Wir danken für die Open-Source-Nutzung von MATLAB Partikel-Tracking-Code von Maria Kilfoil vorgesehen ( <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil/</a> ), zusammen mit dem früheren IDL-Code und eine umfangreiche Dokumentation von John C. Crocker und Eric bereitgestellt R. Weeks. Diese Arbeit durch Mittel aus dem National Cancer Institute (NCI / NIH), K99CA155045 und R00CA155045 (: JPC PI) ermöglicht.

1. Kultivierung Tumorsphäroide <ol><li> Mischungs 10 ml Zellkultur-Wasser mit 0,1 g Agarose, um ein 1% Agarose-Lösung erhalten. </li><li> Wärme Agarose-Lösung auf über 70 ° C (etwa 14 sec in einer Standard Mikrowelle oder durch Verwendung einer Heizplatte) vor dem Aliquotieren von 40 &amp;mgr; l Agarose-Lösung in eine Vertiefung auf einer Platte mit 96 Vertiefungen. </li><li> Inkubieren Platte bei 37 ° C für mindestens 1 Stunde bei der Ernte-Zellen unter Verwendung von Standardtechniken. </li><li> Verwenden eines Hämazytometers, um die Konzentration der Zellen in der Suspension zu bestimmen. </li><li> Verdünnen Zellsuspension auf 1.000 Zellen / ml und 100 ul dieser Verdünnung auf die Vertiefung, die die ausgehärtete Agarose Bett. </li><li> Legen Sie die Probe auf einem Schüttler über Nacht in einem Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2 eingestellt. </li><li> Entfernen Probe von Shaker geben und 100 ul Zellkulturmedien. </li><li> Sphäroiden inkubieren, bis der gewünschte Durchmesser erreicht ist. Zum Beispiel nach 9 Tagen eine spHeroid ungefähr 450 um im Durchmesser sein. Während dieser Zeit kann frisches Wachstumsmedium zu den Vertiefungen gegeben werden, aber Aspiration zu vermeiden, da dies bei der Entfernung des Sphäroids führt. </li></ol> 2. Vorbereitung 3D Tumorsphäroide Eingebettet in ECM <ol><li> Bereiten Sie einen Arbeitsplatz mit benötigten Materialien innerhalb einer Steril. </li><li> Bereiten Sie eine verdünnte Mischung aus Carboxylat-modifizierte 1 um Durchmesser fluoreszierender Tracer-Sonden durch Zugabe von 2 Teillager Sonden (2% Feststoffe) bis 25 Teile sterilem Wasser. </li><li> Entfernen Sie eine Flasche von 3,1 mg / ml Rinderkollagen aus dem Kühlschrank und legen Sie es auf Eis. </li><li> 125 ul Aliquot von Kollagen in ein leeres 2-ml-Ampulle. </li><li> In 50 ul verdünnte Tracer Sonde Lösung für das Fläschchen mit dem Kollagen und kurz vortexen, um Sonden zu verteilen. </li><li> In 235 ul der entsprechenden Zellkulturmedien, die Phenol-Rot (die gelb wird) mit einem Gesamtvolumen von 410 ml und Wirbel kurz bevor 205 ml (die Hälfte des Gesamtvolumens) und es in ein neues 2-ml-Ampulle. Vial 1 die Tumor Sphäroid enthalten und Fläschchen 2 wird eine Steuer Gemisch sein. </li><li> In ~ 2 ul 1 M NaOH auf Vial 1, um die Lösung wieder auf neutralen pH-Wert (Kulturmedien Phenolrot enthält, sollte auf rot zurück) zu bringen. Beachten Sie, dass dies bewirkt, dass die Mischung der Aushärtung, wenn sie nicht auf Eis gehalten, um zu beginnen. Vortex kurz zu mischen, dann auf Eis Rack sofort zurück. HINWEIS: Das Sphäroid ist kaum sichtbar, die mit bloßem Auge nach 9 Tagen der Kultur und ihrer Entfernung aus dem Agarose-Bett ist eine heikle Aufgabe. Verwendung eines Dissektionsmikroskop kann hilfreich für einige Nutzer. Die Aufrechterhaltung der Integrität der Sphäroid während der Übertragung ist von größter Bedeutung. </li><li> Mit einem breit-Mund-Pipettenspitze, entfernen 40 ul Medium aus dem Brunnen, die das Tumor Sphäroid. Bewahren Sie diese 40 ul bei der Durchführung der nächste Schritt. </li><li> Überprüfen Sie das gut zu sehen, wenn das Sphäroidwurde im vorherigen Schritt entfernt. Wenn ja, fügen Sie die 40 ul, die das Sphäroid zu Vial ein. Falls nicht, legen Sie die 40 ul zurück in den Brunnen, und wiederholen Sie den vorherigen Schritt. </li><li> Rühren Sie leicht Vial 1 (nicht Gefahr, Vortex, kann es die Sphäroid beschädigen) vor der Übertragung der Mischung in 60 ul-Portionen in drei separaten Wells einer 96-Well-Platte. Überprüfen Sie jede Vertiefung mit einem Mikroskop nach Zugabe Mischung zu bestimmen, welche auch enthält das Sphäroid. </li><li> In ~ 2 ul 1 M NaOH und 40 ul Zellkulturmedien zu Vial 2 und Wirbel vor Aliquotierung 60 ul dieser Mischung in einen leeren Brunnen in der 96-Well-Platte und Kennzeichnung als Kontrolle. </li><li> Die Platte wird in einem 37 ° C-Inkubator für mindestens 1 Stunde aushärten. </li></ol> 3. Construct Grid von Probe-Punkte und Nehmen Sie ein Video an jedem Punkt <ol><li> Übertragen