Diese Arbeit wurde durch die NIH gewährt K08 AI062732, K12 HD001401 und 1UL1RR024139-02 und einem Child Health Research Grant von der Charles H. Hood Foundation zu SB-M finanziert. und von der Research Foundation an der State University of New York at Stony Brook.

1. EBV Stoffaufbereitung <ol><li> Subculture exponentiell wachsenden B95-8-Zellen (ATCC # CRL 1612; 13) auf 3 x 10 5 Zellen / ml in einem 75 cm 2 Zellkulturflasche mit sterilen Technik. Die Zellen werden in kompletten RPMI 1640 mit 10% Hitze-inaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), Penicillin / Streptomycin bei 100U/ml und 100 ug / ml, und Amphotericin B bei 0,5 pg / ml bei 37 ° C in der Gegenwart von 5% CO 2. </li><li> Achtundvierzig Stunden später, die Zellen in frisches vollständiges RPMI 1640 mit 1 x 10 6 Zellen / ml. Zur Induktion Virus-Produktion stimulieren Zellen mit 20ng/ml Tetradecanoyl Phorbol-Acetat (TPA) für 1 Stunde in einem Standard-CO 2-Inkubator. Wash Zellen dreimal mit RPMI 1640 zu TPA zu entfernen. </li><li> Die Zellen in das ursprüngliche Volumen des kompletten RPMI 1640 (von 1,2) und der Kolben in CO 2-Inkubator für 96 Stunden. Diese Methode hat sich gezeigt, dass hohe Titer von infektiösen Virus par produzierenTeilchen 6. </li><li> Zentrifugation bei 600 x g für 10 min bei 4 ° C zu EBV-haltigen Kulturüberstand von Zellen zu trennen. Filter Überstand durch ein 0,45-Mikron-Filter, Aliquot und bei -70 ° C über einem Jahr. Eine Alternative ist der Überstand von B95-8 Zellen mit EBV aus der ATCC (VR-1492) zu erhalten und den Einsatz bei der Verdünnung durch die ATCC empfohlen. </li></ol> 2. Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) <ol><li> Draw 10 ml Blut vom Spender in einer heparinisierten Spritze oder einer heparinisierten Blut Röhre. Verdünnen Sie das Blut mit 20 ml PBS bei Raumtemperatur in einem 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Underlay verdünntes Blut mit 15 ml Ficoll Hypaque Lymphozyten Trennmedium. Zentrifugation bei 225 x g ohne Bremse bei Raumtemperatur für 30 Minuten. </li><li> Entfernen Buffy-Coat und den Transfer in ein neues 50 ml konischen Röhrchen. Raise Volumen von 50 ml mit PBS und Spin bei 600 xg bei Raumtemperatur für 10 Minuten. </li><li> Pour off Überstand. Wash-Zellen durch Resuspendieren Pellet in 50 ml PBS und Spinnen bei 600 x g bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Wash zweimal in ähnlicher Weise. </li><li> Resuspendieren gewaschenen Zellen in 1 ml vollständigem RPMI. Verwenden Sie 5 ul der Zellen zu einer 1 / 10 Verdünnung in Trypanblau vorzubereiten. Graf lebenden Zellen mit Hilfe einer Zählkammer. </li><li> Die Lautstärke mit komplettem RPMI in einer 25 cm 2 Zellkulturflasche auf eine Zellkonzentration von 2 x 10 6 / ml erhalten. </li></ol> 3. Eine Infektion mit EBV <ol><li> Add FK506 (AG Scientific) zur Zellsuspension von 2,6 auf eine Endkonzentration von 20 nM. Küvette in CO 2-Inkubator bei 37 ° C für eine Stunde. </li><li> Schnell Tauwetter ein Aliquot von EBV. Entfernen Flasche aus Inkubator und fügen EBV zu den Zellen in 1 / 10 Verdünnung. In der Regel bietet diese Verdünnung einer MOI von 50-100. Swirl Kolben zu mischen und legen Sie sie aufrecht in CO 2-Inkubator bei 37 ° C. </li></ol> Hinweis thIn Schritt 4 durchgeführt, um Erfolg vorherzusagen, ist ein optionaler Schritt. Wenn Schritt 4 ausgeführt werden soll, müssen Sie eine zusätzliche Flasche un-infizierten PBMC bei 2 x 10 6 Zellen / ml als Kontrolle inkubiert. 