Diese Arbeit wurde zum Teil durch NIH-RO3 EB007299-02 und NSF EPSCoR First Award unterstützt.

1. Gewebekonstrukt Vorbereitung Das Gewebe konstruieren Vorbereitung Prozess besteht aus drei Phasen: Ausbau der Zellpopulation, Auspflanzung von Zellen auf einem Biomaterial Schafott, und Differenzierung durch den Einsatz chemischer Signalmoleküle. Das Verfahren für die Vorbereitung Konstrukt basiert auf Methoden von Dennis et al., Hong et al., Und Marion und Mao 8,9,10 durchgeführt wurden. <ol><li> Nach der Kultivierung und Expansion der Zelllinie, Saatgut die humanen mesenchymalen Stammzellen (MSCs h) auf eine Gelatineschwamm (Durchmesser 4 mm, Dicke 3,5 mm) bei einer Dichte von 1x10 6 Zellen / ml für Knochen und 3x10 6 Zellen / ml für Fettgewebe Bildung. </li><li> Zur Differenzierung von MSCs in Fettgewebe h, wenden Sie die adipösen Induktion Medien, bestehend aus 1 uM Dexamethason, 0,5 uM Isobutyl-Methylxanthin, 10 mu g / ml humanes rekombinantes Insulin-und 200 uM Indomethacin in Zellexpansion Mediumeinmal konfluenten Zellen erscheinen auf dem Schafott. Nach drei Tagen, tauschen Sie den Datenträger mit 10 pg / ml humanem rekombinantem Insulin-Erweiterung in Medien für 24 Stunden dann auf eine Induktionstherapie Medien zurück. Wiederholen Sie den Zyklus dreimal und dann tauschen nur in Medien Wartung alle zwei Tage. </li><li> Um Osteogenese induzieren, herzustellen osteogener Induktion Medien, indem eine Endkonzentration von 0,1 pM Dexamethason, 50 uM von L-Ascorbinsäure-2phosphate und 10 mM β-Glycerophosphat in Zellexpansion Medium. Ersetzen Sie mit frischen osteogenen Medien alle zwei Tage. </li></ol> 2. Actuator Charakterisierung Charakterisierung des Antriebs ist ein wichtiger Schritt für die MRE-Experiment. MRE beruht auf der Ausbreitung von mechanischen Scherwellen um die lokalen Werte der mechanischen Eigenschaften zu bewerten, daher müssen diese mechanischen Schwingungen zu erzeugen und in das Gewebe von Interesse unter Verwendung eines piezoelektrischen Aktors charakterisiert werden. Eine illustrierte example der Charakterisierung wird in 3 gezeigt. Das Ziel dieses Verfahrens ist, um die Bewegung des Aktuators zu optimieren, um harmlose Scherwellen mit signifikanten Amplituden (~ 250 Mikron) zu erzeugen. <ol><li> Vor dem Experiment, gelten 0,5% Agarosegel, das Konstrukt in einem 10 mm-Teströhrchen zu umschließen. Die Temperatur des Gels sollte etwa 37 ° C, um eine Beschädigung des Konstrukts zu minimieren. </li><li> Nachdem sich die Agarosegel 5 Minuten bei Raumtemperatur eingestellt, legen Sie die Spitze des piezoelektrischen Biege-Motor in die Oberfläche des Gels. </li><li> Befestigen Sie das Röhrchen mit der Probe und den Antrieb auf eine feste Unterlage und richten den Strahl der Laser-Doppler-Vibrometer zur Spitze des mechanischen Antriebs. Stellen Sie die Positionierung des Systems, um das reflektierte Signal zu optimieren, verwenden Reflexfolie, falls erforderlich. </li><li> Auf Basis der erwarteten Resonanzfrequenz des mechanischen Aktuator, stellen Sie den Funktionsgenerator, um die d fegenesired Frequenzbereich (dh 20 bis 2000 Hz in diesem Experiment) mit einer Betriebsspannung von 20 Vpp mit einem weißen Rauschsignal. </li><li> Sehen Sie sich die gekennzeichnet Spektrum auf der Polytec Vibrosoft Programm, um die Resonanzfrequenz des Systems zu identifizieren und das Programm so einstellen FFT und Geschwindigkeit als die y-Achse. </li><li> Für die Wegmessung, stellen Sie den Antrieb, um eine kontinuierliche Sinuskurve bei der angegebenen Resonanzfrequenz mit einer Betriebsspannung von 200 Vpp liefern, und notieren Sie die erzeugte Verschiebung auf die Oberfläche des Gels geliefert. Set Vibrosoft die FFT mit einer Verschiebung auf der y-Achse dargestellt. </li></ol> 3. Image Acquisition <ol><li> Nach Abschluss Antrieb Charakterisierung, legen Sie die Probe und Antrieb in der Mitte des MRI-Scanner. Für Gewebekonstrukt Versuche mit einem kleinen und empfindlichen RF-Spule (dh 10 mm in diesem Experiment) für die Übertragung und den Empfang des HF-Signals. (Das Verfahren gezeigt, verwendet einen 9,4 Tvertikale Bohrung Magnet mit dreifacher Achse Steigungen, 100 g / cm) ausgestattet. </li><li> Eignen Sie sich ein Scout die Grafik für eine Identifizierung des Konstrukts Lage. </li><li> Stellen Sie die Parameter für den Erwerb. Eine typische In-vitro-Sagittalschnitt wird eine Wiederholung der Zeit von 1000 ms, Echozeit von 20-40 ms, Schichtdicke von 0,5-1,0 mm, und Sichtfeld von 12x10 mm 2 mit einer Matrix von 128x128 Pixel Größe. </li><li> Für die Elastographie Parameter, stellen Sie den Antrieb Frequenz auf den Wert von der Laser-Doppler-Vibrometer Charakterisierung festgelegt. In der aktuellen Studie wurde ein bipolares Paar mit einem Gradienten Amplitude von 50 g / cm erforderlich. Weitere Parameter zur Einstellung gehören die Verzögerung, die auf Null Millisekunden für die erstmalige Übernahme gesetzt werden soll. </li><li> Ändern Sie den Funktionsgenerator zu platzen Modus und stellen Sie die Parameter der Funktion Generator zu den in den Elastographie Aufnahme-Parameter einschließlich der Häufigkeit und Anzahl der Zyklen entsprechen. Auch, stellen Sie die Funktiontion Generator extern getriggert werden. </li><li> Für eine sagittale Bild, stellen Sie den Antrag auf eine Sensibilisierung in der positiven Richtung Scheibe sein und starten den Scan. Nach Erwerb, überprüfen Sie das Bild und ändern Sie die Sensibilisierung auf die negative Richtung Scheibe. </li><li> Führen Sie den MATLAB-Programm, das die komplexe Division zur Erzeugung