Sie die Probenplatte aus dem Inkubator auf dem Mikroskoptisch. Erlauben 10 min, bis die Probe Equilibrate mit der Raumtemperatur, wenn ein beheiztes Bühne ist nicht verfügbar. </li><li> Beachten Sie die Probe mit schwacher Stromversorgung Objektive um sicherzustellen, dass sie intakt und bereit für die Bildgebung ist. Ermitteln Sie die Position innerhalb der Tumor gut. </li><li> Entscheiden Sie, wie viele Punkte, um Probe zu nehmen. Typischerweise werden 20 Proben in jeder Vertiefung, in konzentrischen Ringen um das Sphäroid verteilt ausreichend detaillierte Ergebnisse zu produzieren. </li><li> Bewegen Sie die Bühne, um jede gewünschte Position und verwenden Mikroskop Schnittstellen-Software, um die x-und y-Koordinaten (oder Aufnahme-Koordinaten manuell, wenn Schnittstellen-Software nicht erreichbar ist) aufzeichnen. </li><li> Schalten Sie das Mikroskop zu einem Hochleistungs-Objektiv (typischerweise 100X), und wählen Sie die entsprechende Filterwürfel für die Anregungswellenlänge der Tracer-Sonden. Verwenden Sie die Liste der Punkte in Schritt 3.4 erstellt, um auf den ersten Punkt im Netz zu bewegen. </li><li> Stellen Sie den Fokus auf den Boden des gut finden, dann nach oben, um ein Sichtfeld (FOV) mit mehreren In-Fokus-trac findenäh Sonden. </li><li> Beachten Sie die Intensität Histogramm die Belichtung eingestellt und Intensität und Zeit, um den größten Dynamikbereich möglich zu geben, während sichergestellt wird, dass das Bild nicht gesättigt zu werden. </li><li> Besorgen Sie sich eine Videosequenz mit einer Bildrate von 20 bis 30 ms pro Bild (ca. 800 Frames oder 16-24 Sekunden lang wird empfohlen, um eine ausreichende Statistik für robuste MSD Berechnung mit der Notwendigkeit zur Minimierung der Messzeit an jedem Raumgitterpunkt ausgeglichen Verfügung stellen) und sparen Sie mit einer entsprechenden Konvention. Während der Aufnahme nicht berühren das Mikroskop oder Tisch. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,6-3,9 für jeden Probenpunkt im Netz. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,3-3,10 für jeden auch im Experiment. </li></ol> 4. Analysieren Video Data zu rheologischen Eigenschaften bei jedem Abtastpunkt Berechnen <ol><li> Kopieren aller Videodaten auf einer Analyse Ordner (möglicherweise auf einem anderen Computer). </li><li> Import von Bilddaten in MATLAB oder andere Analyse-Software. NOTE: Umfangreiche Dokumentation über die Reihe von MATLAB hier angenommen Partikelverfolgung Routinen ist verfügbar <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil</a> . Die Verwendung eines kundenspezifischen aufrufenden Funktion für die Automatisierung Verarbeitung mehrerer Dateien an verschiedenen Positionen empfohlen. </li><li> Kalibrieren der Software durch die Analyse mehrere Frames des Videos und Ablehnung Parameter (Größe, Bandpass-, usw.) für das Identifizieren der Sonde Mittelpositionen entsprechend zu bestimmen. Umfangreiche Hintergrund für diese entscheidenden Schritte wird von Crocker und Grier beschrieben. </li><li> Verwenden Sie die Software, um jedes Sondenposition für alle Video-Frames automatisch zu ermitteln und verknüpfen diese Positionen in Bahnen. </li><li> Verwenden Sie die Bahndaten, die mittlere quadratische Verschiebung (MSD) als Funktion der Verzögerungszeit zu berechnen, wobei Sie auf die entsprechende Raumkalibrierungsfaktor (um pro Pixel) für die spezifische Objektiv, jeder Pixel-Binning, etc. gelten (in der Regel durchgeführtin Meta-Daten). </li><li> Berechnen G * (mit der verallgemeinerten Stokes-Einstein-Beziehung berücksichtigt die Grenzen der Anwendbarkeit von GSER für eine bestimmte Probe 24,28,43. Alternativ können Benutzer möchten ECM Eigenschaften direkt von MSD durch einen einfachen Vergleich Potenzgesetz Skalierung, Hochebene zu interpretieren Werte, Indices Heterogenität oder andere Parameter. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4.2 bis 4.6 für jede SFZ im Experiment. </li><li> Zusammen registrieren Positionsdaten aus Schritt 3.4 mit viskoelastischen Moduli bei einer bestimmten Frequenz von Interesse. Je nach Hersteller des Mikroskops verwendet wird, kann dieser Schritt durch eine benutzerdefinierte Routine, die Mikroskop Metadaten oder Positionsdaten können manuell tabellieren liest erleichtert werden. </li><li> Verwenden Sie 3D-Interpolation Funktionen, um eine räumliche Karte Rheologie der ECM zu generieren. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

