Diese Methode wird es uns ermöglichen, Epstein-Barr-Viruspartikel aus der P3HR1-Zelllinie zu isolieren und den Virusbestand zu quantifizieren, so dass er für verschiedene Forschungszwecke verwendet werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine relativ einfache, kostengünstige, schnelle und zuverlässige Methode zur Herstellung eines EB-Virusvorrats bietet. Die mit dieser Technik erzeugten Vitalpartikel können in vielen in vitro oder in vivo experimentellen Modellen für die Diagnose verwendet werden, EB.To beginnen, ein Volumen der Zellsuspension A in einem 15-Milliliter-Konikuschen herstellen, das Volumen so einstellen, dass die Anzahl der Zellen etwa 2,2 Millionen Zellen für eine 100-Millimeter-Kulturplatte beträgt.
Fünf Milliliter komplettes Kulturmedium in das Röhrchen geben. Fügen Sie 80 Mikroliter Dimethylsulfoxid in das Röhrchen hinzu. Dann 350 Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter PMA in die Tube geben.
Die Endkonzentration von PMA sollte 35 Nanogramm pro Milliliter betragen, und die von DMSO sollte 0,08% betragenFügen Sie 4,27 Milliliter Kulturmedium hinzu, so dass das Gesamtvolumen 10 Milliliter beträgt. Mischen Sie den Inhalt des Röhrchens durch Kippen und überführen Sie den Inhalt dann auf eine 100-Millimeter-Kulturplatte. Lassen Sie die Platte fünf Tage in einem Zellkulturinkubator bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid.
Nach fünf Tagen im Inkubator zentrifugieren Sie den Inhalt der Platte bei 120 G für acht Minuten, um die Zellen zu pelletieren Sammeln Sie den zellfreien Virus, der den Überstand enthält, und entsorgen Sie das Zellpellet. Erneut zentrifugieren Sie den Überstand bei 16.000 G für 90 Minuten bei vier Grad Celsius, um die Viruspartikel zu pelletieren. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Viruspellet in fünf Milliliter Kulturmedium, Aliquot die virale Suspension in 20 Röhrchen mit jeweils 250 Mikrolitern der Virussuspension und lagern Sie die Suspension bei minus 80 Grad Celsius.
Um die Proteine von der DNA zu trennen, fügen Sie 500 Mikroliter Tris-gesättigtes Phenol in eines der Röhrchen mit dem viralen Präparat hinzu. Fügen Sie 100 Mikroliter Wasser hinzu und wirbeln Sie gut, um eine rosa Emulsion zu erhalten. Zentrifugieren Sie für 15 Minuten bei 9, 650 G, sammeln Sie den Überstand und geben Sie ihn in ein neues 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen.
Fügen Sie ein Äquivalent von einem Zehntel des überstehenden Volumens von kaltem Natriumacetat hinzu und mischen Sie durch Pipettieren auf und ab. Dann fügen Sie einen Mikroliter von 20 Milligramm pro Milliliter Glykogen hinzu und mischen Sie durch Pipettieren. Fügen Sie das dreifache Volumen des Überstands an kaltem 100% Ethanol hinzu und lagern Sie es über Nacht bei minus 80 Grad Celsius.
Zur Isolierung der viralen DNA-Zentrifuge bei 9, 650 G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Verwerfen Sie den Überstand, um ein DNA-Pellet zu erhalten, und waschen Sie das Pellet dreimal mit einem Milliliter kaltem 70% Ethanol. Erneut bei 9, 650 G für 15 Minuten zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
Nach etwa 10 Minuten Lufttrocknung des Pellets wird das Pellet in 10 bis 50 Mikrolitern nukleasefreiem destilliertem Wasser resuspendiert. Lagern Sie die Proben bei minus 20 Grad Celsius für die spätere Verarbeitung oder bei vier Grad Celsius über Nacht, um eine maximale DNA-Auflösung zu gewährleisten, gefolgt von der Lagerung bei minus 20 Grad Celsius. Nach der Reinigung des Sockels eines Mikrospektralphotometers mit einem empfindlichen Aufgabenwischer laden Sie einen Mikroliter der vorbereiteten DNA-Probe und notieren Sie die Konzentration der DNA in der Probe.