der Scherwellen-Bild führt. </li><li> Beurteilen Sie das Bild auf das Vorhandensein von Scherwellen und mögliche Artefakte wie Phase Verpackung. </li><li> Wenn keine Einstellungen am Bild erforderlich sind, stellen Sie Parameter Array-Größe zu acht äquidistanten Werten im Bereich von null Sekunden, um eine volle Periode der Resonanzfrequenz gekennzeichnet. </li><li> Erwerben Sie einen Scan sowohl in den positiven und negativen Schichtorientierungen. </li><li> Sobald die Bilder erworben werden, verwenden Sie ein MATLAB-Programm zur Erzeugung der Scherwellen-Daten aus einem Array von Bildern konzipiert. </li></ol> 4. MRE Experiment Bildverarbeitung <ol><li> The letzte Schritt der MRE ist es, die Schubsteifigkeit aus den Scherwellen Bilder zu berechnen. Die Platzierung der Daten in den MATLAB-Programm, das den dreidimensionalen Datensatz (2 räumliche, zeitliche 1) bewertet wird. </li></ol> Hinweis: Mit der Übernahme einer ebenen Transversalwelle, die Bewegungsgleichungen entkoppeln so dass die Schätzung der komplexwertigen Schubmodul in Abhängigkeit von der Verschiebung und der Laplace. Der Algorithmus nähert räumliche zweite Ableitung mit endlichen Differenz und berechnet den Schubmodul auf einer Pixel-für-Pixel-Basis. Von dieser komplexen Zahl, viele mechanische Parameter wie Geschwindigkeit der Scherwelle, Wellendämpfung, Schubsteifigkeit, Scherelastizität, Scherviskosität usw. abgeleitet werden Der Algorithmus erlaubt die Auswahl von interessierenden Bereichen für welche der Mittelwert und die Standardabweichung der Jeder Parameter wird berechnet. <ol start="2"><li> Die Bildgebungsparameter müssen zu Beginn des Programms festgelegt werden. Zusätzlich the obere Grenze des Elastogramm eingestellt, um den Kontrast in der Probe zu optimieren. </li></ol> Hinweis: Das Programm bietet Zwischenergebnisse (Welle nach Tiefpassfilter, Welle nach direktionale Filterung, zeitlicher FFT-, Linien-Profile, etc.), die dem Benutzer schätzen die Treue der Genesung helfen. <ol start="3"><li> Einige Parameter können basierend auf diesen Informationen, z. B. die Werte von Tiefpass-Filter, die zeitliche Frequenz der Bewegung, die Ausbreitungsrichtung der Welle, etc. Die Standardabweichung eines Parameters in einer bestimmten Region von Interesse ist, eingestellt werden auch ein Indikator für die Qualität der Berechnung. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 4 stellt fest, die Veränderung der mechanischen Eigenschaften im gesamten vier Wochen der osteogenen und adipogene Konstrukt Entwicklung. MRE wurde bei 730-820 Hz durchgeführt. Während beide seeded Schwämme begann um etwa 3 kPa, osteogenic directed Geweben führte zu einer Steifigkeit von 22 kPa; der Erwägung, dass adipöse Gewebe gerichtet in der Steifigkeit um 1 kPa gesunken. Außerdem zeigten die osteogene Konstrukte eine bemerkenswerte Abnahme der Größe im Vergleich vom Anfang bis zum Ende der Studie. Weitere Objekte Elastographie Studie abgeleitet sind in Tabelle 1 gezeigt. <img src="/files/ftp_upload/3618/3618fig1.jpg" alt="1"/> Abbildung 1. Die Bildaufnahme-Prozess für die Magnetresonanz-Elastographie. Während der Akquisition, steuert eine Impulsfolge (a) die Synchronisation (b) des Funktionsgenerators mit der bipolaren Gradienten Impulse des MRI-Scanner. Nach Erwerb der bipolaren Gradienten in positive und negative Orientierungen umgeschaltet, (c) eine Scherwelle Bild erzeugt mit Hilfe komplexer Division. <img src="/files/ftp_upload/3618/3618fig2.jpg" alt="2"/> Abbildung 2. Flussdiagramm des MRE-Verfahren für das Tissue-EngineEred Konstrukte. Zuerst werden Zellen (a) eine erste gewachsen und die Populationsgröße wesentlich für die gestaltete Projekt. Anschließend werden die Zellen ausgesät (b) auf eine von Biomaterialien und chemische Reagenzien angewendet werden, um die Differenzierung zu signalisieren. Gerüste mit MRE, dessen erste Stufe (c) ist die Bestimmung der Resonanzfrequenz des Aktuators gekoppelt ist, um das Konstrukt ist. Weiter, MRI-Bilder (d) erfasst, um ein Scherwelle Bild (e) zu erzeugen. Schließlich wird ein Algorithmus angewendet, um ein Elastogramm zu ergeben (f) bildet die Steifigkeit des Konstrukts. Gleichzeitig sind Konstrukte für die histologische Beurteilung (g) geschnitten, um die Differenzierung zu validieren. <img src="/files/ftp_upload/3618/3618fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Antrieb Charakterisierung Prozedur. Die Gelatine Gerüst durch ein 0,5% Agarose Gel eingeschlossen. Um die Bewegung in die Probe überführt charakterisieren ein weißes Rauschen wird zuerst in das System gesendet(1a) und die daraus resultierende Bewegung erkannt wird mit Hilfe eines Laser-Doppler-Vibrometer (1b). Wenn die Resonanzfrequenz bestimmt wird, eine kontinuierliche Sinussignal bei Resonanz (2a) an der Verlagerung (2b) übertragen, um die Gelatine Umgebung zu bestimmen. <img src="/files/ftp_upload/3618/3618fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4. Konstruieren Entwicklung Karte über vier Wochen. Adipogenen (A) und des osteogenen (O)-Konstrukte werden von links nach rechts mit entsprechenden Größe und Scherwelle Bilder, Elastogramm, und die durchschnittliche Schubsteifigkeit gezeigt. Die Farbtabelle für die Elastogramm entspricht dem Farbschema des Balkendiagramms und Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung innerhalb jedes Konstrukt der Region von Interesse. <img src="/files/ftp_upload/3618/3618Table1.jpg" alt="Tabelle 1"/&gt; Tabelle 1. Mechanische Eigenschaften von Fett-und Osteo-Konstrukte über einen Zeitraum von vier Wochen des Wachstums.