In diesem Protokoll führen wir eine robuste und breit anwendbare Strategie für längs Tracking lokale Änderungen in ECM Steifigkeit in 3D-Tumormodellen. Wir stellen uns vor, dass diese Methodik könnte durch Krebs Biologen und Biophysiker interessiert mechanosensitive Verhalten in Matrixumbau bei Tumorwachstum und Invasion Prozesse verwickelt angenommen werden. Präzise Quantifizierung der Matrix Abbaukinetik kann besonders für diejenigen, die Untersuchung der Aktivität von Matrix-Metalloproteasen, Lysyloxidase ode...

Es ist klar, von einer wachsenden Zahl von Hinweisen in der Literatur, dass Krebszellen, wie bei nicht-malignen Säuger Epithelzellen, reagieren sehr sensibel auf die mechanischen und biophysikalischen Eigenschaften der umgebenden extrazellulären Matrix (ECM) und andere Mikrokomponenten 9.1. Elegante mechanistische Studien Einblicke in die Rolle der extrazellulären Steifigkeit als eine komplexe Signal mechanosensitive Partner, der malignen Wachstumsverhalten und Morphogenese 2,3,10,11 reguliert ist. Diese Arbeit wurde insbesondere durch die Entwicklung von 3D in vitro-Tumormodellen, die biologisch relevante wiederherzustellen Gewebearchitektur und können in Trägermaterialien mit maßgeschneiderten Mechanik angebaut und durch optische Mikroskopie 12-19 abgebildet werden erleichtert. Jedoch ist die andere Seite dieser mechanoregulatory Dialog zwischen Tumor und Mikroumgebung, durch die Krebszellen wiederum Veränderung der Fließeigenschaften ihrer Umgebung bleibt etwasschwieriger zu studieren. Zum Beispiel während der Invasion Prozesse, die Zellen am Rande eines Tumors kann epitheliale mesenchymale Transition (EMT) zu unterziehen und erhöhen die Expression von Matrix-Metalloproteasen (MMPs), die lokalen Abbau von ECM 20-22, die wiederum Einfluss auf mechanosensitive Wachstumsverhalten führen andere proximalen Tumorzellen. Durch eine Vielzahl von biochemischen Prozessen, die Krebszellen die lokale Steifigkeit ihrer Umgebung wählen ständig auf und ab, um verschiedene Prozesse zu unterschiedlichen Zeiten anpassen. Die hier beschriebene Methode ist durch die Notwendigkeit für analytische Werkzeuge, die lokale Veränderungen in der Steifigkeit und Nachgiebigkeit der ECM während des Wachstums, die mit 3D-Tumormodellen integriert ist und in Längsrichtung mit biochemischen und phänotypische Veränderungen korreliert ohne Beendigung der Kultur werden kann berichten motiviert. Auf der Suche nach einem geeigneten Verfahren in diesem Kontext zu implementieren, tritt Partikelverfolgungs Mikrorheologie (PTM) als starke Kandidaten.Diese Methode, die ursprünglich von Pionier Mason und Weitz 23,24 nutzt die Bewegung der Tracer-Sonden in einem komplexen Fluid eingebettet sind, um die frequenzabhängige komplexe viskoelastische Schermodul G * (ω) in Mikron Längenskalen zu melden. Dieser allgemeine Ansatz wurde mit mehreren Varianten für unterschiedliche Anwendungen in weichen kondensierten Materie, Kolloide, Biophysik und Polymerphysik 25-31 geeignet entwickelt. PTM hat gewisse Vorteile gegenüber anderen Methoden, da die Messwerte von lokalen Viskoelastizität durch zerstörungsfreie Videoabbildungs ​​biochemisch inaktive Tracer-Sonden, die zum Zeitpunkt der Kulturansatz aufgenommen werden und bleiben an Ort und Stelle über einen längeren Zeitraum des Wachstums bereitgestellt. Dies steht im Gegensatz zu Gold Standardmessungen mit einer oszillierenden Schergroß Rheometer, was notwendigerweise erfordert Beendigung der Kultur und meldet den Groß makroskopischen Rheologie der Probe statt Punktmessungen innerhalb der komplexen 3D Tumor microenvironment. In der Tat eine Reihe von Studien haben den Nutzen der Interpretation von Messungen der Sonde Tracer Bewegungen in oder rund um Krebs oder Nicht-Krebs-Zellen, um Verformungen der Zellmigration 32, mechanische Beanspruchung von einem expandierenden Sphäroid 33, intrazelluläre Rheologie 34,35 induziert zu bemessen dargestellt und mechanische Spannungen und Dehnungen in Geweben entwickelt 36, und die Beziehung zwischen Porengröße und Invasion Geschwindigkeit 37 zuzuordnen. Andere Techniken für Mikrorheologie wie Rasterkraftmikroskopie (AFM) implementiert werden kann, sondern in erster Linie zur Untersuchung von Punkten auf der Oberfläche der