Überprüfen Sie die Absorptionsverhältnisse sowohl bei 260 bis 280 Nanometern als auch bei 260 bis 230 Nanometern. DNA absorbiert bei 260 Nanometern, Proteine bei 280 Nanometern und organische Substanzen wie Phenol bei 230 Nanometern. Ein Verhältnis von 1,8 zu 2 wird für die realtime PCR als ausreichend angesehen.
Zur Herstellung der PCR-Reaktionsmischungen werden fünf Mikroliter einer cybergrünen realtime-PCR-Mischung in 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen gegeben. Fügen Sie jedem Rohr einen Mikroliter 7,5 Picomol pro Mikroliter Vorwärtsprimer und einen Mikroliter 7,5 Picomol pro Mikroliter Reverse-Primer hinzu. Hier wird das EBV-Klein-RNA-2-Gen amplifiziert.
Zur Bestimmung der EBV-Genomkopienzahl. Dann fügen Sie zwei Mikroliter nukleasefreies Wasser und einen Mikroliter virale DNA zu einer der Röhrchen hinzu. Das Gesamtvolumen des Reaktionsgemisches beträgt 10 Mikroliter.
Bereiten Sie andere Röhrchen vor, die als Standards mit bekannten EBV-Genomkopiennummern verwendet werden. Lassen Sie die PCR-Mischungen beginnend mit einem ersten Aktivierungsschritt bei 95 Grad Celsius fünf Minuten lang ausführen. Dann 40 Zyklen bei 95 Grad Celsius für 15 Sekunden und bei 58 Grad Celsius für 30 Sekunden.
Exportieren Sie alle Datenblätter als CSV-Dateien und berechnen Sie das Protokoll der Anzahl der EBV-Genomkopien pro Standardröhrchen und der mittleren CQ-Werte. Generieren Sie eine qPCR-Standardkurve, indem Sie die CT-Werte der Standards gegen das Log der Anzahl der Genomkopien aufzeichnen. Unter Verwendung der Standardkurvendiagrammgleichung wird die Anzahl der EBV-Genomkopien in der PCR-Röhre abgeleitet, die die induzierte virale DNA enthält.
Verwenden Sie schließlich die auf dem Bildschirm angezeigte Formel, um die Konzentration der induzierten viralen Zubereitung zu berechnen. Hier ist X die Anzahl der EBV-Genomkopien, die von der Standardkurve abgeleitet werden, und F ist der Verdünnungsfaktor, der verwendet wird, um die DNA pro PCR-Reaktion aufzubauen. Die Zellzählung mit einer Hämozytometerkammer ist hier dargestellt.
Vier Quadranten werden mit einem Lichtmikroskop gezählt. Hier sollten blau markierte Zellen gezählt werden, während rot markierte Zellen nicht gezählt werden sollten, da sie den oberen, rechten, unteren oder linken Rand des Quadranten berühren. Ein Optimierungsversuch wurde durchgeführt, um die Konzentrationen von PMA und Dimethylsulfoxid zu bestimmen, die die höchste Anzahl von EBV-Partikeln ergeben würden.
Eine DMSO-Konzentration von 0,8% und eine PMA-Konzentration von 35 Nanogramm pro Mikroliter waren optimal und führten zu hohen EBV-Konzentrationen. Unser Labor verwendete die mit dieser Technik erzeugten Vitalpartikel, um Pro-Autoimmun- oder Entzündungsreaktionen auf dieses Virus zu untersuchen. Sowie die Entwicklung neuartiger Anti-EBV-Wirkstoffe.