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	<li>Xu, H., Othman, S. F., Magin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+tissue+engineering+using+magnetic+resonance+imaging.">Monitoring tissue engineering using magnetic resonance imaging.</a> J. Biosci. Bioeng. 106, 515-527 (2008).</li><li>Xu, H., Othman, S. F., Hong, L., Peptan, I. A., Magin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+microscopy+for+monitoring+osteogenesis+in+tissue-engineered+construct+in+vitro.">Magnetic resonance microscopy for monitoring osteogenesis in tissue-engineered construct in vitro.</a> Phys. Med. Biol. 51, 719-732 (2006).</li><li>Othman, S. F., Xu, H., Royston, T. J., Magin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+magnetic+resonance+elastography+(microMRE.">Microscopic magnetic resonance elastography (microMRE.</a> Magn. Reson. Med. 54, 605-615 (2005).</li><li>Muthupillai, R., Lomas, D. J., Rossman, P. J., Greenleaf, J. F., Manduca, A., Ehman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+elastography+by+direct+visualization+of+propagating+acoustic+strain+waves.">Magnetic resonance elastography by direct visualization of propagating acoustic strain waves.</a> Science. 269, 1854-1857 (1995).</li><li>Othman, S. F., Curtis, E. T., Plautz, S. A., Pannier, A. P., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+elastography+monitoring+of+tissue+engineered+constructs.">Magnetic resonance elastography monitoring of tissue engineered constructs.</a> NMR Biomed. , (2011).</li><li>Oliphant, T. E., Manduca, A., Ehman, R. L., Greenleaf, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex-valued+stiffness+reconstruction+for+magnetic+resonance+elastography+by+algebraic+inversion+of+the+differential+equation.">Complex-valued stiffness reconstruction for magnetic resonance elastography by algebraic inversion of the differential equation.</a> Magn. Reson. Med. 45, 299-310 (2001).</li><li>Ringleb, S. I., Chen, Q., Lake, D. S., Manduca, A., Ehman, R. L., An, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+shear+wave:+comparison+to+a+dynamic+shear+material+test.">Quantitative shear wave: comparison to a dynamic shear material test.</a> Magn. Reson. Med. 53, 1197-1201 (2005).</li><li>Hong, L., Peptan, I., Clark, P., Mao, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+adipose+tissue+engineering+by+human+marrow+stromal+cell+seeded+gelatin+sponge.">Ex vivo adipose tissue engineering by human marrow stromal cell seeded gelatin sponge.</a> Ann. Biomed. Eng. 33, 511-517 (2005).</li><li>Dennis, J. E., Haynesworth, S. E., Young, R. G., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenesis+in+marrow-derived+mesenchymal+cell+porous+ceramic+composites+transplanted+subcutaneously:+effect+of+fibronectin+and+laminin+on+cell+retention+and+rate+of+osteogenic+expression.">Osteogenesis in marrow-derived mesenchymal cell porous ceramic composites transplanted subcutaneously: effect of fibronectin and laminin on cell retention and rate of osteogenic expression.</a> Cell Transplant. 1, 23-32 (1992).</li><li>Marion, N. W., Mao, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+and+tissue+engineering.">Mesenchymal stem cells and tissue engineering.</a> Methods Enzymol. 420, 339-361 (2006).</li><li>Rydberg, J., Grimm, R., Kruse, S., Felmlee, J., McCracken, P., Ehman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+spin-echo+magnetic+resonance+elastography+of+the+brain.">Fast spin-echo magnetic resonance elastography of the brain.</a> , 1647-1647 (2001).</li><li>Kruse, S. A., Grim, R. C., Lake, D. S., Manduca, A., Ehman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+EPI+based+3D+MR+elastography+of+the+brain.">Fast EPI based 3D MR elastography of the brain.</a> , 3385-3385 (2006).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.