Probe und kann auch Kultur Sterilität, die Längs Messungen erschweren 38 darstellen. Hier ein umfassendes Protokoll umfasst Methoden für das Wachstum der 3D Tumorsphäroide geeignet für den Transfer in ECM mit eingebetteten Fluoreszenzsonden für Video-Partikel-Tracking-und Analyse-Methoden für die zuverlässige Abbildung räumlicher beschreiben wirVeränderungen im Laufe der Zeit Mikrorheologie in der Kultur. In der vorliegenden Implementierung werden 3D-Tumormodellen in Multiwell-Format mit Blick auf Einbau von Mikrorheologie Messungen mit anderen traditionellen Tests (zB Zytotoxizität), die dieses Format ist förderlich für gewachsen. In dieser repräsentativen Darstellung dieser Methodik wir Kultur in vitro 3D-Sphäroiden mit PANC-1-Zellen, eine etablierte Pankreaskrebszelllinie bekannt, Sphäroiden 39, sondern alle hier beschriebenen Messungen bilden, sind breit anwendbar zu studieren, von soliden Tumoren mit einer Vielzahl von Zelllinien geeignet für 3D-Kultur. Da diese Methode von Natur-basierte Bildgebung ist es ideal für Co-Registrierung von hochauflösenden Mikrorheologie Daten mit großen Durchlicht-Sichtfelder, die Veränderungen in der Zellwachstum, Migration und Phänotyp berichten geeignet. Die Umsetzung der PTM integrierten Durchlichtmikroskopie auf diese Weise davon ausgegangen, reproduzierbare Positionierung der Mikroskoptisch whICH ist auf motorisierte kommerzielle Weitfeld-Epifluoreszenz biologische Mikroskope der Regel zur Verfügung. Die folgende entwickeltes Protokoll kann mit jedem vernünftig ausgestattet automatisierten Fluoreszenzmikroskop biologischen umgesetzt werden. Dies ist ein von Natur aus datenintensive Methode, die Übernahme von Gigabyte an digitalen Videomikroskopie für die Offline-Verarbeitung erfordert. In dem folgenden Protokoll, Protokoll 1 bezieht sich auf die anfängliche Herstellung von Tumor-Spheroide, die hier mit Überlagerung auf Agarose beschrieben, konnte aber mit einer Vielzahl von anderen Methoden, wie hängenden Tropfen 40 oder Rotationskultur 41 Techniken ersetzt werden. Protokoll 2 beschreibt den Prozess der Einbettung Sphäroiden in einer Kollagengerüst, obwohl alternativ könnte in vitro 3D Tumoren durch Einkapselung oder Einbettung von resuspendierten Zellen in ECM 12,15, anstatt einzelne vorgeformte nichthaft Sphäroide gezüchtet werden. Nachfolgende Protokolle beschreiben Verfahren zur obtaining zeitaufgelöste Messungen Mikrorheologie durch Erfassen und Verarbeiten von Videomikroskopiedaten. Die Datenverarbeitung wird mit MATLAB, die Nutzung von Open-Source-Routinen für PTM auf Algorithmen ursprünglich von Crocker und Grier 42, die auch ausgiebig für verschiedene Software-Plattformen entwickelt, gebaut beschrieben (siehe http://www.physics.emory.edu/ beschrieben ~ Wochen / IDL /).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="779">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:177px;">Bovine type 1 collagen</td>
			<td style="width:235px;">BD Biosciences, San Jose, California</td>
			<td style="width:100px;">354231</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PANC-1</td>
			<td>American Type Cell Culture, Manassas, VA</td>
			<td>CRL1469</td>
			<td>or other appropriate cell type</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent Microspheres</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, California</td>
			<td>906906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences, Bedford MA</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>C12H18O9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>NC0480985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Imaging plates</td>
			<td>Corning Inc., Corning, NY</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Hyclone, Waltham, MA</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>or appropriate&#160; cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Zeiss AxioObsever Microscope</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>includes high-speed camera and imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MATLAB software</td>
			<td>The Mathworks, Natick, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal measurement of extracellular matrix rigidity in 3d tumor models using particle-tracking microrheology

