertoire, jedoch können die Sequenz und die Verarbeitungsprogramme von der Website der Manchester NMR Methodology Group bezogen werden.
Die Standardparameter sind auf folgende Werte eingestellt: fünf Kilohertz spektrale Breite, mindestens ein bis zwei Sekunden Relaxationsverzögerung. 16 Dummy-Scans, acht oder 16 Scans pro Inkrement, und D2 auf 14 Millisekunden eingestellt. Dieser Parameter stellt sicher, dass die Relaxation T2 mit jedem J-Modulationsinkrement konstant bleibt.
Stellen Sie den gewünschten Wert für den Chirp-Impuls-Flip-Winkel, den Anregungswert und die Impulsbandbreite ein. Stellen Sie die Länge des harten Pulses auf den zuvor kalibrierten Wert und die Pulslänge der Psyche-Form auf 30 Millisekunden ein. Wählen Sie den PSYCHE_Saltire_10kHz_30m Formimpuls für das Psyche-Element.
Legen Sie die Stärke des Pulsfeldgradienten fest, der während des Psyche-Elements angewendet wird. Wählen Sie RECT. 1 für die Verlaufsform aus.
Stellen Sie die Anzahl der Saphir-J-Modulationsschritte in F2 ein, normalerweise sorgen acht Schritte für eine hervorragende Unterdrückung von Seitenbandartefakten. Legen Sie die Spektralfenster F1 und F2 fest, die aus dem ausgewählten Wert des Spektralfensters F3 berechnet werden, indem Sie die folgenden Ausdrücke verwenden. Die Dauer des reinen Shift-Blocks, die als eins über SW1 beschrieben wird, liegt in der Regel zwischen 20 und 40 Millisekunden.
Legen Sie die Anzahl der reinen Shift-Blöcke fest. Da die SAPPHIRE-Psyche die Entkopplungsphasenmodulation des ersten Blocks kompensieren muss, muss ein zusätzlicher Block hinzugefügt werden. In der Regel ergeben 17 oder 33 Blöcke eine ausreichende digitale Auflösung.
Verarbeiten Sie die Daten, führen Sie sie in den Programmen pm_pshift und pm_fidadd AU aus, gefolgt von der Fourier-Transformation, wir empfehlen, das Spektrum mit Nullfüllung zu transformieren und die Glockenapodisierung zuzuweisen. Ergebnisse, SAPPHIRE-Psyche-Experimente erhöhen die Spektrenauflösung, indem sie gekoppelte Resonanzen zu schön scharfen Einzellingen kollabieren, wie in drei verschiedenen Pflanzenmatrizen gezeigt. Vanilleblätter, Physalis Peruviana-Früchte und Kartoffelknollen mit SAPPHIRE-Psyche-Komplex-Multiplizitäten zum Beispiel, die hochgekoppelten Wasserstoffatome der Homozitronensäure, die fast kontinuierliche Signale erzeugen, die sich über 40 Hertz ausdehnen, kollabierten zu drei scharfen Singuletts.
Reduzieren Sie das Gedränge, das andere Signale in der Umgebung überdecken könnte. Die zunehmende Auflösung ermöglichte es auch, den stark überlappenden Bereich zwischen 2,6 und 2,8 PPM, in dem Homozitronensäure Lacton ist und Apfelsäureresonanzen auftreten, klar zu entwirren. Wichtige Biomarker in Vanille, die sich beispielsweise mit denen von Glucosiden in der regulären Protonen-NMR überlappen, wurden aufgrund dieses herausragenden Auflösungsgewinns in den SAPPHIRE-Spektren besser identifiziert. Schlüsse.
Pure Shift ist ein hervorragendes neues Werkzeug für die pflanzliche Metabolomik. Es erhöhte die Spektralauflösung drastisch und ermöglicht daher eine einfachere Identifizierung von Metaboliten, eine feinere Korrelationsmetrikanalyse und eine bessere Interpretation der multivariaten Analyse. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, haben Sie ein gutes Verständnis dafür, wie Sie verschiedene Planextrakte für die NMR-Analyse vorbereiten und wie Sie die optimale reine Shift-Psyche und das SAPPHIRE-Psyche-Spektrum aufzeichnen können.