In diesem Verfahren wird das Verfahren der MRE für Tissue Engineering Konstrukte Zellpräparat zur Erzeugung von Elastogramm gezeigt. Durch Anlegen einer mechanischen zerstörungsfreien Prüfung Verfahren zum Tissue Engineering-Pipeline, ist es nun möglich, Änderungen in Engineered Constructs über mehrere Phasen der Entwicklung zu bewerten. Darüber hinaus ergänzt die MRE andere MR-Methoden für die Überwachung mittels Tissue Engineering Konstrukte wie Diffusion, Magnetisierungstransfer und chemische Verschiebung ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Material Name </td><td> Typ </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> MSCGM-Bullet Kit </td><td> Reagens </td><td> Lonza </td><td> PT-3001 </td><td> Lagerung bei 4 ° C </td></tr><tr><td> 1X DPBS </td><td> Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> 21600-010 </td><td></td></tr><tr><td> 0,05% Trypsin-EDTA </td><td> Reagens </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td> Lagerung bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Dexamethason </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D2915 </td><td></td></tr><tr><td> 3-Isobutyl-1-methylxanthin </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I5879 </td><td> Lagerung bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Insulin-Rinderpankreas </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6634 </td><td> Lagerung bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Indomethacin </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I7378 </td><td></td></tr><tr><td> Β-Glycerophosphat </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G9891 </td><td></td></tr><tr><td> L-Ascorbinsäure-2-Phosphat </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8960 </td><td></td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td> Gerüst </td><td> Pharmacia &amp; Upjohn Co. </td><td> 09-0315-08 </td><td></td></tr><tr><td> Humanen mesenchymalen Stammzellen </td><td> Cell Line </td><td> Lonza </td><td> PT-2501 </td><td></td></tr><tr><td> 9,4 T MR-Scanner </td><td> Ausrüstung </td><td> Agilent </td><td></td><td> 400MHz WB </td></tr><tr><td> 10mm Litz Coil </td><td> Ausrüstung </td><td> Doty Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Laser-Doppler-Vibrometer </td><td> Ausrüstung </td><td> Polytec </td><td> PDV-100 </td><td></td></tr><tr><td> Vibrosoft (20) </td><td> Software </td><td> Polytec </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Funktionsgenerator </td><td> Ausrüstung </td><td> Agilent </td><td> AFG 3022B </td><td></td></tr><tr><td> Verstärker </td><td> Ausrüstung </td><td> Piezo-inc </td><td> EPA-104 bis 115 </td><td></td></tr><tr><td> Piezo-Bending-Motor </td><td> Ausrüstung </td><td> Piezo-Inc. </td><td> T234-A4Cl-203x </td><td></td></tr><tr><td> Computer-Linux </td><td> Ausrüstung </td><td> Prozessor: Intel Core 2 Duo E8400 Speicher: 2G </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Computer-Windows- </td><td> Ausrüstung </td><td> Prozessor: Intel Core 2 Duo E8400 Speicher: 2G </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MATLAB </td><td> Software </td><td> Mathworks, Inc. </td><td></td><td> 2009b </td></tr></tbody></table>

magnetic resonance elastography methodology for the evaluation of tissue engineered construct growth