Die mechanische Mikro wurde gezeigt, als entscheidender Regulator der Tumorwachstumsverhalten und die Signalisierung, die selbst umgebaut wird und als Teil eines Satzes von komplexen, zwei-Wege mechanosensitive Wechselwirkungen modifiziert handeln. Während die Entwicklung von biologisch relevanten 3D-Tumormodellen haben mechanistische Studien über die Auswirkungen der Matrix Rheologie auf das Tumorwachstum erleichtert die inverse Problem der Zuordnung Veränderungen in der mechanischen Umgebung von Tumoren induziert bleibt eine Herausforderung. Hier beschreiben wir die Umsetzung der Partikel-Tracking Mikrorheologie (PTM) in Verbindung mit 3D-Modellen von Bauchspeicheldrüsenkrebs als Teil eines robusten und brauchbarer Ansatz zur Längs Überwachung physikalischer Veränderungen in der Tumor-Mikroumgebung, in situ. Die hier beschriebene Methodik integriert ein System zur Herstellung von 3D-Modellen in vitro in einem Modell der extrazellulären Matrix (ECM) Gerüst aus Typ I-Kollagen eingebettet mit fluoreszenzmarkierten Sonden für gleichmäßig verteilte position-und zeitabhängigen Messungen Mikrorheologie gesamten Probe. In vitro Tumoren werden plattiert und parallel Bedingungen mit Multiwellfolien untersucht. Gestützt auf etablierte Verfahren, sind Videos von Tracer-Sonde Bewegungen über das Generalized Stokes Einstein Beziehung (GSER), um die komplexen frequenzabhängigen viskoelastischen Schermodul G * (ω) berichten umgewandelt. Da dieser Ansatz Imaging-basierte, wird die mechanische Charakterisierung auch auf große Durchlichtraum Feldern zugeordnet, gleichzeitig berichten qualitative Veränderungen in 3D Tumorgröße und Phänotyp. Repräsentative Ergebnisse zeigen, kontras mechanische Reaktion in Teilbereichen mit lokalisierten Invasion-induzierte Matrixabbau sowie System-Kalibrierung, Validierung werden Daten vorgestellt. Unerwünschte Ergebnisse aus gemeinsamen experimentelle Fehler und Problemlösungen dieser Fragen werden ebenfalls vorgestellt. Die 96-Well-Format 3D-Beschichtung Kultur in diesem Protokoll implementiert ist, ist conducive zu Korrelation von Mikrorheologie Messungen mit therapeutischen Screening-Tests oder der molekularen Bildgebung, neue Einblicke in die Auswirkungen der Behandlungen oder biochemische Reize auf die mechanische Mikroumgebung zu gewinnen.