4. Identifizieren proliferierenden Zellpopulation (optionaler Schritt) <ol><li> Bereiten FACS-Puffer: PBS + 5% FBS. Lagerung bei 4 ° C. </li><li> Nehmen Sie die folgenden Antikörper mischt in 50 ul Volumen jeweils zum Färben von Zellen in Schritt 4.6. Antikörper-Verdünnungen sollten in FACS-Puffer mit 1mg/ml von Maus-IgG (Sigma) auf nicht-spezifische Bindung von Antikörpern hemmt werden. <ol class="lroman"><li> Single-gefärbt mit PE-konjugierte anti-CD23-Antikörper (1 / 50 Verdünnung) </li><li> Single-mit FITC-konjugierte anti-CD58-Antikörper (1 / 50 Verdünnung) </li><li> Single-gefärbt mit PE-Cy5-konjugierte anti-CD19-Antikörper (1 / 50 Verdünnung) </li><li> Triple-gefärbt CD23, CD58 und CD19 (1 / 50 Verdünnung jeder) </li><li> Single-gefärbt mit PE konjugiert IsotypkontrolleAntikörper abgestimmt auf CD23-PE (bei der gleichen Konzentration wie anti-CD23-Antikörper) </li><li> Single-mit FITC konjugiert Isotypkontrollantikörper abgestimmt auf CD58-FITC (bei der gleichen Konzentration wie anti-CD58-Antikörper) </li><li> Single-gefärbt mit PE-Cy5 konjugiert Isotypkontrollantikörper auf abgestimmt CD19-PE-Cy5 (bei der gleichen Konzentration wie anti-CD19-Antikörper) </li><li> Triple-gefärbt mit allen drei Isotypkontrolle Antikörper. </li></ol> Vorübergehend speichern mischt bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> In dem dritten Tag nach der Exposition mit EBV, schwenken Kolben zu erhalten eine gleichmäßigere Zellsuspension. Entfernen Sie 2ml von Kolben in ein 2ml Eppendorf-Röhrchen. Spin Rohr in einer Mikrozentrifuge mit 3000 rpm bei Raumtemperatur für 3 Minuten. </li><li> Saugen Sie den Überstand und die Zellen in FACS-Puffer bei 5 x Oktober von 06 bis 1 x 10 7 Zellen / ml. </li><li> Entfernen Sie acht 50 ul Aliquots in einzelne Eppendorf-Röhrchen oder einer 96-Well V-Bodenplatte. Spin-Röhrchen oder die Platte bei 1500 x gfür 3 Minuten. </li><li> Überstand verwerfen und Wirbelrohren / Platte. Die Zellen in jedes Röhrchen / well in 50 ul FACS-Puffer mit geeigneten Antikörper-Verdünnungen in 4,2 vorbereitet. </li><li> Die Röhrchen / Platte auf Eis im Dunkeln für 30 Minuten. Centrifuge Zellen bei 3000 rpm für 3 Minuten, entfernen Sie den Überstand und 200 ul FACS-Puffer. Centrifuge Zellen wieder und entfernen Überstand der Wäsche komplett. Wiederholen Sie zwei weitere Wäschen. </li><li> Die Zellen in 200 ul FACS Puffer und Daten erfassen mit einem Durchflusszytometer, Erwerb 20.000 Events / Rohr. </li><li> Analysieren von Daten mit WinMDI (freeware für FACS Datenauswertung am PC). Tor auf lebende Zellen mit Vorwärts-und Seitwärts-Streulicht-Profilen. Dann Tor lebenden Zellen für die Expression von CD19 + (B-Zell-Marker) nach einem Vergleich mit Zellen, die mit Isotypkontrollantikörper abgestimmt auf anti-CD19-Antikörper gefärbt. Plot CD19 + Live-B-Zellen mit Fluoreszenz-Intensität für CD23 auf der x-Achse und Fluoreszenzintensität für CD58 auf der y-Achse. Bestimmen CD23 + und CD58 +-Zellen durch einen Vergleich mit EBV-exponierten Zellen mit aufeinander abgestimmten Isotypkontrolle Antikörpern gefärbt. Anwesenheit von CD23 +-Zellen CD58 hallo in EBV-exponierten Kultur (Abbildung 2C) prognostiziert erfolgreiche Auswuchs der EBV-infizierten Wachstum transformierten Zellen. Im Gegensatz dazu CD23 hallo CD58 +-Zellen nicht entstehen, wenn Zellen nicht zu EBV (Abbildung 2A) ausgesetzt sind oder ausgesetzt zu einem nicht verewigen Stamm EBV (Abbildung 2B). CD23 CD58 +-Zellen hallo wurden experimentell nachgewiesen, dass die Proliferation zu unterziehen und anschließend zu etablieren LCL (14). </li></ol> 5. Expansion und Kryokonservierung von LCL <ol><li> Visualisierung von Zellen durch Lichtmikroskopie: Durch eine Woche nach EBV-Infektion, sind Cluster von Zellen sichtbar unter dem Lichtmikroskop. Abbildung 3 zeigt ein Beispiel der frühen mikroskopischen Cluster (Abbildung 3B) in einem Kolben. </li><li> Mit fortschreitender Zeit werden mikroskopische Cluster größer, so dass Klumpen sind sichtbarmakroskopisch in den Kolben. 