Traditionelle mechanische Tests führt häufig zur Beseitigung der Probe, und im Fall der langfristigen Tissue Engineering gewonnenen Konstrukts Studien, ist die Verwendung von zerstörungsfreie Bestimmung nicht akzeptabel. Eine vorgeschlagene Alternative ist die Verwendung von einem bildgebenden Verfahren Magnetresonanz-Elastographie genannt. Elastographie ist ein zerstörungsfreies Verfahren zur Bestimmung der technisch Ergebnis durch Messen lokalen Werte der mechanischen Eigenschaften (dh komplexe Schermodul) als wesentliche Marker zur Identifizierung der Struktur und Funktion eines Gewebes sind. Als nichtinvasives Mittel zur Auswertung, wurde die Überwachung von technischen Konstrukte mit bildgebenden Verfahren wie Magnetresonanztomographie (MRT) zunehmend Interesse in der letzten Dekade 1 zu sehen. Zum Beispiel wurden die magnetischen Resonanz (MR) der Diffusion und Relaxometrie der Lage, die Veränderungen in der chemischen und physikalischen Eigenschaften während gezüchteten Gewebe Entwicklung 2 charakterisieren. Verfahren vorgeschlagendas folgende Protokoll verwendet mikroskopischen Magnetresonanz Elastographie (μMRE) als nichtinvasive MR Technik zur Messung der mechanischen Eigenschaften von kleinen weichen Gewebe 3. MRE wird durch Kopplung eines akustischen mechanischen Antrieb mit dem Gewebe von Interesse und Aufzeichnen der Scherwelle Fortpflanzung mit einem MR-Scanner 4 erreicht. Vor kurzem hat μMRE im Tissue Engineering angewendet worden, um wesentliche Informationen, die traditionell Wachstum gemessen wird mit zerstörerischen mechanischen makroskopischen Techniken 5 zu erwerben. In der folgenden Prozedur wird Elastographie durch den Abbildungsbereich von technischen Konstrukte mit einer modifizierten Hahn-Spin-Echo-Sequenz mit einem mechanischen Aktuator gekoppelt erreicht. Wie in 1 gezeigt ist, synchronisiert die modifizierte Sequenz Bildaufnahme mit der Übertragung von externen Scherwellen, anschließend wird die Bewegung sensibilisiert durch die Verwendung von bipolaren schwingenden Paaren. Nach Sammlung von Bildern mit positiven und negativen Bewegung sensitization, komplexe Aufteilung der Daten erzeugen eine Scherwelle Bild. Dann wird das Bild bewertet unter Verwendung eines Inversionsalgorithmus, um eine Schubsteifigkeit Karte 6 zu erzeugen. Die resultierenden Messungen in jedem Voxel haben gezeigt, dass stark korrelieren (R 2&gt; 0,9914) mit Daten unter Verwendung von dynamisch-mechanischen Analyse 7. In dieser Studie wird die Elastographie in das Gewebe ein Entwicklungsprozess für die Überwachung von humanen mesenchymalen Stammzellen (MSC h) Differenzierung in osteogene adipogene und Konstrukte wie in Abbildung 2 dargestellt integriert.

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Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Das Verfahren zeigt die Methodik der Magnet-Resonanz-Elastographie zur Überwachung der gentechnisch Ergebnis der Fett-und osteogene Gewebezüchtungen Konstruktionen, die durch nicht-invasive lokale Beurteilung der mechanischen Eigenschaften mit mikroskopischen Magnetresonanz-Elastographie (μMRE).

Magnet-Resonanz-Elastographie Methodik für die Beurteilung von Tissue Engineering gewonnenen Konstrukts Wachstum

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

magnetic-resonance-elastography-methodology-for-evaluation-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.4K Aufrufe.  University of Nebraska-Lincoln. Das Verfahren zeigt die Methodik der Magnet-Resonanz-Elastographie zur Überwachung der gentechnisch Ergebnis der Fett-und osteogene Gewebezüchtungen Konstruktionen, die durch nicht-invasive lokale Beurteilung der mechanischen Eigenschaften mit mikroskopischen Magnetresonanz-Elastographie (μMRE).