Um die Gültigkeit von G * (ω)-Messungen an lokalisierten Positionen in einem komplexen Modell Tumor-Mikroumgebung zu verifizieren, wurden zwei erste Validierungsexperimente durchgeführt. Zuerst haben wir versucht, unsere Messungen gegen den &quot;Goldstandard&quot; der Groß oszillierende Scher rheometry validieren. Wir stellten identische Proben von Kollagenmatrix (ohne Zellen) in einer Konzentration von 1,0 mg / ml Kollagen. Diese Proben wurden mit einer Schütt Rheometers (TA Instruments AR-G2, unter Verw...

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Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Partikel-Tracking Mikrorheologie können zerstörungs quantifizieren und räumlich zuordnen Veränderungen in der extrazellulären Matrix mechanische Eigenschaften im 3D-Tumormodelle verwendet werden.

Längs Messung der extrazellulären Matrix Steifigkeit in 3D Tumormodelle mit Particle-Tracking Mikrorheologie

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

longitudinal-measurement-extracellular-matrix-rigidity-3d-tumor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.4K Aufrufe.  University of Massachusetts Boston.  Partikel-Tracking Mikrorheologie können zerstörungs quantifizieren und räumlich zuordnen Veränderungen in der extrazellulären Matrix mechanische Eigenschaften im 3D-Tumormodelle verwendet werden. 