3C zeigt größere Cluster von Zellen in etablierte LCL mittels Lichtmikroskopie. </li><li> Feeding-Zellen: Doppelte Volumen Kulturmedium in der Kulturflasche am Tag 12. Anschließend erweitern Kultur durch eine Erhöhung der Lautstärke 2-3 fach mit komplettem RPMI. </li><li> Die Periodizität der Fütterung Zellen sollten auf der Grundlage von Zellwachstum bestimmt werden. Wenn das Kulturmedium gelb wird, ist es in der Regel Zeit, um die Medien wie oben ersetzen. In der Regel tritt diese einmal pro Woche. Jedoch können einige Zelllinien müssen mehr oder weniger häufig gefüttert werden. Expand Kultur 75-100 ml in den nächsten paar Wochen. </li><li> Kryokonservierung: Beim Einfrieren unten Zellen, Zentrifuge Zellen bei 600 x g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Zellpellet in kaltem Einfriermedium mit 90% FBS und 10% Dimethylsulfoxid bei 1 x 10 7 Zellen / ml. Das Röhrchen in flüssigem Stickstoff. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Erfolgreiche Bilanz wird durch die Anwesenheit von CD23 +-Zellen CD58 hallo vorhergesagt. Etwa 2-3% der lebenden Zellen an Tag 3-4 nach Exposition gegenüber EBV sollte das Profil (Abb. 2C). Andere Sub-Populationen von CD23 +, CD23 -, CD58 + und CD58 - Zellen beobachtet nach der Exposition gegenüber EBV zeigen minimale Proliferation 14. Un-infizierten Zellen (Abbildung 2A) und Zellen, die EBV von HH514-16-Zellen (Abbildung 2B), Beherbergung einer nicht verewigen Stamm EBV, zeigen nicht CD23 hallo CD58 +-Zellen. Sie können auch visualisieren Zellen unter dem Lichtmikroskop zu Erfolg zu überwachen: Wie bereits erwähnt, innerhalb einer Woche nach EBV-Infektion, sind kleine Gruppen von Zellen in der Flasche sichtbar durch Licht-Mikroskopie (Abbildung 3B). Mit fortschreitender Zeit und Zellen in LCL entwickeln, werden mikroskopisch kleine Cluster größer (Abbildung 3C), so dass Klumpen zu sehen sind makroskopisch in den Kolben. Abbildung 1. Workflow zur Erzeugung und Kryokonservierung von lymphoblastoiden Zelllinien. Periphere Blut wird durch einen Ficoll-Gradienten zentrifugiert. PBMC in der Buffy-Coat eines etablierten Gradienten sind FK506 durch Zugabe von EBV gefolgt ausgesetzt. EBV-exponierten Zellen werden bei 37 ° C in Anwesenheit von 5% CO 2 zu errichten und anschließend zu erweitern LCL für die Kryokonservierung gewachsen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3321/3321fig2.jpg" /> Abbildung 2. Identifizierung einer Subpopulation von B-Zellen erwartet, dass die Proliferation nach Exposition mit EBV zu unterziehen. Un-infizierten PBMC (A) oder PBMC ausgesetzt EBV abgeleitet von HH514-16-Zellen (B) oder von B95-8-Zellen (C) in Gegenwart von FK506 wurden am Tag 3 geerntet. Die Zellen wurden mit Fluorochrom-konjugierten Antikörper gegen CD19, CD23, CD58 und Regie gefärbt. Nach Gating auf lebenden Zellens, un-infizierten (A) und EBV-ausgesetzt (B und C) CD19 + B-Zellen wurden für die Expression von CD23 und CD58 untersucht. Eine Subpopulation von B-Zellen, die CD58 und ein hohes Maß an CD23 (CD23 hallo CD58 +), beobachtet nur in den Zellen, die Transformation kompetenter EBV (abgeleitet von B95-8-Zellen), dargestellt ist. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3321/3321fig3.jpg" /> Abbildung 3. Visualisierung der Zellhaufen in EBV-infizierten Zellen. PBMC wurden mit FK506 behandelten und infizierten mit EBV. Un-infizierten (A) und EBV-ausgesetzt (B) Zellen wurden untersucht 1 Woche nach der Infektion durch Phasenkontrast-Mikroskopie (10fache Vergrößerung). Fünf Wochen alte lymphoblastische Zellinie ist in C gezeigt

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Methode in diesem Papier beschrieben erzeugt LCL vom Spender peripheren Blut mit schnellen Immortalisierung und Kryokonservierung Zeiten. Durch den Einsatz von FK506, ein T-Zell-Immunsuppressivum, und hohe Titer von infektiösen Viren sind wir in der Lage, die Proliferation der EBV-infizierten B-Zellen aus dem peripheren Blut mononukleären Zellen zu fördern. Diese Eingriffe machen das beschriebene Verfahren effizienter zu gestalten, was zu einer raschen Expansion von Zellen für die nachfolgenden Experimente. Traditionell wurde das Wachstum Transformation durch Visualisierung von Clustern von Zellen unter dem Lichtmikroskop etwa eine Woche nach der Exposition gegenüber EBV 6, 15 überwacht. Allerdings ist Clustering von Zellen, die nicht einer bestimmten Indikator für EBV-vermittelte Wachstum Transformation. Wir haben früher die konsistente Identifikation der proliferierenden Zellpopulation über Durchflusszytometrie 14 gezeigt, und bietet eine genaue und spezifische Methode zur erfolgreichen Ergebnis so früh zu bestimmen, wie 3 Tage nach achterner Exposition der B-Zellen, die EBV.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Amphotericin B </td><td> Fisher BioReagents </td><td> BP 928-250 </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxid </td><td> Sigma </td><td> D 2650 </td></tr><tr><td> Rinderfötenserum, hitzeinaktiviertem </td><td> Sigma </td><td> F 4135 </td></tr><tr><td> Ficoll Hypaque Lymphozyten Trennmedien </td><td> Mediatech </td><td> 25-072 </td></tr><tr><td> FK506 </td><td> AG Scientific </td><td> F 1030 </td></tr><tr><td> IgG aus Maus-Serum </td><td> Sigma </td><td> I 8765 </td></tr><tr><td> Maus anti-human CD23 konjugiert PE </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555711 </td></tr><tr><td> Maus Isotyp IgG1 konjugiert PE </td><td> BD Pharmingen </td><td> 554680 </td></tr><tr><td> Maus anti-human CD58 konjugiert FITC </td><td> Pierce Thermo Scientific </td><td> MA1-82159 </td></tr><tr><td> Maus Isotyp IgG1 FITC konjugiert </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550616 </td></tr><tr><td> Maus anti-human CD19 konjugiert PE-Cy5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555414 </td></tr><tr><td> Maus Isotyp IgG1 konjugiert PE-Cy5 </td><td> Dako </td><td> X 0955 </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 Medium </td><td> Sigma </td><td> R 8758 </td></tr><tr><td> Tetradecanoyl Phorbol-Acetat (TPA) </td><td> Calbiochem </td><td> 407952 </td></tr><tr><td> FACS-Puffer (1X Phosphate Buffered Saline + 5% fötalem Rinderserum) </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

establishment of epstein-barr virus growth-transformed lymphoblastoid cell lines

Die Infektion von B-Zellen mit Epstein-Barr Virus (EBV) führt zu Vermehrung und anschließende Immortalisierung, was in Gründung lymphoblastoiden Zelllinien (LCL) in vitro. Da LCL latent mit EBV infiziert sind, stellen sie ein Modellsystem zur EBV-Latenz-und Viren-driven B-Zell-Proliferation und Tumorgenese 1 Untersuchen. LCL wurden verwendet, um Antigene in einer Vielzahl von immunologischen Assays 2, 3 zu präsentieren. Darüber hinaus können LCL verwendet, um humane monoklonale Antikörper 4, 5 zu erzeugen und eine potentiell unbegrenzte Quelle, wenn der Zugang zu primären biologischen Materialien 6, 7 begrenzt ist. Eine Vielzahl von Methoden beschrieben worden, LCL generieren. Frühere Methoden haben den Einsatz von Mitogene wie Phytohämagglutinin, Lipopolysaccharid 8 enthalten, und Pokeweed mitogen 9, um die Effizienz der EBV-vermittelte Immortalisierung zu erhöhen. In jüngerer Zeit haben andere immunosuppr verwendetEssiv Substanzen wie Cyclosporin A zu hemmen T-Zell-vermittelte Abtötung der infizierten B-Zellen 7, 10-12. Die beträchtliche Länge der Zeit von EBV-Infektion für die Niederlassung von Zelllinien treibt die Forderung nach schneller und zuverlässiger Methoden zur EBV-driven B-Zell-Wachstum Transformation. Mit einer Kombination aus hohen Titer EBV und ein Immunsuppressivum, sind wir in der Lage, konsequent zu infizieren, transformieren und erzeugen LCL von B-Zellen im peripheren Blut. Diese Methode verwendet eine kleine Menge von peripheren mononukleären Zellen, die in vitro-Cluster von Zellen infiziert sind, nachgewiesen werden kann. Die Anwesenheit von CD23 mit EBV in Gegenwart von FK506, ein T-Zell-Immunsuppressivum. Traditionell ist Auswuchs der proliferierenden B-Zellen durch Visualisierung der mikroskopischen Cluster von Zellen etwa eine Woche nach der Infektion mit EBV überwacht. Klumpen von LCL kann mit bloßem Auge nach einigen Wochen zu sehen. Wir beschreiben einen Assay zu bestimmen, vorzeitig, wenn EBV-vermittelte gachstum Transformation erfolgreich ist, auch vor der mikroskopischen Cluster von Zellen nachgewiesen werden kann. Die Anwesenheit von CD23 hallo CD58 +-Zellen beobachtet, wie bereits drei Tage nach der Infektion zeigt ein erfolgreiches Ergebnis.

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Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

Wir beschreiben ein Verfahren zur Erzeugung von transformierten B-Zell-Linien mit Epstein-Barr-Virus. Wir zeigen auch eine neuartige Assays, dass B-Zellen bestimmt, Transformation bereits drei Tage nach der Infektion unterziehen identifizieren können.

Gründung des Epstein-Barr Virus Growth-transformierten lymphoblastoiden Zelllinien

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

establishment-epstein-barr-virus-growth-transformed-lymphoblastoid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

39.8K Aufrufe.  State University of New York at Stony Brook. Wir beschreiben ein Verfahren zur Erzeugung von transformierten B-Zell-Linien mit Epstein-Barr-Virus. Wir zeigen auch eine neuartige Assays, dass B-Zellen bestimmt, Transformation bereits drei Tage nach der Infektion unterziehen identifizieren können.

Serie: Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified mice, such as Atm-/- and p53-/- consistently develop thymic lymphoma early in life 1,2, and thus, can serve as a reliable source for derivation of murine T-cell lines. Here we present a detailed protocol for the development of established murine thymic lymphoma T-cell lines without the need to add interleukins as described in previous protocols 1,3. Tumors were harvested from mice aged three to six months, at the earliest indication of visible tumors based on the observation of hunched posture, labored breathing, poor grooming and wasting in a susceptible strain 1,4. We have successfully established several T-cell lines using this protocol and inbred strains ofAtm-/- [FVB/N-Atmtm1Led/J] 2 and p53-/- [129/S6-Trp53tm1Tyj/J] 5 mice. We further demonstrate that more than 90% of the established T-cell population expresses CD3, CD4 and CD8. Consistent with stably established cell lines, the T-cells generated by using the present protocol have been passaged for over a year.

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

In this video we demonstrate a protocol to establish mouse thymic lymphoma cell lines. By following this protocol, we have successfully established several T-cell lines from Atm-/- and p53-/- mice with thymic lymphoma.

Ableitung von Thymuslymphom T-Zell-Linien aus Atm - / -</sup Und P53 - / -</sup Mäuse

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

Ausbau zytotoxische T-Lymphozyten aus Nabelschnurblut, dass Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr-Virus und Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that express fluorescent fusion proteins have enabled real-time visualization of transport and spread of alphaherpes virus infection of neurons. The utility of novel fluorescent fusion proteins to viral membrane, tegument, and capsids, in conjunction with live cell imaging, identified viral particle assemblies undergoing transport within axons. Similar tools have been successfully employed for analyses of cell-cell spread of viral particles to quantify the number and diversity of virions transmitted between cells. Importantly, the techniques of live cell imaging of anterograde transport and spread produce a wealth of information including particle transport velocities, distributions of particles, and temporal analyses of protein localization. Alongside classical viral genetic techniques, these methodologies have provided critical insights into important mechanistic questions. In this article we describe in detail the imaging methods that were developed to answer basic questions of alphaherpes virus transport and spread.

Live cell imaging of alphaherpes virus infections enables analysis of the dynamic events of directed transport and intercellular spread. Here, we present methodologies that utilize recombinant viral strains expressing fluorescent fusion proteins to facilitate visualization of viral assemblies during infection of primary neurons.

Live Cell Imaging von Alphaherpes Virus Anterograde Transport und Aufstrich

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new method with a powerful and simple strategy for the establishment of B-LCLs, the red blood cell lysis method. This method simplified the PBMC separation procedure with red blood cell removal, and used as little as 0.5 mL of whole blood for establishing EBV-immortalized cell lines, which can proliferate to large cell numbers in a relatively short amount time with a 100% success rate. The method is simple, reliable, time saving, and applicable to treating a large number of the clinical samples.

A simple red blood cell lysis method for establishing B-LCLs was developed with high immortalization efficiency, requiring a small amount of blood and saving time from initiation to cryopreservation.

A Simple Red Blood Cell Lysis Verfahren zur Etablierung von B Lymphoblastoidzelllinien

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed feeder cells, purified NK or T cells with as much as 10 mL of blood, or a high-dose of IL-2. This study presents a new method with a powerful and simple strategy to establish NK and T cell lines by culturing the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with the addition of recombinant human IL-2 (rhIL-2), and uses as little as 2 mL of whole blood. The cells can proliferate quickly in two weeks and be maintained for more than 3 months. With this method, 7 NK or T cell lines have been established with a high success rate. This method is simple, reliable, and applicable to establishing cell lines from more cases of CAEBV or NK/T cell lymphoma.

A simple method for obtaining NK and T cell clones from CAEBV patients was developed with high efficiency, a small amount of peripheral blood, and a low-dose of IL-2.

Eine effiziente und einfache Methode, NK und T-Zell-Linien von Patienten mit chronischen aktiven Epstein - Barr-Virus-Infektion zu etablieren

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

Identifizierung der Codierung und nicht-kodierende RNA-Klassen ausgedrückt bei Schweinen Vollblut

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our knowledge of prevention and treatment of viral infection. The fruit fly Drosophila melanogaster has proven to be one of the most efficient and productive model organisms to screen for antiviral factors and investigate virus-host interaction, due to powerful genetic tools and highly conserved innate immune signaling pathways. The procedure described here demonstrates a nano-injection method to establish viral infection and induce systemic antiviral responses in adult flies. The precise control of the viral injection dose in this method enables high experimental reproducibility. Protocols described in this study include the preparation of flies and the virus, the injection method, survival rate analysis, the virus load measurement, and an antiviral pathway assessment. The influence effects of viral infection by the flies' background were mentioned here. This infection method is easy to perform and quantitatively repeatable; it can be applied to screen for host/viral factors involved in virus-host interaction and to dissect the crosstalk between innate immune signaling and other biological pathways in response to viral infection.

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

This protocol describes how to establish viral infection in vivo in Drosophila melanogaster using the nano-injection method and basic techniques to analyze virus-host interaction.

Gründung der Virusinfektion und Analyse von Host-Virus-Wechselwirkung in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

In Vitro ELISA-Test zur Bewertung der Wirksamkeit von Tollwut-Impfstoffen

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...