Serie: Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of tri-leaflet polymer valve prostheses. However, identification of a protocol for initial assessment of polymer valve hydrodynamic functionality is paramount during the early stages of the design process. Traditional in vitro pulse duplicator systems are not configured to accommodate flexible tri-leaflet materials; in addition, assessment of polymer valve functionality needs to be made in a relative context to native and prosthetic heart valves under identical test conditions so that variability in measurements from different instruments can be avoided. Accordingly, we conducted hydrodynamic assessment of i) native (n = 4, mean diameter, D = 20 mm), ii) bi-leaflet mechanical (n= 2, D = 23 mm) and iii) polymer valves (n = 5, D = 22 mm) via the use of a commercially available pulse duplicator system (ViVitro Labs Inc, Victoria, BC) that was modified to accommodate tri-leaflet valve geometries. Tri-leaflet silicone valves developed at the University of Florida comprised the polymer valve group. A mixture in the ratio of 35:65 glycerin to water was used to mimic blood physical properties. Instantaneous flow rate was measured at the interface of the left ventricle and aortic units while pressure was recorded at the ventricular and aortic positions. Bi-leaflet and native valve data from the literature was used to validate flow and pressure readings. The following hydrodynamic metrics were reported: forward flow pressure drop, aortic root mean square forward flow rate, aortic closing, leakage&#160;and regurgitant volume, transaortic closing, leakage, and total energy losses. Representative results indicated that hydrodynamic metrics from the three valve groups could be successfully obtained by incorporating a custom-built assembly into a commercially available pulse duplicator system and subsequently, objectively compared to provide insights on functional aspects of polymer valve design.

There has been renewed interest in developing polymer valves. Here, the objectives are to demonstrate the feasibility of modifying a commercial pulse duplicator to accommodate tri-leaflet geometries and to define a protocol to present polymer valve hydrodynamic data in comparison to native and prosthetic valve data collected under near-identical conditions.

Protokoll für Relative Hydrodynamische Beurteilung der Tri-Polymer Merkblatt Ventile

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Forschung

Biotechnik

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large animal model. A step by-step protocol for inter-positional placement of the TEV and real-time digital assessment of the TEV and native carotid arteries is described here. In vivo monitoring is made possible by the implantation of flow probes, catheters and ultrasonic crystals (capable of recording dynamic diameter changes of implanted TEVs and native carotid arteries) at the time of surgery. Once implanted, researchers can calculate arterial blood flow patterns, invasive blood pressure and artery diameter yielding parameters such as pulse wave velocity, augmentation index, pulse pressures and compliance. Data acquisition is accomplished using a single computer program for analysis throughout the duration of the experiment. Such invaluable data provides insight into TEV matrix remodeling, its resemblance to native/sham controls and overall TEV performance in vivo.

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

A step-by-step protocol for the inter-positional placement of Tissue Engineered Vessels (TEVs) into the carotid artery of a sheep using end-to-end anastomosis and real-time digital assessment in vivo until animal sacrifice.

Operationstechnik zur Implantation von Tissue Engineered Gefäßprothesen und Folge<em&gt; In-vivo-</em&gt; Überwachung

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Athymic Rat Model for Evaluation of Engineered Anterior Cruciate Ligament Grafts

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without intervention. Current treatment strategies include ligament reconstruction with either autograft or allograft, which each have their associated limitations. Thus, there is interest in designing a tissue-engineered graft for use in ACL reconstruction. We describe the fabrication of an electrospun polymer graft for use in ACL tissue engineering. This polycaprolactone graft is biocompatible, biodegradable, porous, and is comprised of aligned fibers. Because an animal model is necessary to evaluate such a graft, this paper describes an intra-articular athymic rat model of ACL reconstruction that can be used to evaluate engineered grafts, including those seeded with xenogeneic cells. Representative histology and biomechanical testing results at 16 weeks postoperatively are presented, with grafts tested immediately post-implantation and contralateral native ACLs serving as controls. The present study provides a reproducible animal model with which to evaluate tissue engineered ACL grafts, and demonstrates the potential of a regenerative medicine approach to treatment of ACL rupture.

Animal models are important tools for the evaluation of tissue-engineered grafts. This paper presents the protocol for preparing an electrospun biodegradable polymer graft for use in anterior cruciate ligament tissue engineering, as well as a surgical protocol for implantation in a rat model.

Athymischen Rattenmodell für die Bewertung von Engineered vorderen Kreuzbandes Grafts

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone fusion. Large doses of highly potent biological agents are required due to growth factor instability as a result of rapid enzymatic degradation as well as carrier inefficiencies in localizing sufficient amounts of growth factor at implant sites. Hence, strategies that prolong the stability of growth factors such as BMP-2/NELL-1, and control their release could actually lower their efficacious dose and thus reduce the need for larger doses during future bone regeneration surgeries. This in turn will reduce side effects and growth factor costs. Self-assembled PECs have been fabricated to provide better control of BMP-2/NELL-1 delivery via heparin binding and further potentiate growth factor bioactivity by enhancing in vivo stability. Here we illustrate the simplicity of PEC fabrication which aids in the delivery of a variety of growth factors during reconstructive bone surgeries.

Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.

Polyelektrolytkomplex für Heparin-Bindungsdomäne Osteogenisches Growth Factor Lieferung

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these procedures in basic research and preclinical drug development, it is important to develop protocols for automated generation and analysis under standardized conditions. Here, we present a technique to generate engineered heart tissue (EHT) from cardiomyocytes of different species (rat, mouse, human). The technique relies on the assembly of a fibrin-gel containing dissociated cardiomyocytes between elastic polydimethylsiloxane (PDMS) posts in a 24-well format. Three-dimensional, force-generating EHTs constitute within two weeks after casting. This procedure allows for the generation of several hundred EHTs per week and is technically limited only by the availability of cardiomyocytes (0.4-1.0 x 106/EHT). Evaluation of auxotonic muscle contractions is performed in a modified incubation chamber with a mechanical interlock for 24-well plates and a camera placed on top of this chamber. A software controls a camera moved on an XYZ axis system to each EHT. EHT contractions are detected by an automated figure recognition algorithm, and force is calculated based on shortening of the EHT and the elastic propensity and geometry of the PDMS posts. This procedure allows for automated analysis of high numbers of EHT under standardized and sterile conditions. The reliable detection of drug effects on cardiomyocyte contraction is crucial for cardiac drug development and safety pharmacology. We demonstrate, with the example of the hERG channel inhibitor E-4031, that the human EHT system replicates drug responses on contraction kinetics of the human heart, indicating it to be a promising tool for cardiac drug safety screening.

Here, we show the generation of human engineered heart tissue from induced pluripotent stem cells (hiPSC)-derived cardiomyocytes. We present a method to analyze contraction force and exemplary alteration of contraction pattern by the hERG channel inhibitor E-4031. This method shows high level of robustness and suitability for cardiac drug screening.

Automatische Kontraktions Analyse menschlicher Engineered Herzgewebe für Herz Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic resonance (MR) microscopy data. While it is possible to perform MR collections on living, excised mammalian tissue, such experiments have traditionally been constrained by resolution limits and are thus incapable of visualizing tissue microstructure. Conversely, MR protocols that did achieve microscopic image resolution required the use of fixed samples to accommodate the need for static, unchanging conditions over lengthy scan times. The current protocol describes the first available MR technique that enables imaging of living, mammalian tissue samples at microscopic resolutions. Such data is of great importance to the understanding of how pathology-based contrast changes occurring at the microscopic level influence the content of macroscopic MR scans such as those used in the clinic. Once such an understanding is realized, diagnostic methods with greater sensitivity and accuracy can be developed, which will translate directly to earlier disease treatment, more accurate therapy monitoring and improved patient outcomes.
While the described methodology focuses on brain slice preparations, the protocol is adaptable to any excised tissue slice given that changes are made to the gas and perfusate preparations to accommodate the tissue&#39;s specific metabolic needs. Successful execution of the protocol should result in living, acute slice preparations that exhibit MR diffusion signal stability for periods up to 15.5 h. The primary advantages of the current system over other MR compatible perfusion apparatuses are its compatibility with the MR microscopy hardware required to attain higher resolution images and ability to provide constant, uninterrupted flow with carefully regulated perfusate conditions. Reduced sample throughput is a consideration with this design as only one tissue slice may be imaged at a time.

The current protocol describes a method by which users can maintain viability of acute hippocampal and cortical slice preparations during the collection of magnetic resonance microscopy data.

Metabolische Unterstützung der herausgeschnitten, lebendes Gehirn Gewebe während der Magnet-Resonanz-Mikroskopie-Akquisition

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic ...

Custom Engineered Tissue Culture Molds from Laser-etched Masters

As the field of tissue engineering has continued to mature, there has been increased interest in a wide range of tissue parameters, including tissue shape. Manipulating tissue shape on the micrometer to centimeter scale can direct cell alignment, alter effective mechanical properties, and address limitations related to nutrient diffusion. In addition, the vessel in which a tissue is prepared can impart mechanical constraints on the tissue, resulting in stress fields that can further influence both the cell and matrix structure. Shaped tissues with highly reproducible dimensions also have utility for in vitro assays in which sample dimensions are critical, such as whole tissue mechanical analysis.
This manuscript describes an alternative fabrication method utilizing negative master molds prepared from laser etched acrylic: these molds perform well with polydimethylsiloxane (PDMS), permit designs with dimensions on the centimeter scale and feature sizes smaller than 25 &#181;m, and can be rapidly designed and fabricated at a low cost and with minimal expertise. The minimal time and cost requirements allow for laser etched molds to be rapidly iterated upon until an optimal design is determined, and to be easily adapted to suit any assay of interest, including those beyond the field of tissue engineering.

Herein we present a rapid, facile, and low-cost method for fabricating custom polydimethylsiloxane molds that can be used for producing hydrogel-based engineered tissues with complex geometries. We additionally describe results from mechanical and histological assessments conducted on engineered cardiac tissues produced using this technique.

Custom-Engineered Tissue Culture Formen von gelasert meistern

As the field of tissue engineering has continued to mature, there has been increased interest in a wide range of tissue parameters, including tissue ...

Manufacturing Abdominal Aorta Hydrogel Tissue-Mimicking Phantoms for Ultrasound Elastography Validation

Ultrasound (US) elastography, or elasticity imaging, is an adjunct imaging technique that utilizes sequential US images of soft tissues to measure the tissue motion and infer or quantify the underlying biomechanical characteristics. For abdominal aortic aneurysms (AAA), biomechanical properties such as changes in the tissue's elastic modulus and estimates of the tissue stress may be essential for assessing the need for the surgical intervention. Abdominal aortic aneurysms US elastography could be a useful tool to monitor AAA progression and identify changes in biomechanical properties characteristic of high-risk patients.
A preliminary goal in the development of an AAA US elastography technique is the validation of the method using a physically relevant model with known material properties. Here we present a process for the production of AAA tissue-mimicking phantoms with physically relevant geometries and spatially modulated material properties. These tissue phantoms aim to mimic the US properties, material modulus, and geometry of the abdominal aortic aneurysms. Tissue phantoms are made using a polyvinyl alcohol cryogel (PVA-c) and molded using 3D printed parts created using computer aided design (CAD) software. The modulus of the phantoms is controlled by altering the concentration of PVA-c and by changing the number of freeze-thaw cycles used to polymerize the cryogel. The AAA phantoms are connected to a hemodynamic pump, designed to deform the phantoms with the physiologic cyclic pressure and flows. Ultra sound image sequences of the deforming phantoms allowed for the spatial calculation of the pressure normalized strain and the identification of mechanical properties of the vessel wall. Representative results of the pressure normalized strain are presented.

Here we describe a method to manufacture aneurysmal, aortic tissue-mimicking phantoms for the use in testing ultrasound elastography. The combined use of computer-aided design (CAD) and 3-dimensional (3D) printing techniques produce aortic phantoms with predictable, complex geometries to validate the elastographic imaging algorithms with controlled experiments.

Herstellung von Bauchschlagader Hydrogel Gewebe-Nachahmung Phantome für Ultraschall-Elastographie-Validierung

Ultrasound (US) elastography, or elasticity imaging, is an adjunct imaging technique that utilizes sequential US images of soft tissues to measure the ...

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional tissue. Tissue engineering holds great promise as a potential solution with its ability to integrate cells and signaling molecules into a 3-dimensional scaffold. Recent work with tissue engineered tracheal grafts (TETGs) has seen some success but their translation has been limited by graft stenosis, graft collapse, and delayed epithelialization. In order to investigate the mechanisms driving these issues, we have developed a mouse model for tissue engineered tracheal graft implantation. TETGs were constructed using electrospun polymers polyethylene terephthalate (PET) and polyurethane (PU) in a mixture of PET and PU (20:80 percent weight). Scaffolds were then seeded using bone marrow mononuclear cells isolated from 6-8 week-old C57BL/6 mice by gradient centrifugation. Ten million cells per graft were seeded onto the lumen of the scaffold and allowed to incubate overnight before implantation between the third and seventh tracheal rings. These grafts were able to recapitulate the findings of stenosis and delayed epithelialization as demonstrated by histological analysis and lack of Keratin 5 and Keratin 14 basal epithelial cells on immunofluorescence. This model will serve as a tool for investigating cellular and molecular mechanisms involved in host remodeling.

Graft stenosis poses a critical obstacle in tissue engineered airway replacement. To investigate cellular mechanisms underlying stenosis, we utilize a murine model of tissue engineered tracheal replacement with seeded bone marrow mononuclear cells (BM-MNC). Here, we detail our protocol, including scaffold manufacturing, BM-MNC isolation, graft seeding, and implantation.

Aussaat und Implantation von einem biosynthetischen Tissue-Engineering trachealen Transplantat in einem Mausmodell

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant technique with nutritional support. Recently, there have been many attempts at esophageal tissue engineering, but the success rate has been limited due to difficulty in early epithelization in the special environment of peristalsis. Here, we developed an artificial esophagus that can improve the regeneration of the esophageal mucosa and muscle layers through a two-layered tubular scaffold, a mesenchymal stem cell-based bioreactor system, and a bypass feeding technique with modified gastrostomy. The scaffold is made of polyurethane (PU) nanofibers in a cylindrical shape with a three-dimensional (3D) printed polycaprolactone strand wrapped around the outer wall. Prior to transplantation, human-derived mesenchymal stem cells were seeded into the lumen of the scaffold, and bioreactor cultivation was performed to enhance cellular reactivity. We improved the graft survival rate by applying surgical anastomosis and covering the implanted prosthesis with a thyroid gland flap, followed by temporary nonoral gastrostomy feeding. These grafts were able to recapitulate the findings of initial epithelialization and muscle regeneration around the implanted sites, as demonstrated by histological analysis. In addition, increased elastin fibers and neovascularization were observed in the periphery of the graft. Therefore, this model presents a potential new technique for circumferential esophageal reconstruction.

Esophageal reconstruction is a challenging procedure, and development of a tissue-engineered esophagus that enables regeneration of esophageal mucosa and muscle and that can be implanted as an artificial graft is necessary. Here, we present our protocol to generate an artificial esophagus, including scaffold manufacturing, bioreactor cultivation, and various surgical techniques.

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...