Serie: Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Berührungslose, Label-freie Überwachung von Zellen und extrazellulären Matrix mittels Raman-Spektroskopie

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Forschung

Biotechnik

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Microtubules are cytoskeletal polymers which play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires microtubules that are stiff and straight enough to span a significant fraction of the cell diameter. As a result, the microtubule persistence length, a measure of stiffness, has been actively studied for the past two decades1. Nonetheless, open questions remain: short microtubules are 10-50 times less stiff than long microtubules2-4, and even long microtubules have measured persistence lengths which vary by an order of magnitude5-9.
	Here, we present a method to measure microtubule persistence length. The method is based on a kinesin-driven microtubule gliding assay10. By combining sparse fluorescent labeling of individual microtubules with single particle tracking of individual fluorophores attached to the microtubule, the gliding trajectories of single microtubules are tracked with nanometer-level precision. The persistence length of the trajectories is the same as the persistence length of the microtubule under the conditions used11. An automated tracking routine is used to create microtubule trajectories from fluorophores attached to individual microtubules, and the persistence length of this trajectory is calculated using routines written in IDL.
	This technique is rapidly implementable, and capable of measuring the persistence length of 100 microtubules in one day of experimentation. The method can be extended to measure persistence length under a variety of conditions, including persistence length as a function of length along microtubules. Moreover, the analysis routines used can be extended to myosin-based acting gliding assays, to measure the persistence length of actin filaments as well.

A method to measure the persistence length or flexural rigidity of biopolymers is described. The method uses a kinesin-driven microtubule gliding assay to experimentally determine the persistence length of individual microtubules and is adaptable to actin-based gliding assays.

Biegesteifigkeit Maße von Biopolymeren mit Gliding Assays

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

In-situ-Mapping der mechanischen Eigenschaften von Biofilmen durch Partikel-Tracking Mikrorheologie

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

Die Verbesserung der 2D- und 3D-Haut<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellen mithilfe von Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Tunable Hydrogele aus Pulmonary Extrazellulärmatrix für 3D-Zellkultur

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

Ein Protokoll für Echtzeit-3D Einzelkorn-Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

Herstellung einer Niere Cortex extrazelluläre Matrix abgeleitet Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

Pankreasgewebe-abgeleitete extrazelluläre Matrix Bioink für den Druck 3D-Zell-Laden Pankreasgewebe Konstrukte

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

Ein menschliches 3D extrazelluläres Matrix-Adipozyten-Kulturmodell zum Studium der Matrix-Zell Metabolischen Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes and therapeutic responses. Accounting for matrix effects earlier in the drug development pipeline is expected to increase the likelihood of clinical success of novel therapeutics. Biomaterial-based strategies recapitulating specific tissue microenvironments in 3D cell culture exist but integrating these with the 2D culture methods primarily used for drug screening has been challenging. Thus, the protocol presented here details the development of methods for 3D culture within miniaturized biomaterial matrices in a multi-well plate format to facilitate integration with existing drug screening pipelines and conventional assays for cell viability. Since the matrix features critical for preserving clinically relevant phenotypes in cultured cells are expected to be highly tissue- and disease-specific, combinatorial screening of matrix parameters will be necessary to identify appropriate conditions for specific applications. The methods described here use a miniaturized culture format to assess cancer cell responses to orthogonal variation of matrix mechanics and ligand presentation. Specifically, this study demonstrates the use of this platform to investigate the effects of matrix parameters on the responses of patient-derived glioblastoma (GBM) cells to chemotherapy.

The present protocol describes an experimental platform to assess the effects of mechanical and biochemical cues on chemotherapeutic responses of patient-derived glioblastoma cells in 3D matrix-mimetic cultures using a custom-made UV illumination device facilitating high-throughput photocrosslinking of hydrogels with tunable mechanical features.

Hydrogel-Arrays ermöglichen erhöhten Durchsatz für Screening-Effekte von Matrixkomponenten und Therapeutika in 3D-Tumormodellen

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes ...